張文路，何志義，趙琳，賓雁飛

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

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·論著·

姜黃素逆轉(zhuǎn)慢性阻塞性肺疾病糖皮質(zhì)激素抵抗的作用機(jī)制

張文路，何志義，趙琳，賓雁飛

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

目的 觀察姜黃素通過(guò)抑制磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(p-ERK)促進(jìn)組蛋白去乙酰酶2(HDAC2)蛋白表達(dá)，探討姜黃素逆轉(zhuǎn)慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者糖皮質(zhì)激素抵抗的可能機(jī)制。方法 選取人單核系細(xì)胞白血病細(xì)胞U937為研究對(duì)象，MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖活性，繪制增殖曲線判斷細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)；以0、20、40、80 μmol/L的姜黃素作用U937細(xì)胞6、12、24 h，MTT法測(cè)定細(xì)胞活性，確定姜黃素作用濃度及時(shí)間；將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U937細(xì)胞分為兩組，干預(yù)組以MTT實(shí)驗(yàn)確定的姜黃素濃度及作用時(shí)間培養(yǎng)，對(duì)照組不處理，采用Western blot法檢測(cè)p-ERK及HDAC2蛋白。結(jié)果 U937細(xì)胞增殖曲線近似S形，表明該細(xì)胞株生長(zhǎng)狀態(tài)良好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；隨著姜黃素濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，U937細(xì)胞活性逐漸減低，確定姜黃素干預(yù)濃度及時(shí)間為40 μmol/L和12 h。對(duì)照組與干預(yù)組細(xì)胞中p-ERK蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.848±0.033、0.359±0.035，HDAC2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.258±0.009、0.525±0.032，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)論 姜黃素能夠通過(guò)抑制p-ERK促進(jìn)HDAC2蛋白表達(dá)，這可能是姜黃素逆轉(zhuǎn)COPD患者糖皮質(zhì)激素抵抗的機(jī)制之一。

慢性阻塞性肺疾病；姜黃素;糖皮質(zhì)激素抵抗；U937細(xì)胞；組蛋白去乙酰酶2；磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是以氣道慢性炎癥為重要特征的疾病，多種炎癥細(xì)胞、炎癥介質(zhì)參與其發(fā)病過(guò)程，尤其是肺泡巨噬細(xì)胞在氣道的炎癥反應(yīng)過(guò)程中扮演著重要的角色。激活的肺泡巨噬細(xì)胞能釋放多種介質(zhì)，參與COPD的發(fā)生和發(fā)展[1]。然而，由于人肺泡細(xì)胞難以長(zhǎng)期在體外生存，目前對(duì)于肺泡巨噬細(xì)胞的體外研究采用U937細(xì)胞替代。人單核系細(xì)胞白血病細(xì)胞U937是一種巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞株[2]，容易獲得，便于培養(yǎng)與純化，可長(zhǎng)期生存，具有巨噬細(xì)胞的功能學(xué)特性。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗癌、清除自由基等多方面的藥理作用[3]，可增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素對(duì)COPD大鼠的抗炎作用[4]，但具體機(jī)制尚不清楚。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素抵抗與顯著持續(xù)的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)活化有關(guān)，ERK抑制劑可以逆轉(zhuǎn)糖皮質(zhì)激素抵抗發(fā)生；并且，組蛋白去乙酰酶2(HDAC2)表達(dá)和活性降低是COPD患者糖皮質(zhì)激素抵抗的主要機(jī)制之一[5]。2015年9月～2016年6月，我們?cè)噲D探討姜黃素通過(guò)抑制p-ERK促進(jìn)U937細(xì)胞中HDAC2蛋白表達(dá)，為今后研究姜黃素逆轉(zhuǎn)COPD患者糖皮質(zhì)激素抵抗提供新的思路及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人單核系細(xì)胞白血病細(xì)胞U937由課題組前期購(gòu)買(mǎi)(中科院細(xì)胞庫(kù))并培養(yǎng)傳代而來(lái)；RPMI 1640培養(yǎng)基、96孔板購(gòu)自Corning公司；胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司，姜黃素與四氮唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；p-ERK抗體購(gòu)自Abcam公司，HDAC2抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司，GAPDH抗體購(gòu)自Proteintech公司，熒光二抗購(gòu)自LICOR公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) U937細(xì)胞使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，并于二氧化碳培養(yǎng)箱37 ℃、5% CO2環(huán)境中溫育，操作過(guò)程嚴(yán)格按照無(wú)菌操作。

