彭秋月，張曉萍， 邵潤霞

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，鄭州450014)

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1-磷酸鞘氨醇對肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

彭秋月，張曉萍， 邵潤霞

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，鄭州450014)

目的 觀察1-磷酸鞘氨醇(S1P)對肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響。方法 體外培養(yǎng)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549，以不同濃度(0、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L)S1P作用72 h后,倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化；以10-5mol/L S1P作用A549細(xì)胞，不同時點(diǎn)(0、12、24、48、72 h)收集細(xì)胞，采用Western blot法和RT-PCR法分別測定EMT相關(guān)蛋白及mRNA。以0 mol/L S1P或S1P作用0 h為對照組，其他濃度和時點(diǎn)為觀察組。結(jié)果 觀察組不同濃度S1P孵育后，A549細(xì)胞在10-7mol/L時，開始出現(xiàn)類似成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞呈梭形、紡錘形，且細(xì)胞間連接疏松，間隙增大；對照組細(xì)胞呈典型的上皮細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞間連接緊密，呈類圓形。與對照組相比，觀察組隨著作用時間的延長，上皮標(biāo)記物E-鈣黏素蛋白及mRNA表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)記蛋白纖維連接蛋白、平滑肌肌動蛋白及mRNA表達(dá)上調(diào)，均在作用48、72 h差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05或0.01)。結(jié)論 S1P分子可誘導(dǎo)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，在肺間質(zhì)纖維化形成過程中具有一定促進(jìn)作用。

肺間質(zhì)纖維化；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；1-磷酸鞘氨醇；肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞；E-鈣黏素；纖維連接蛋白；平滑肌肌動蛋白

肺間質(zhì)纖維化是一種慢性炎癥性間質(zhì)性肺疾病，主要表現(xiàn)為彌漫性肺泡炎、肺泡單位結(jié)構(gòu)紊亂。病理改變以大量的成纖維細(xì)胞聚集、細(xì)胞外基質(zhì)沉積，并伴有炎癥和組織損傷所致的結(jié)構(gòu)破壞為特征；早期各種細(xì)胞因子滲出、大量炎性細(xì)胞浸潤，后期成纖維細(xì)胞大量增生、膠原沉積，并逐漸發(fā)展為不可逆的病理過程[1]。肺間質(zhì)纖維化發(fā)病率逐漸升高，但具體發(fā)病機(jī)制尚不完全明確。近年研究發(fā)現(xiàn)，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞損傷與不適當(dāng)?shù)男迯?fù)可啟動上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，使上皮標(biāo)記物E-鈣黏素(E-cad)表達(dá)下調(diào)、間質(zhì)標(biāo)記蛋白纖維連接蛋白(FN)和平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生與發(fā)展[2]。然而，目前并無有效的治療方案阻止持續(xù)進(jìn)展的EMT過程。

1-磷酸鞘胺醇(S1P)是一種具有重要生理功能的膜磷脂代謝產(chǎn)物，S1P通過與受體結(jié)合或直接作為第二信使，介導(dǎo)細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、細(xì)胞分化等多種生物學(xué)作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，S1P可調(diào)控多種細(xì)胞參與纖維炎癥及纖維化過程[4]。2015年3月～2016年5月，我們觀察了S1P對肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞EMT的影響，探討S1P在肺間質(zhì)纖維化發(fā)病機(jī)制中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549(鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供)；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司)，胰酶、PBS (美國HyClone公司)，二甲基亞砜、S1P(美國Sigma公司)；TRIzol Reagent (美國Invitrogen公司)，DNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Ⅰ Real time PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；抗FN、α-SMA、E-cad一抗(美國Abcam公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠二抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。倒置顯微鏡(美國Leica公司)，ABI 7500Fast 實(shí)時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，垂直電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將A549細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 μg/mL慶大霉素、100 U/mL青霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2人工培養(yǎng)箱中，隔天換液。待細(xì)胞培養(yǎng)至70%～80%融合狀態(tài)時，用0.25%胰酶消化傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)觀察 調(diào)整消化傳代的細(xì)胞密度為1.0×106/mL，接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁生長融合達(dá)70%～80%時，無血清靜止培養(yǎng)24 h；加入不同濃度(0、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L)S1P作用48 h后，使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化并拍照。將0 mol/L S1P設(shè)為對照組，其他濃度設(shè)為觀察組。

