王林梅，劉劍波 ，邵潤霞 ，齊景憲，尚學(xué)琴

(1鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，鄭州450014；2昆明市第二人民醫(yī)院)

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鹽酸埃克替尼對非小細胞肺癌細胞增殖、凋亡的影響及其機制探討

王林梅1，劉劍波1，邵潤霞1，齊景憲1，尚學(xué)琴2

(1鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，鄭州450014；2昆明市第二人民醫(yī)院)

目的 觀察鹽酸埃克替尼對非小細胞肺癌PC-9細胞增殖、凋亡的影響，并探討其機制。方法 取對數(shù)生長期的PC-9細胞，以40 μmol/L鹽酸?？颂婺崤囵B(yǎng)0、2、4、8、12、24 h，以0、20、40、60、80 μmol/L的鹽酸埃克替尼處理12 h，采用MTT 法檢測細胞增殖活性；將對數(shù)生長期的PC-9細胞分為給藥組和對照組，分別以40 μmol/L鹽酸?？颂婺帷MSO處理8 h，用流式細胞儀檢測凋亡細胞并計算凋亡率，Western blot法檢測JAK2、p-JAK2、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與激活因子3(STAT3)、p-STAT3和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)蛋白，細胞免疫熒光技術(shù)觀察并計算STAT3入核細胞百分率。結(jié)果 隨著鹽酸?？颂婺釢舛鹊脑黾蛹白饔脮r間的延長，PC-9細胞增殖活性逐漸降低，40、60、80 μmol/L與0 μmol/L比較，8、12、24 h與0 h比較，P均<0.05。給藥組PC-9細胞凋亡率3.70%±0.39%，明顯高于對照組的1.40%±0.21%，P<0.05。與對照組比較，給藥組p-JAK2、p-STAT3相對表達量均減少(P均<0.05)，VEGF蛋白相對表達量亦減少(P<0.01)。給藥組STAT3入核細胞百分率為36.48%±2.12%，低于對照組的86.56%±1.82%(P<0.01)。結(jié)論 鹽酸?？颂婺峥梢种品切〖毎伟┘毎鲋常龠M細胞凋亡；其可能通過抑制JAK2-STAT3信號通路活性及STAT3入核，并下調(diào)VEGF蛋白表達發(fā)揮作用。

非小細胞肺癌；PC-9細胞；鹽酸?？颂婺?；細胞增殖；細胞凋亡；信號通路；血管內(nèi)皮生長因子

隨著環(huán)境污染的加重，肺癌成為世界范圍的一個主要致命性癌癥，特別是非小細胞肺癌(NSCLC)，其5年存活率極低[1]。由于放療的不良反應(yīng)[2]，目前NSCLC患者主要以藥物作為一線治療方案[3, 4]。體外研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸?？颂婺峥梢种迫四[瘤細胞系的生長，尤其是對表皮生長因子受體(EGFR) 高表達的細胞[5]。在上皮細胞性腫瘤如肺癌中EGFR多呈高表達[6，7]，因此EGFR通常作為NSCLC的有效治療靶點。鹽酸?？颂婺嶙鳛槲覈耆灾鳟a(chǎn)權(quán)的一種選擇性EGFR酪氨酸激酶抑制劑，已經(jīng)順利通過藥代動力學(xué)以及Ⅰ期臨床試驗，但對其治療機制目前尚不清楚[8～11]。