1.2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)觀察 將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞置于10 mL離心管中，以1 000 r/min離心2 min；10%胎牛血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并使細(xì)胞密度為5×105/mL。取200 μL細(xì)胞懸液種于96孔板中，即1×105/孔；每個(gè)96孔板種平行6個(gè)孔，共種4個(gè)96孔板，放于培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。分別于種板后0、24、48、72 h在細(xì)胞懸液中加入0.5% MTT溶液10 μL，并放回培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)4 h。小心吸盡孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，低速震蕩10 min使細(xì)胞紫色結(jié)晶完全溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上選擇450 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔光光密度(OD)值，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，應(yīng)用GraphPad Prism軟件作圖并進(jìn)行曲線擬合。以曲線判斷細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)是否良好，確定細(xì)胞能否用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 姜黃素作用時(shí)間及濃度的確定 使用10%胎牛血清培養(yǎng)基配置不同濃度的姜黃素溶液(0、20、40、80 μmol/L)。取1.2 mL細(xì)胞密度為50×105/mL的細(xì)胞懸液于5 mL離心管中，以1 000 r/min離心2 min。以0 μmol/L姜黃素溶液1.2 mL重懸細(xì)胞，混勻，在96孔板中平行加入6孔(對(duì)照孔)，每孔200 μL；20、40、80 μmol/L姜黃素溶液處理方法同0 μmol/L姜黃素溶液。再以上述方法接種2塊96孔板。每板中各姜黃素濃度各設(shè)平行3孔空白孔(只含姜黃素溶液不含細(xì)胞)。將96孔板放置培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，于6、12、24 h在細(xì)胞懸液中加入0.5% MTT溶液10 μL并放回培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)4 h，小心吸盡孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL DMSO并低速震蕩10 min使細(xì)胞紫色結(jié)晶完全溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上選擇450 nm波長(zhǎng)，測(cè)定各孔OD值。細(xì)胞生存率=(實(shí)驗(yàn)孔OD-空白孔OD)/(對(duì)照孔OD-空白孔OD)×100%，繪制細(xì)胞存活曲線。以姜黃素盡可能發(fā)揮抑制作用且達(dá)不到半數(shù)致死率(IC50)為目標(biāo)，確定其作用時(shí)間及濃度。

1.2.4 p-ERK及HDAC2蛋白檢測(cè)方法 采用Western blot法。使用10%胎牛血清培養(yǎng)基配置0、40 μmol/L濃度的姜黃素溶液。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，分為對(duì)照組和干預(yù)組，分別以0、40 μmol/L的姜黃素溶液重懸接種于培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)12 h后提取總蛋白，行聚丙烯酰胺凝膠電泳，并使用0.45 NC膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉；加p-ERK及HDAC2一抗4 ℃振蕩孵育過(guò)夜，再使用熒光標(biāo)記的p-ERK及HDAC2二抗在室溫孵育1 h。應(yīng)用TBST溶液進(jìn)行洗膜，Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)掃膜，獲取條帶圖片。以目的條帶與GAPDH對(duì)照條帶的OD比值，作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 U937細(xì)胞生長(zhǎng)狀況 如圖1所示，U937細(xì)胞增殖曲線近似S形，表明該細(xì)胞株生長(zhǎng)狀態(tài)良好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 U937細(xì)胞增殖曲線