1.2.3 EMT相關(guān)蛋白及基因檢測 調(diào)整消化傳代的細(xì)胞密度為1.0×106/mL，接種于6孔板內(nèi)；待細(xì)胞貼壁生長融合達(dá)70%～80%時，無血清靜止培養(yǎng)24 h；加入10-5mol/L的S1P，收集作用0、12、24、48、72 h時的細(xì)胞。將0 h設(shè)為對照組，其他時點(diǎn)設(shè)為觀察組。每次試驗(yàn)重復(fù)3次。①E-cad、FN、α-SMA蛋白檢測：采用Western blot法。取10-5mol/L的S1P干預(yù)后呈對數(shù)生長的A549細(xì)胞，分別于0、12、24、48 h提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度并調(diào)整每孔蛋白上樣量為30 μg。蛋白樣品和上樣緩沖液按比例混勻變性后電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉；相應(yīng)的一抗(按1∶250稀釋)4 ℃孵育過夜，HRP標(biāo)記二抗(按1∶500稀釋)室溫孵育2 h,洗膜后進(jìn)行ECL顯色，用圖像分析軟件Quantity One分析條帶的積分光密度值。以目的蛋白與GAPDH積分光密度比值作為目的蛋白相對表達(dá)量。②E-cad、FN、α-SMA mRNA檢測：采用RT-PCR法。收集各個時間點(diǎn)細(xì)胞,利用TRIzol提取細(xì)胞總RNA；定量后取總RNA 1 μg，按照cDNA合成試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；以其為模板，利用ABI7500 Fast System進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)；以GAPDH作為內(nèi)參基因，每組設(shè)3個復(fù)孔。引物序列：α-SMA上游引物為5′-AAAGCAAGTCCTCCAGCGT-3′，下游引物為5′-TTAGTCCCGGGGATAGGCAA-3′；FN上游引物為5′-GCTGACAGAGAAGATTCCCGA-3′，下游引物為5′-CCAGGGTGATGCTTGGAGAA-3′；E-cad上游引物為5′-GGCTGGACCGAGAGAGTTTC-3′，下游引物為5′-TCAAAATCCAAGCCCGTGGTG-3′。GAPDH上游引物為5′-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3′，下游引物為5′-GCGCCCAATACGACCAAATC-3′。反應(yīng)條件:95 ℃變性30 s；95 ℃、5 s，60 ℃、34 s,循環(huán)40次；末次循環(huán)后做溶解曲線，條件為95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s。以與內(nèi)參基因的比值表示目的基因的相對表達(dá)量，并采用2-ΔΔCT法來分析各組目的基因的表達(dá)差異。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度S1P對A549細(xì)胞形態(tài)的影響 對照組細(xì)胞呈典型的上皮細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞間連接緊密，呈類圓形。觀察組不同濃度S1P孵育后，A549細(xì)胞在10-7mol/L時開始出現(xiàn)類似成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞呈梭形、紡錘形，且細(xì)胞間連接疏松，間隙增大。

2.2 S1P對A549細(xì)胞E-cad、FN、α-SMA蛋白表達(dá)的影響 觀察組SIP處理細(xì)胞48、72 h后明顯上調(diào)FN蛋白的表達(dá)(t=2.093，P<0.05；t=2.787，P<0.01)，且明顯上調(diào)α-SMA蛋白的表達(dá)(t=3.344、3.965，P均<0.01)，但明顯抑制E-cad蛋白的表達(dá)(t=2.112，P<0.05；t=2.939，P<0.01)。見表1。

表1 兩組A549細(xì)胞E-cad、FN、α-SMA蛋白 相對表達(dá)量比較±s)

