侯廣杰，何苡，楊光煜

(河南省人民醫(yī)院，鄭州450003)

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PRMT1結(jié)合并增強HMGCR活性對食管鱗癌細胞增殖能力的影響

侯廣杰1，何苡1，楊光煜1

(河南省人民醫(yī)院，鄭州450003)

目的 探討蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1(PRMT1)結(jié)合羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGCR)后活性變化及其對食管鱗癌細胞增殖能力的影響。方法 以食管鱗癌ECA109細胞為模型，通過免疫共沉淀法觀察PRMT1與HMGCR在細胞中的相互結(jié)合作用。將ECA109細胞隨機分為感染組和對照組，分別以表達特異性針對PRMT1的RNA干擾分子的慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h，采用Western blot法分別檢測PRMT1、HMGCR蛋白及甲基化HMGCR蛋白，分光光度法檢測HMGCR酶活性，CCK-8法檢測細胞增殖活性。結(jié)果 細胞裂解后的蛋白共沉淀復合物分別用抗PRMT1、HMGCR抗體捕獲后，可檢測到HMGCR、PRMT1蛋白條帶。感染組和對照組ECA109細胞中PRMT1蛋白相對表達量分別為0.057±0.011和0.239±0.041(P<0.01)，HMGCR蛋白相對表達量分別為0.175±0.031和0.184±0.037(P>0.05)。感染組和對照組 ECA109細胞甲基化HMGCR蛋白相對表達量分別為0.028±0.006、0.107±0.016，HMGCR相對活性分別為0.104±0.009、0.277±0.013，P均<0.01。感染組ECA109細胞培養(yǎng)24 h后，細胞增殖的OD450值已低于對照組(P<0.05)；培養(yǎng)48 h及72 h后，兩組OD450值差距進一步擴大(P均<0.01)。結(jié)論 PRMT1可通過結(jié)合HMGCR蛋白促進其甲基化途徑增強HMGCR蛋白活性，進而促進食管鱗癌細胞的體外增殖能力。

食管鱗癌；蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1；羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶；細胞增殖

精氨酸甲基化是一種常見的蛋白翻譯后修飾過程，在蛋白的活性調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用。蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1(PRMT1)作為一種重要的精氨酸甲基化修飾酶，在PRMT家族中催化活性最高，并廣泛參與了細胞的增殖、凋亡、分化及代謝等各種生理過程[1,2]。越來越多的證據(jù)顯示，PRMT1在腫瘤、心血管疾病等多種嚴重威脅人類健康及生命的重大疾病發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要調(diào)控作用[3]。已有報道顯示，PRMT1異常表達與乳腺癌、白血病、膀胱癌、肺癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤以及結(jié)腸癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[3]。Singh等[4]研究發(fā)現(xiàn),PRMT1高表達是食管鱗癌致病的獨立危險因素。后續(xù)的臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)，PRMT1在食管鱗癌組織中的表達水平較對應癌旁組織顯著升高，細胞實驗同樣證實PRMT1具有促進食管鱗癌細胞的增殖、遷移、侵襲以及轉(zhuǎn)移致瘤的作用[5,6]。但迄今為止，對PRMT1調(diào)控食管鱗癌細胞生物學活性的具體分子機制仍不明確。2013年6月～2015年5月，我們采用免疫共沉淀檢測PRMT1與調(diào)控細胞內(nèi)甲羥戊酸途徑的關鍵限速酶羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGCR)的結(jié)合情況，進而觀察PRMT1低表達對HMGCR蛋白表達、甲基化水平、酶活性以及食管鱗癌細胞增殖能力的影響，從而探討PRMT1調(diào)控食管鱗癌細胞增殖的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 食管鱗癌細胞株ECA109購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；DMEM、FBS購自Invitrogen公司；表達特異性針對PRMT1的RNA干擾分子的慢病毒質(zhì)粒由上海和元生物生物技術有限公司構(gòu)建，干擾位點序列為5′-GACTTCACCATCGACCTGGACTTCA-3′；小鼠/兔抗人PRMT1抗體、小鼠/兔抗人HMGCR抗體、小鼠抗甲基化精氨酸抗體以及HRP標記的山羊抗小鼠二抗購自Santa Cruz公司;Protein A瓊脂糖珠購自Amersham公司;PVDF膜購自Millipore公司；HMG-CoA、NADPH購自Sigma公司;CCK-8試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 PRMT1與HMGCR相互作用觀察 采用免疫共沉淀法。常規(guī)胰酶消化法收集1×107個 ECA109細胞，加入1 mL細胞裂解液(50 mmol/L Tris，5 mmol/L EDTA，150 mmol/L NaCl，0.5% NP-40，10 mmol/L PMSF，1 mmol/L DTT，1 mg/mL抑肽酶)裂解細胞；將裂解液于4 ℃下15 000 r/min離心30 min，留取20 μL上清作為Input對照。裂解上清液中加相應1 μg 兔抗人PRMT1或HMGCR抗體，加入預處理的Protein A瓊脂糖珠，4 ℃孵育過夜。隨后4 ℃以3 000 r/min離心3 min，吸棄上清，瓊脂糖珠用1 mL裂解緩沖液漂洗3次；加入20 μL 2×SDS上樣緩沖液，沸水煮5 min后進行12% SDS聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，采用半干轉(zhuǎn)印法將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜。PVDF膜采用5%的脫脂牛奶常溫封閉2 h，加入TBST稀釋相應小鼠抗人單克隆抗體(抗人PRMT1抗體進行共沉淀的樣本加抗人HMGCR抗體、抗人HMGCR抗體進行共沉淀的樣本加抗人PRMT1抗體)，4 ℃孵育過夜，取出后TBST洗膜3次。隨后加入HRP標記山羊抗小鼠二抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，增強型化學發(fā)光顯影。