2.2 姜黃素的作用時(shí)間及濃度 見(jiàn)圖2。20、40、80 μmol/L姜黃素作用6 h時(shí)細(xì)胞生存率分別為97.16%±4.13%、92.78%±8.78%、93.99%±6.44%；作用12 h時(shí)細(xì)胞生存率分別為95.47%±11.11%、87.01%±12.03%、56.04%±10.15%；作用24 h時(shí)細(xì)胞生存率分別為56.36%±12.11%、25.94%±4.35%、15.69%±2.80%。為使姜黃素作用于U937細(xì)胞時(shí)，不僅盡可能發(fā)揮抑制作用并且達(dá)不到IC50，因此選用姜黃素干預(yù)濃度及時(shí)間為40 μmol/L和12 h。

圖2 U937細(xì)胞對(duì)姜黃素藥物敏感性檢測(cè)

2.3 p-ERK及HDAC2蛋白表達(dá)情況 使用0、40 μmol/L的姜黃素干預(yù)12 h后，對(duì)照組與干預(yù)組細(xì)胞中p-ERK蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.848±0.033、0.359±0.035，HDAC2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.258±0.009、0.525±0.032，兩組p-ERK及HDAC2蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

3 討論

COPD是一種發(fā)病機(jī)制復(fù)雜的肺部慢性炎癥性疾病，由環(huán)境和基因相互作用形成，多種細(xì)胞因子和炎癥細(xì)胞共同參與[6，7]。糖皮質(zhì)激素作為對(duì)該病有效的抗炎藥物，在急性哮喘的控制以及治療慢性炎癥和免疫性疾病等方面效果良好，但在大多數(shù)COPD患者中卻普遍存在糖皮質(zhì)激素抵抗現(xiàn)象[8，9]。

研究表明，糖皮質(zhì)激素與其受體結(jié)合后可通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、AP-1、PI3K等分子的活性并降低組蛋白乙?；蕉种蒲装Y基因的表達(dá)，從而使糖皮質(zhì)激素發(fā)揮有效抗炎作用[10，11]。另外，激活的糖皮質(zhì)激素受體亦可激活HDAC2，并使其募集到炎癥基因啟動(dòng)子區(qū)，促進(jìn)炎癥基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白去乙酰化而使炎癥基因失活，激活的HDAC2反過(guò)來(lái)作用于糖皮質(zhì)激素受體使其去乙?；罨?，進(jìn)一步抑制炎癥基因的表達(dá)[12]?？梢?jiàn)，HDAC2表達(dá)增加與活化在糖皮質(zhì)激素發(fā)揮作用過(guò)程中占據(jù)著不可或缺的地位。因此，對(duì)HDAC2調(diào)控機(jī)制的研究可為改善COPD患者存在的糖皮質(zhì)激素抵抗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)以及治療的新思路。目前，真核生物的HDAC分為4類(lèi)，其中Ⅰ類(lèi)包括HDAC1、2、3、8，存在于細(xì)胞核內(nèi)。HDAC2屬于Ⅰ類(lèi)HDAC。研究發(fā)現(xiàn)，HDAC2參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞活動(dòng)，如細(xì)胞增殖分化、炎癥、糖皮質(zhì)激素受體功能調(diào)節(jié)等[13～15]。此外，研究[15]還發(fā)現(xiàn)COPD患者中HDAC2的表達(dá)和活性均降低，且與糖皮質(zhì)激素抵抗有關(guān)。

有研究[5]顯示，糖皮質(zhì)激素抵抗與顯著持續(xù)的ERK活化有關(guān)，ERK抑制劑可以逆轉(zhuǎn)糖皮質(zhì)激素抵抗發(fā)生。在該研究中發(fā)現(xiàn)，激素耐藥組存在明顯的糖皮質(zhì)激素受體α核轉(zhuǎn)位減少，p-ERK的表達(dá)明顯上升；而加入特異性的ERK抑制劑UO126后,激素耐藥組糖皮質(zhì)激素受體α的核轉(zhuǎn)位較前明顯上升。提示阻止p-ERK表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)激素耐藥組糖皮質(zhì)激素受體α的核轉(zhuǎn)位障礙，表明糖皮質(zhì)激素抵抗與p-ERK表達(dá)密切相關(guān)。在本研究中，姜黃素作為ERK抑制劑[16]再一次表明,隨著p-ERK蛋白表達(dá)被抑制，HDAC2蛋白表達(dá)增加。說(shuō)明ERK抑制劑可能通過(guò)增加HDAC2蛋白表達(dá)，從而抑制糖皮質(zhì)激素抵抗的發(fā)生或者增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素治療的敏感性，減輕COPD患者的炎癥反應(yīng)。