注：與對照組比較，*P﹤0.05，#P﹤0.01。

2.3 S1P對A549細(xì)胞E-cad、FN、α-SMA mRNA表達(dá)的影響 觀察組S1P處理細(xì)胞48、72 h后明顯上調(diào)FN mRNA表達(dá)(t=2.688，P<0.05；t=3.156，P<0.01)，且明顯上調(diào)α-SMA mRNA表達(dá)(t=2.274，P<0.05；t=4.202，P<0.01)，但是E-cad mRNA表達(dá)明顯下調(diào)(t=3.223，P<0.05；t=3.459，P<0.01)。見表2。

表2 兩組A549細(xì)胞E-cad、FN、α-SMA mRNA 相對表達(dá)量比較±s)

注：與對照組比較，*P﹤0.05，#P﹤0.01。

3 討論

由于肺間質(zhì)纖維化缺乏特異性診斷且呈持續(xù)進(jìn)展的特點(diǎn)，不斷給臨床工作者帶來挑戰(zhàn)[5]。各種不同的病因均可導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化，其機(jī)制主要是多種炎性細(xì)胞及炎癥介質(zhì)參與的炎癥損傷及纖維增生修復(fù)，最終導(dǎo)致不可逆的損傷[6]，早期肺泡炎癥、晚期細(xì)胞外基質(zhì)沉積是最關(guān)鍵的步驟[7]。而此過程中，肌成纖維細(xì)胞的積聚及持續(xù)存在被認(rèn)為是導(dǎo)致纖維化進(jìn)展的主要原因，而FN、α-SMA、E-cad被認(rèn)為是纖維化發(fā)生過程中經(jīng)典的標(biāo)記蛋白[8]。除了間質(zhì)中殘存的成纖維細(xì)胞，肺泡上皮可通過相應(yīng)EMT發(fā)展為具有收縮能力的肌成纖維細(xì)胞[9]。EMT是充分分化的上皮細(xì)胞經(jīng)過表型改變轉(zhuǎn)化為成熟的間質(zhì)細(xì)胞(主要包括成纖維細(xì)胞和纖維母細(xì)胞)[10]，而A549細(xì)胞是肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞起源的細(xì)胞系,是研究EMT良好的細(xì)胞模型[8]。

S1P是具有生物活性的脂類，且被證實(shí)是肺促纖維化及重塑的一個因子。因?yàn)樵诓﹣砻顾亟閷?dǎo)的肺纖維化動物模型及特發(fā)性肺纖維化患者的支氣管肺泡灌洗液中,S1P水平較正常組明顯增加[11]。S1P主要是通過G-蛋白偶聯(lián)受體S1P受體家族，主要包括S1P1、S1P2、S1P3來介導(dǎo)生物學(xué)效應(yīng)[12]。研究發(fā)現(xiàn)，促纖維化因子TGF-β1活化及上調(diào)鞘氨醇激酶1(SPHK1),而這種酶可以使鞘氨醇磷酸化，進(jìn)而產(chǎn)生S1P[13]；S1P通過與相應(yīng)受體作用，又可以反過來促進(jìn)TGF-β1表達(dá)上調(diào)，這種正反饋調(diào)節(jié)放大了S1P的促EMT作用[9]。