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與激活因子3(STAT3)通常作為一個轉(zhuǎn)錄因子促進細胞的增殖以及血管增生，抑制細胞凋亡[12]。在腫瘤組織如胃癌、肺癌以及乳腺癌中，STAT3高表達最終促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[13, 14]。因此，STAT3多作為判斷腫瘤預(yù)后的指標[15，16]。上游激酶JAK 磷酸化可激活STAT3并使其進入細胞核，從而促進腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。因此，JAK2-STAT3信號通路常作為腫瘤藥物治療的靶分子。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是誘導(dǎo)腫瘤血管形成作用最強、特異性最高的血管生長因子，在腫瘤的生成及侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。2014年6月～2015年12月，我們觀察了鹽酸?？颂婺釋SCLC細胞增殖、凋亡的影響，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 NSCLC細胞株P(guān)C-9細胞購自中科院上海細胞庫，鹽酸?？颂婺豳徸哉憬愡_藥業(yè)有限公司；胎牛血清(Gibco公司)，DMEM培養(yǎng)基(Thermo公司)；四甲基偶氮唑鹽(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司；PVDF膜(Millipore公司)，JAK2抗體、p-JAK2抗體、STAT3抗體、p-STAT3抗體和VEGF抗體購自上海銀海圣生物科技有限公司；增強化學(xué)發(fā)光試劑盒(Pierce公司)；AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(上海銀海圣生物科技有限公司)；微量移液器(Eppendorf公司)，垂直電泳槽(Bio-Rad公司)，水平搖床(華利達實驗設(shè)備公司)，冷凍式離心機(Eppendorf公司)；PCR儀(Bio-Rad公司)，實時熒光定量PCR系統(tǒng)ABI7500(Applied Biosystems公司)；細胞培養(yǎng)超凈臺和細胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific公司)，倒置顯微鏡(Olympus公司)，激光掃描共聚焦顯微鏡(Nikon公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 PC-9細胞培養(yǎng) 將PC-9細胞靜置培養(yǎng)于37 ℃、含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中，DMEM培養(yǎng)基中含有10%胎牛血清、100 U/mL的青霉素、100 μg/mL的鏈霉素。當細胞融合度約80%時，用Trypsin-EDTA消化2 min，以1∶3傳代。

1.2.2 PC-9細胞增殖活性觀察 采用MTT法。①鹽酸?？颂婺岵煌瑫r間點處理肺癌PC-9細胞：取對數(shù)生長期的PC-9細胞，用Trypsin-EDTA消化成細胞懸液；將細胞接種12孔板，2×104/孔。待細胞貼壁后以含有40 μmol/L鹽酸?？颂婺岬腄MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)0、2、4、8、12、24 h。②不同濃度鹽酸埃克替尼處理肺癌PC-9細胞：取對數(shù)生長期的PC-9細胞，用Trypsin-EDTA消化成細胞懸液；將細胞接種于24孔板中，1×104/孔。待細胞貼壁后分別予以0、20、40、60、80 μmol/L的鹽酸?？颂婺岱跤幚?2 h。將不同濃度鹽酸?？颂婺嶙饔貌煌瑫r點的PC-9細胞消化成細胞懸液，均勻接種于96 孔板，每孔200 μL，每組設(shè)6個復(fù)孔及1個空白孔。細胞貼壁后，在避光條件下每孔加入100 μL的MTT溶液(1 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)4 h；每孔加入200 μL DMSO，室溫下放置30 min，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定570 nm各孔的光密度(OD)值，以各孔與空白孔OD比值的百分數(shù)表示細胞的增殖活性。

1.2.3 PC-9細胞凋亡情況觀察 采用流式細胞儀檢測。取對數(shù)生長期的PC-9細胞，用Trypsin-EDTA消化成細胞懸液，將細胞接種于12孔板中。對照組用DMSO處理8 h，給藥組用含40 μmol/L鹽酸?？颂婺崽幚? h；用不含EDTA的胰酶消化細胞，1 000 g離心5 min，棄掉上清，加入2 400 μL 1×Binding Buffer輕輕重懸細胞；加入5 μL AnnexinV-FITC，室溫避光染色15 min。加入10 μL PI染色液，避光染色5 min后進行流式細胞儀檢測凋亡細胞，計算細胞凋亡率。

1.2.4 JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3和VEGF蛋白檢測 采用Western blot法。將細胞分為給藥組和對照組，分別采用40 μmol/L鹽酸埃克替尼、DMSO處理8 h；收集細胞，用800 μL RIPA裂解液裂解細胞；4 ℃下以15 000 g離心20 min，吸取500 μL上清液轉(zhuǎn)至另一新的1.5 mL 離心管中。將蛋白樣品和6×SDS上樣緩沖液按5∶1混合，100 ℃加熱樣品10 min使蛋白充分變性。在電泳槽中加入電泳緩沖液，將蛋白樣品上樣于SDS-PAGE膠孔中，電壓80 V直至目標蛋白樣品跑至玻璃板中下1/3停止電泳。去除分離膠，將基層膠放入轉(zhuǎn)膜三明治；設(shè)定電壓110 V，計時95 min進行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉封閉緩沖液封閉，用相應(yīng)的一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h后進行膠片的壓片檢測。用圖像處理軟件裁取目標條帶，以Image J軟件測定各條帶的光密度(OD)值。以目的條帶與內(nèi)參Tubulin條帶OD比值表示目的蛋白相對表達量。