1.3 細胞培養(yǎng)與慢病毒感染 Eca109細胞采用DMEM(含10%胎牛血清)培養(yǎng)基，于5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的ECA109細胞接種于96孔板，隨機分為感染組和對照組，于細胞融合80%時分別以重組慢病毒質(zhì)粒LV.PRMT1-shRNA、空病毒質(zhì)粒LV.NULL轉(zhuǎn)染48 h。

1.4 PRMT1和HMGCR蛋白檢測 采用Western blot法。常規(guī)胰酶消化法收集兩組細胞，加入細胞裂解液(組成同1.2)裂解細胞；提取細胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒檢測總蛋白濃度。各取20 μg總蛋白進行12% SDS聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，轉(zhuǎn)膜方法同1.2。加入TBST稀釋相應小鼠抗人單克隆抗體(抗人PRMT1、HMGCR及β-actin抗體)，4 ℃孵育過夜，取出后TBST洗膜3次。隨后加入HRP標記山羊抗小鼠二抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，增強型化學發(fā)光顯影。采用圖像分析軟件掃描條帶，以PRMT1及HMGCR蛋白與β-actin光密度(OD)比值表示其相對表達量。

1.5 HMGCR甲基化水平檢測 采用Western blot法。常規(guī)胰酶消化法收集兩組細胞，加入細胞裂解液裂解細胞，于4 ℃下15 000 r/min離心30 min取上清。裂解上清液加相應1 μg兔抗人HMGCR抗體，加入預處理的Protein A瓊脂糖珠，4 ℃孵育過夜。隨后4 ℃下以3 000 r/min離心3 min，小心吸棄上清，瓊脂糖珠用1 mL裂解緩沖液漂洗3次；加入20 μL 2×SDS上樣緩沖液，沸水煮5 min，上樣轉(zhuǎn)膜方法同1.2。加入TBST稀釋小鼠抗甲基化精氨酸抗體，4 ℃孵育過夜，取出后TBST洗膜3次。隨后加入HRP標記山羊抗小鼠二抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，增強型化學發(fā)光顯影。采用圖像分析軟件進行條帶光密度掃描，以甲基化HMGCR蛋白與β-actin光密度比值表示的HMGCR蛋白甲基化程度。

1.6 HMGCR酶活性觀察 采用分光光度法。常規(guī)胰酶消化法收集細胞，加入細胞裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒檢測總蛋白濃度。取細胞裂解液20 μL，加入180 μL反應液(100 mmol/L KCl，100 mmol/L KH2PO4，1 mmol/L EDTA，0.5 mmol/L 巰基乙醇，1 mmol/L HMG-CoA，1 mmol/L NADPH)，25 ℃孵育1 min及5 min；采用圖像分析軟件檢測OD340值，按照公式計算HMGCR相對活性。E=ΔOD340/Δt。

1.7 細胞增殖情況觀察 采用CCK-8法。取兩組細胞，以5×102/孔接種96孔板。培養(yǎng)0、24、48、72 h后，每孔加入CCK-8反應液10 μL，37 ℃孵育1 h，采用圖像分析軟件檢測OD450值，以其表示細胞增殖情況。

2 結(jié)果

2.1 ECA109細胞中PRMT1與HMGCR蛋白的相互作用 結(jié)果顯示，細胞裂解后的蛋白共沉淀復合物用抗PRMT1抗體捕獲后，可檢測到HMGCR蛋白條帶；同樣，細胞裂解后的蛋白共沉淀復合物用抗HMGCR抗體捕獲后，可檢測到PRMT1蛋白條帶。這表明PRMT1與HMGCR在ECA109細胞內(nèi)相互結(jié)合。