S1P具有類似經(jīng)典促纖維化因子TGF-β1的生物學(xué)效應(yīng)，且與其之間形成反饋回路。基于這個研究背景，我們推論S1P也可能具有促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的作用。最近國外研究發(fā)現(xiàn)，S1P可以介導(dǎo)視黃醛色素細(xì)胞發(fā)生EMT[11]。但是，國內(nèi)尚沒有發(fā)現(xiàn)足量資料來證明S1P可以作用肺泡上皮細(xì)胞。因此，本研究首先從形態(tài)學(xué)定性地觀察S1P的生物學(xué)作用。結(jié)果顯示，未經(jīng)S1P處理的細(xì)胞呈典型的上皮細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞間連接緊密，呈類圓形；而經(jīng)S1P處理后，10-7mol/L的S1P刺激下肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞就開始向纖維化細(xì)胞轉(zhuǎn)變，細(xì)胞明顯拉長，呈梭形，鵝卵石樣改變，細(xì)胞疏松，連接減少。發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變之后，接著從蛋白和基因表達(dá)的層面定量分析標(biāo)記蛋白的變化。E-cad是一種跨膜蛋白，對維持上皮結(jié)構(gòu)完整性至關(guān)重要；它的下調(diào)會導(dǎo)致相鄰細(xì)胞連接減少，進(jìn)而細(xì)胞連接變疏松[14]。FN、α-SMA是間質(zhì)細(xì)胞表型中經(jīng)典的標(biāo)記蛋白，如果在上皮細(xì)胞的表型中檢測到這些蛋白的表達(dá)，可以證明上皮細(xì)胞已經(jīng)向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。本實(shí)驗(yàn)中，S1P(10-5mol/L)處理細(xì)胞后，隨著時間的延長，間質(zhì)型標(biāo)記蛋白FN、α-SMA表達(dá)上調(diào)，而同時上皮標(biāo)記蛋白E-cad表達(dá)下調(diào)，48、72 h時與對照組相比，表達(dá)具有顯著性差異，證實(shí)S1P可以促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生EMT。

總之，我們通過形態(tài)學(xué)及分子表型標(biāo)記蛋白的動態(tài)變化，初步探索了S1P分子參與肺泡上皮細(xì)胞的EMT過程，進(jìn)而為研究S1P介導(dǎo)肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展奠定基礎(chǔ)，但具體的調(diào)控機(jī)制及通路還需要進(jìn)一步探討。阻斷相關(guān)通路下游信號分子，有可能為肺間質(zhì)纖維化的治療提供新的靶點(diǎn)及思路。

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Influence of S1P on epithelial-mesenchymal transition of alveolar type II epithelial cells

PENGQiuyue,ZHANGXiaoping,SHAORunxia

(TheSecondAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014,China)

Objective To observe the effect of sphingosine-1-phosphate (S1P) on epithelial-myofibroblast transition (EMT) of alveolar type Ⅱepithelial cells.Methods A549 cells were exposed to different concentrations of methanol-insolube S1P (0, 10-8, 10-7, 10-6and 10-5mol/L) for 72 hours, then the morphology was observe by inverted microscope. A549 cells were also treated with S1P (10-5mol/L) at different time points (0, 12, 24, 48 and 72 h), then the involved protein and mRNA expression was detected by Western blotting and RT-PCR, respectively. Meanwhile, we set S1P (0 mol/L, 0 h) as the control group and took other concentrations and other time points as the observation groups.Results For the observation groups, morphological changes in A549 cells began at the concentration of 10-7mol/L, which induced more fibroblast-like morphology with loosened cell-cell connection. For the control group, it represented typical epithelial oval morphology with tightly cell-cell connection. The expression of E-cadherin (protein and mRNA) significantly decreased, and the expression of α-SMA, fibronectin (FN) (protein and mRNA) significantly increased in A549 cells treated with S1P for 48, 72 h as compared with that of the control group (allP<0.05, or allP<0.01), which was in a time-dependent manner.Conclusion S1P may induce the EMT of alveolar type Ⅱ cells and plays an important role in the formation of pulmonary interstitial fibrosis.

pulmonary interstitial fibrosis; epithelial-mesenchymal transition; sphingosine-1-phosphate; alveolar type Ⅱ cells; E-cadherin; fibronectin; a-smooth muscle actin

彭秋月(1991-)，女，碩士在讀，主要研究方向?yàn)殚g質(zhì)性肺疾病。E-mail: 308875754@qq.com

簡介：邵潤霞(1964-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)殚g質(zhì)性肺疾病。E-mail: shaorunxia@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.38.002

R563.9

A

1002-266X(2016)38-0005-04

2015-05-31)