1.2.5 STAT3核移位情況觀察 采用細胞免疫熒光技術(shù)。取對數(shù)生長期的PC-9細胞，用Trypsin-EDTA消化成細胞懸液，將細胞接種于底部已放置細胞玻片的12孔板中。待細胞在玻片上生長融合到70%時，對照組采用DMSO處理，給藥組采用40 μmol/L鹽酸埃克替尼處理；8 h后用預(yù)冷的PBS洗滌細胞，4%甲醛固定20 min，0.2%Triton X-100透化3 min；然后用5% BSA室溫封閉30 min，在濕盒里一抗孵育2 h后加入二抗避光孵育1 h；最后滴加DAPI避光孵育5 min對標本進行染核，95%甘油封片后在激光共聚焦顯微鏡下觀察。STAT3在細胞中呈綠色熒光，計算入核細胞百分率。

2 結(jié)果

2.1 鹽酸?？颂婺釋Ψ伟㏄C-9細胞活性的影響 用0、20、40、60、80 μmol/L鹽酸埃克替尼作用12 h后，PC-9細胞增殖活性分別為98.72%±1.02%、76.23%±2.14%、62.49%±3.91%、43.12%±2.99%、34.28%±3.03%，40、60、80 μmol/L與0 μmol/L比較P均< 0.05；40 μmol/L鹽酸?？颂婺嶙饔?、2、4、8、12、24 h，PC-9細胞增殖活性分別為98.51%±0.81%、86.55%±3.11%、73.24%±2.31%、35.61%±2.43%、2.45%±1.93%，8、12、24 h與0 h比較P均<0.05。

2.2 鹽酸?？颂婺釋Ψ伟㏄C-9細胞凋亡的影響 給藥組PC-9細胞凋亡率3.70%±0.39%，明顯高于對照組的1.40%±0.21%，P<0.05。

2.3 鹽酸?？颂婺釋Ψ伟㏄C-9細胞JAK2-STAT3信號通路及VEGF蛋白表達的影響 與對照組相比，給藥組肺癌PC-9細胞p-JAK2、p-STAT3相對表達量均減少(P均<0.05)，VEGF蛋白相對表達量亦減少(P<0.01)。見表1。

表1 兩組肺癌PC-9細胞JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 和VEGF蛋白相對表達量比較±s)

注：與對照組比較，*P<0.05，#P<0.01。

2.4 鹽酸?？颂婺釋TAT3核移位的影響 給藥組STAT3入核細胞百分率為36.48%±2.12%，低于對照組的86.56%±1.82%(P<0.01)。

3 討論

VEGF又名血管穿透因子，作為一種血管內(nèi)皮細胞生長因子，該因子的發(fā)現(xiàn)為后期大量關(guān)于抑制癌癥血管化的研究奠定了基礎(chǔ)。在腫瘤微環(huán)境中，VEGF還可作為應(yīng)激生長因子，作為炎癥和腫瘤生長之間的橋梁。其發(fā)揮促進腫瘤生長作用，主要是通過炎癥轉(zhuǎn)錄因子促進腫瘤細胞的生長、黏附以及侵襲、趨化作用。因此，VEGF在腫瘤中的作用并不僅限于促進腫瘤組織的血管化。眾多研究表明，在腫瘤組織中多存在STAT3的過度激活，且抑制STAT3活性可以促進腫瘤細胞凋亡[17]。但是，對于STAT3的促癌機制目前尚不清楚，尤其是JAK-STAT3信號通路和鹽酸埃克替尼抗癌之間的機制關(guān)聯(lián)，這也是本研究主要探討的關(guān)鍵點。