2.2 抑制PRMT1表達對ECA109細胞PRMT1、HMGCR蛋白表達的影響 感染組和對照組ECA109細胞中PRMT1蛋白相對表達量分別為0.057±0.011和0.239±0.041(P<0.01)，感染組HMGCR蛋白表達水平降至對照組的23.8%。感染組和對照組ECA109細胞中HMGCR蛋白相對表達量分別為0.175±0.031和0.184±0.037，兩組間HMGCR蛋白表達水平無統(tǒng)計學差異。

2.3 抑制PRMT1表達對ECA109細胞HMGCR甲基化水平及酶活性的影響 感染組和對照組 ECA109細胞甲基化HMGCR蛋白相對表達量分別為0.028±0.006和0.107±0.016，感染組HMGCR蛋白甲基化水平低于對照組(P<0.01)。感染組、對照組ECA109細胞HMGCR相對活性分別為0.104±0.009、0.277±0.013，感染組HMGCR相對活性低于對照組(P<0.01)。

2.4 抑制PRMT1表達對ECA109細胞增殖活性的影響 感染組ECA109細胞培養(yǎng)24 h后，細胞增殖活性已低于對照組(P<0.05)，培養(yǎng)48 h及72 h后，兩組差異進一步擴大(P均<0.01)。見表1。

表1 兩組ECA109細胞增殖的OD450值比較

注：與對照組同時點比較，*P<0.05，#P<0.01。

3 討論

蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄后修飾是生物體內(nèi)普遍存在的現(xiàn)象，包括磷酸化、乙酰化、泛素化等多種蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后修飾方式[7]。蛋白質(zhì)的甲基化是一種重要的真核細胞翻譯后修飾，參與了細胞信號轉(zhuǎn)導、RNA加工和運輸、DNA轉(zhuǎn)錄、蛋白之間的相互作用等生物學事件[1,2]。蛋白甲基化的對象主要為賴氨酸和精氨酸殘基，關于賴氨酸甲基化的研究開展的較早，近年來針對精氨酸甲基化的研究正在逐步深入[1,2]。

催化精氨酸甲基化的酶稱為PRMT，它們以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，可以催化轉(zhuǎn)運1～2個甲基基團到目的蛋白精氨酸殘基的胍基氮分子。根據(jù)其產(chǎn)物的不同，PRMT可分為4種類型。PRMT1基因位于染色體19q13.3上，是PRMT家族中Ⅰ型成員[1,2]。PRMT1識別靶蛋白中特定的短肽序列(RHR、RVR、RGG、GAR、GRG等)，并催化其中的精氨酸殘基發(fā)生甲基化[8～11]。PRMT1作為一種重要的蛋白甲基化修飾酶，在PRMT家族中催化活性最高，并廣泛參與細胞的增殖、凋亡、分化及代謝等各種生理過程[1,2]。Yu等[12]發(fā)現(xiàn)，敲除PRMT1基因后小鼠胚胎發(fā)育約6.5 d時即死亡，提示PRMT1在哺乳動物發(fā)育過程中發(fā)揮著不可替代的重要作用。近期，有關PRMT1調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的研究取得了令人鼓舞的進展。大量研究發(fā)現(xiàn)，PRMT1在乳腺癌、膀胱癌、肺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤組織中高表達，且PRMT1表達水平與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移過程密切相關[3]。

近來，Singh等[4]發(fā)現(xiàn)PRMT1高表達是食管鱗癌致病的獨立風險因素，Zhou等[5,6]發(fā)現(xiàn)PRMT1在食管鱗癌組織中的表達水平顯著升高，后續(xù)的細胞和動物模型實驗證實了PRMT1具有促進食管鱗癌細胞增殖遷移以及致瘤的作用。在本研究中，我們通過慢病毒介導的RNA干擾質(zhì)粒抑制食管鱗癌細胞中PRMT1表達，發(fā)現(xiàn)抑制PRMT1表達可顯著下調(diào)食管鱗癌細胞的增殖活性，該結(jié)果同樣提示PRMT1在食管鱗癌細胞增殖調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用。