姜黃素是姜科植物姜黃中最有效的成分。姜黃是一味常用中藥，《中國(guó)藥典》記載：“可用于胸脅剌痛?！笨梢?jiàn)姜黃素在呼吸疾病的治療中具有悠久的歷史，然而其具體機(jī)制至今尚未明確，仍是近年來(lái)眾多學(xué)者研究及關(guān)注的熱點(diǎn)。研究表明，姜黃素參與ERK、PI3K/Akt等多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)[17]。研究發(fā)現(xiàn),姜黃素能夠通過(guò)增加HDAC2蛋白表達(dá)進(jìn)而減輕糖皮質(zhì)激素抵抗[4]。本研究結(jié)果顯示，姜黃素干預(yù)U937細(xì)胞后，HDAC2蛋白表達(dá)增加，與上述研究結(jié)果一致。

綜上所述，姜黃素可以通過(guò)抑制p-ERK蛋白表達(dá)促進(jìn)U937細(xì)胞表達(dá)HDAC2蛋白，這可能是姜黃素減輕COPD患者糖皮質(zhì)激素抵抗的機(jī)制之一，可為進(jìn)一步研究及完善姜黃素治療COPD的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為糖皮質(zhì)激素抵抗的治療提供新的思路及靶點(diǎn)。

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Mechanism of curcumin reversing glucocorticoid resistance in chronic obstructive pulmonary disease

ZHANGWenlu,HEZhiyi,ZHAOLin,BINYanfei

(TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To observe curcumin promoting histone deacetylase 2 (HDAC2) protein expression through restraining phosphorylation of extracellular protein kinase (p-ERK) and clarify the possible mechanism of curcumin reversing glucocorticoid resistance in chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Methods U937 cells were selected. MTT was used to detect the proliferation activity and then we drew the curve to determine cell growth condition. We used 0, 20, 40 and 80 μmol/L curcumin to treat U937 cell for 6, 12 and 24 h, then determined the cell activity by MTT to determine the concentration and time of curcumin. Cells in the logarithmic phase were divided into two groups. The intervention group was treated with the determined concentration and action time of curcumin. Western blotting was used to detect p-ERK and HDAC2 protein. Results The cell proliferation curve of U937 was similar to S type, showing that the cells were in good condition and could be used in next test. With increasing concentration and extending time of curcumin, U937 cell activity gradually reduced, and the determined concentration and time was 40 μmol/L and 12 h. The relative expression of p-ERK protein in the control group and intervention group was respectively 0.848±0.033 and 0.359±0.035; and the relative expression of HDAC2 protein was 0.258±0.009 and 0.525±0.032, respectively (allP<0.05). Conclusion Curcumin could promote HDAC2 protein expression by inhibiting p-ERK, which may be one of the mechanisms of curcumin reversing glucocorticoid resistance.

chronic obstructive pulmonary disease; curcumin; U937 cells; histone deacetylase 2; phosphorylation of extracellular protein kinase; glucocorticoid resistance

廣西醫(yī)科大學(xué)青年科學(xué)基金項(xiàng)目(GXMUYSF201332)。

張文路(1991-)，在讀研究生，主要研究方向?yàn)槁宰枞苑渭膊?。E-mail: 987201619@qq.com

簡(jiǎn)介：何志義(1973-)，男，博士，教授，主要研究方向?yàn)槁宰枞苑渭膊?。E-mail: zhiyi-river@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.38.001

R563

A

1002-266X(2016)38-0001-04

2016-06-16)