本研究主要探討鹽酸?？颂婺釋Ψ伟㏄C-9細胞增殖、凋亡的影響及機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著鹽酸?？颂婺釢舛仍黾雍妥饔脮r間的延長，其對肺癌PC-9細胞增殖活性的抑制作用增強。有研究表明，JAK2-STAT3信號通路參與調(diào)控腫瘤細胞的凋亡、分化以及自噬[18,19]。因此，我們觀察了鹽酸?？颂婺釋Ψ伟㏄C-9細胞活性的抑制作用是否與JAK2-STAT3信號通路具有一定的機制關(guān)聯(lián)。Western blot檢測結(jié)果顯示，鹽酸?？颂婺崮軌蚪档蚿-JAK2、p-STAT3的表達，說明其可通過抑制JAK2和STAT3的磷酸化抑制該通路的激活。STAT3作為轉(zhuǎn)錄因子，其細胞定位對于其功能的發(fā)揮具有重要作用[17]。我們通過細胞免疫熒光技術(shù)檢測了STAT3蛋白的細胞定位，發(fā)現(xiàn)鹽酸埃克替尼可抑制STAT3的核內(nèi)移位。然而，轉(zhuǎn)錄因子STAT3的核內(nèi)含量減少是否與肺癌PC-9細胞的凋亡有關(guān)呢? Jiang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，STAT3和低氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)協(xié)同作用，轉(zhuǎn)錄結(jié)合VEGF啟動子區(qū)并上調(diào)VEGF的轉(zhuǎn)錄表達。本研究結(jié)果表明，鹽酸?？颂婺嵩诮档蚃AK2-STAT3信號通路相關(guān)蛋白的同時，VEGF蛋白表達也顯著降低。說明鹽酸?？颂婺峥赏ㄟ^抑制JAK2-STAT3信號通路的活性，從而下調(diào)VEGF蛋白的表達，進而抑制腫瘤細胞的增殖活性，并促進其凋亡。

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Effects of icotinib hydrochloride on proliferation and apoptosis of non-small-cell lung cancer cells

WANGLinmei,LIUJianbo,SHAORunxia,QIJingxian,SHANGXueqin

(1TheSecondAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014,China)

Objective To observe the effect of icotinib hydrochloride on the proliferation and apoptosis of non-small-cell lung cancer (NSCLC) PC-9 cells and investigate its underlying mechanism. Methods PC-9 cells in the logarithmic phase was treated with 40 μmol/L icotinib hydrochloride for 0, 2, 4, 8, 12 and 24 h, followed by 0, 20, 40, 60 and 80 μmol/L icotinib hydrochloride of 12 h. MTT was used to detect the proliferation activity of PC-9 cells. PC-9 cells were divided into the experimental group (which was treated with 40 mmol/L icotinib hydrochloride for 8 h) and control group (which was treated with DMSO for 8 h). The apoptosis rate of PC-9 cells was determined by flow cytometry. The protein expression of JAK2, p-JAK2, signal transducer and activator oftranscription 3 (STAT3), p-STAT3 and vascular endothelial growth factor (VEGF) was detected by Western blotting. The translocation of STAT3 and its transcation on VEGF was respectively measured by cell immunochemistry. Results With the increasing concentrations of icotinib hydrochloride or with the extension of time, the proliferation activity of PC-9 cells gradually reduced. Significant difference was found between 40, 60, 80 μmol/L and 0 μmol/L, between 8, 12, 24 h and 0 h (allP<0.05). The apoptosis rate of PC-9 cells in the experimental group was 3.7%±0.39%, significantly higher than that of the control group (1.4%±0.21%),P<0.05. Compared with the control group, the relative expression of p-JAK2 and p-STAT3 was reduced (P<0.05) as well as the relative expression of VEGF protein in the experimental group (P<0.01). The cell percentage of STAT3 in nuclear was 36.48%±2.12%, which was lower than that of the control group (86.56%±1.82%), (P<0.01).Conclusion Icotinib hydrochloride could inhibit the cell proliferation, promote the apoptosis of PC-9 cells through inhibiting the activity of JAK2-STAT3 signaling pathway and cell percentage of STAT3 in nuclear as well as down-regulating VEGF expression.

non-small-cell lung cancer; PC-9 cells; icotinib hydrochloride; proliferation; apoptosis; signaling pathway; vascular endothelial growth factor

河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計劃項目(201403899)。

王林梅(1975-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要研究方向為呼吸內(nèi)科疾病。E-mail: doclinmeiwang@163.com

簡介：邵潤霞(1964-)，女，主任醫(yī)師，主要研究方向為肺纖維化、肺癌等。E-mail: shaorunxia@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.38.003

R915

A

1002-266X(2016)38-0009-04

2016-04-13)