為了更深入地了解PRMT1調(diào)控食管鱗癌細胞增殖的分子機制，我們對可能與調(diào)控食管鱗癌細胞增殖相關的PRMT1潛在靶基因進行了初步的篩選。免疫共沉淀結(jié)果顯示，HMGCR在食管鱗癌細胞中與PRMT1相互結(jié)合。HMGCR是一種以NAD+或NADP+為受體、作用于供體CH-OH基團上的氧化還原酶[13]。研究證實，HMGCR是細胞內(nèi)甲羥戊酸代謝途徑中的限速酶[13]，被廣泛作為降膽固醇藥的作用靶點，用于抑制細胞內(nèi)甲羥戊酸途徑的活性。近年來，大量的研究顯示，腫瘤細胞內(nèi)甲羥戊酸途徑的代謝水平較正常細胞顯著增強[14]。此外，體外細胞學實驗研究顯示，上調(diào)甲羥戊酸途徑代謝水平可增強腫瘤細胞的增殖能力；反之，抑制甲羥戊酸途徑代謝水平則可抑制腫瘤細胞增殖能力[15,16]。據(jù)此業(yè)內(nèi)專家廣泛認為，甲羥戊酸途徑的激活是促進腫瘤細胞增殖的重要因素。鑒于上述原因，近年來有學者提出了通過抑制胞內(nèi)HMGCR活性以遏制腫瘤生長的設想并進行了初步的探索[14,17]。鑒于現(xiàn)有常見的HMGCR抑制劑如他汀類藥物靶向性差[14]并可導致嚴重不良反應[18]等不足，因此探索調(diào)控胞內(nèi)HMGCR表達及活性的分子機制并開展相應的生物靶向性治療成為該領域的研究熱點之一。

在本研究中，我們抑制食管鱗癌細胞PRMT1表達后發(fā)現(xiàn)HMGCR蛋白表達水平未發(fā)生顯著變化。但值得注意的是，抑制PRMT1表達可導致胞內(nèi)HMGCR甲基化水平顯著降低，同時HMGCR酶活性顯著下降。鑒于我們發(fā)現(xiàn)PRMT1與HMGCR在食管鱗癌細胞內(nèi)能夠相互結(jié)合，因此我們認為PRMT1結(jié)合HMGCR后可對HMGCR進行甲基化修飾，進而增強其酶活性。初步的序列分析結(jié)果顯示，人HMGCR蛋白701～703位點存在GRG序列，且該部分序列在哺乳動物中保守，提示702位精氨酸殘基是PRMT1催化HMGCR甲基化的一個潛在位點。在后續(xù)實驗中我們將對此進行驗證，以期進一步明確PRMT1通過催化HMGCR甲基化調(diào)控其酶活性，進而調(diào)控食管鱗癌細胞增殖活性的具體分子機制，從而為食管鱗癌的基因治療提供新的靶點。

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Effects of PRMT1 interacting with HMGCR and regulating its activity on proliferative capacity of esophageal squamous cell carcinoma cells

HOUGuangjie1,HEYi,YANGGuangyu

(1HenanProvincePeople'sHospital,Zhengzhou450003,China)

Objective To investigate the effect of protein arginie methyltransferase 1 (PRMT1) interacting with HMG-CoA reductase (HMGCR) and regulating its activity on the proliferation of esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) cells. Methods Human esophageal cancer ECA109 cells were chosen as the cell models. The interaction between PRMT1 and HMGCR was detected by co-immunoprecipitation. ECA109 cells were randomly divided into two groups: the infection group and the control group. ECA109 cells were infected with lentivirus expressing small hairpin RNA of HMGCR for 48 h. Then, the relative expression level of PRMT1, total and methylated HMGCR protein was detected by Western blotting. The relative activity of HMGCR was detected by ultraviolet spectrophotometry. Cell proliferation was detected by CCK-8 assay. Results In the infection group and control group, the protein expression of PRMT1 in ECA109 cells of was 0.057±0.011 and 0.239±0.041, respectively (P<0.01), and the protein expression of HMGCR was 0.175±0.031 and 0.184±0.037 (P>0.05). In ECA109 cells of the infection group and control group, the protein expression of methylated HMGCR was 0.028±0.006 and 0.107±0.016, and the relative activity was 0.104±0.009 and 0.277±0.013, respectively, (allP<0.01). The OD45of ECA109 cells after 24-hour culture in the infection group was significantly lower than that of control group (P<0.05), and after 48 h and 72 h, the difference between these two groups further expanded (allP<0.01).Conclusion PRMT1 increases the proliferative capacity of ESCC cells by interacting with HMGCR and regulating its activity.

esophageal squamous carcinoma; protein arginie methyltransferase 1; HMG-CoA reductase; cell proliferation

河南省科技攻關計劃項目(122102310618)。

侯廣杰(1973-)，博士，副主任醫(yī)師，主要研究方向為腫瘤的微創(chuàng)治療。E-mail: guangjiehou@hotmail.com

簡介：楊光煜(1964-)，男，主任醫(yī)師，主要研究方向為食管癌的精準治療。E-mail: hnsyygy@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.38.006

R735.1

A

1002-266X(2016)38-0019-04

2016-07-12)