趙旭樂(lè)，管斌，*，孔青，董建軍，尹花，侯松珍，余俊紅，楊梅

（1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003；2.青島啤酒股份有限公司，山東青島266061）

不同添加物對(duì)大麥發(fā)芽過(guò)程中熱穩(wěn)定蛋白含量的影響

趙旭樂(lè)1，管斌1，2*，孔青1，董建軍2，尹花2，侯松珍2，余俊紅2，楊梅2

（1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003；2.青島啤酒股份有限公司，山東青島266061）

為了解發(fā)芽過(guò)程中熱穩(wěn)定蛋白動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)，以澳麥為原料，模擬工業(yè)制麥條件，系統(tǒng)分析了麥芽制備過(guò)程中熱穩(wěn)定蛋白分布變化。通過(guò)在浸麥最后一天添加Mg2+、K+、赤霉素(GA3)調(diào)節(jié)蛋白酶酶活及分解。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳和考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)，研究添加金屬離子及赤霉素后熱穩(wěn)定蛋白分布及含量。結(jié)果表明，麥芽中熱穩(wěn)定蛋白分子質(zhì)量主要分布在約40 ku和10 ku兩個(gè)區(qū)域。經(jīng)制麥后，40 ku分子質(zhì)量蛋白質(zhì)含量增加，10 ku附近蛋白質(zhì)含量變化不明顯。Mg2+和赤霉素添加降低了熱穩(wěn)定蛋白含量，K+有利于熱穩(wěn)定蛋白含量增加。

熱穩(wěn)定蛋白；制麥添加物；赤霉素

在不添加輔助用料的情況下，麥芽是啤酒中蛋白的唯一來(lái)源。麥芽中蛋白質(zhì)經(jīng)浸麥、發(fā)芽、糖化、煮沸及發(fā)酵等各種釀造工序后，大部分蛋白質(zhì)在酶的作用下分解為小分子量蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸，或受其他條件影響發(fā)生沉降，只有少部分轉(zhuǎn)移到啤酒中，這部分蛋白與啤酒中發(fā)泡蛋白含量有密切聯(lián)系[1-3]。熱穩(wěn)定蛋白因耐受高溫而不發(fā)生絮凝，具有優(yōu)異的熱穩(wěn)定性[4-5]，是成品啤酒中蛋白質(zhì)的主要來(lái)源，成為決定啤酒泡沫穩(wěn)定性及風(fēng)味等品質(zhì)指標(biāo)的重要因素[6]，具有很大的商業(yè)價(jià)值。啤酒泡沫是啤酒的重要質(zhì)量指標(biāo)，作為啤酒泡沫骨架的蛋白質(zhì)是構(gòu)成泡沫最主要的因子，是解決泡沫問(wèn)題根本途徑。

研究表明，蛋白質(zhì)Z和脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（lipid transfer protein，LTP）都具有熱穩(wěn)定性和對(duì)蛋白水解酶的抗性，是大麥熱穩(wěn)定蛋白重要組成部分[7]，其中蛋白質(zhì)Z分子質(zhì)量約43 ku，作為胚乳中的貯藏清蛋白，占大麥清蛋白總量的5%左右，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族。胚乳中蛋白質(zhì)Z有自由態(tài)和結(jié)合態(tài)兩種形式[8-9]，結(jié)合態(tài)在發(fā)芽過(guò)程中隨著胚乳的溶解不斷釋放，成為自由態(tài)蛋白質(zhì)。脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LTP1分子質(zhì)量約為10 ku的小分子球蛋白，存在于大麥糊粉層清蛋白中，可作為種子的淀粉酶和蛋白酶的抑制劑（probable amylase/protease inhibitor，PAPI）[10-11]，能夠抑制半胱氨酸和絲氨酸蛋白酶的活力。

目前，主要通過(guò)外源添加蛋白酶方式調(diào)節(jié)蛋白組分分解，酶化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，添加酶制劑會(huì)在啤酒中形成沉淀影響啤酒品質(zhì)[12-13]，如何使大麥發(fā)芽后，麥芽中自身蛋白酶產(chǎn)生量控制在合理范圍內(nèi)，從而滿足后續(xù)發(fā)酵過(guò)程中既為酵母菌提供足夠營(yíng)養(yǎng)，又不過(guò)度分解影響啤酒泡沫具有重要意義[14-15]。

赤霉素（gibberellic acid，GA3）是植物在萌發(fā)過(guò)程中產(chǎn)生的植物激素，也是目前啤酒工業(yè)上常用的添加劑，可誘導(dǎo)α-淀粉酶、蛋白酶、脫支酶、纖維素外切酶等多種酶類的形成[16-17]。金屬離子對(duì)酶的激活作用可以通過(guò)與酶分子上的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)相結(jié)合，或與酶或底物的中間物結(jié)合，也可作為輔酶或輔基的一個(gè)組成部分而起作用。因此，可通過(guò)添加金屬離子和赤霉素來(lái)調(diào)節(jié)蛋白酶酶活，從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)分解，使蛋白質(zhì)分解達(dá)到有利范圍。

本實(shí)驗(yàn)以大麥為研究對(duì)象，觀察大麥發(fā)芽過(guò)程中添加金屬離子和赤霉素后，熱穩(wěn)定蛋白變化規(guī)律。研究添加不同量K+、Mg2+和赤霉素（GA3）[18-21]調(diào)節(jié)蛋白酶酶活后，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）及考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）對(duì)蛋白質(zhì)分布及含量進(jìn)行研究，使蛋白質(zhì)組成及含量有利于泡沫蛋白形成。為啤酒工業(yè)中工藝調(diào)節(jié)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

以青島啤酒股份有限公司提供的澳麥Gairdner為原料，在制麥機(jī)上模擬工業(yè)制麥條件。

G-250染料：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；牛血清白蛋白（分析純）：上海阿拉丁生化試劑股份有限公司；氯化鈉、氯化鎂、氯化鉀、氯化鈣（均為分析純）：上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；赤霉素（GA3）（純度＞90%）：生工生物工程（上海）股份有限公司；甲叉雙丙烯酰胺（N,N'-methylene bisacrylamide，MBA），十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、聚丙烯酰胺（polyacrylamide，PAM）、四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）：美國(guó)Sigma公司；低分子質(zhì)量（1.2～66.2 ku）標(biāo)準(zhǔn)蛋白：美國(guó)Thermo公司；β-巰基乙醇、過(guò)硫酸銨（ammonium persulfate，AP）、甘氨酸、溴酚藍(lán)、考馬斯亮藍(lán)R-250：國(guó)藥集團(tuán)（上海）化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

722型可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海欣茂儀器有限公司；精密pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；TGL-16G高速冷凍離心機(jī)、TDL-5低俗離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；DYY-12型電腦三恒多用電泳儀、DYC-28A型垂直式電泳槽：北京六一生物科技有限公司；微型制麥儀：德國(guó)Seeger公司。

1.3方法

1.3.1大麥相關(guān)指標(biāo)及麥芽制備工藝

表1　釀造大麥相關(guān)指標(biāo)及麥芽制備工藝Table 1　Brewing barley indicators and malting process

利用制麥儀模擬工業(yè)制麥條件，同批次可處理8個(gè)1 kg樣品。浸麥及發(fā)芽工藝條件如表1所示。澳麥Gairdner浸麥工藝采用浸三斷三法，即浸水9 h/斷水10 h/浸水7 h/斷水8 h/浸水6 h，接著直接進(jìn)入發(fā)芽階段（16±1）℃、96 h。

1.3.2赤霉素（GA3）及金屬離子添加

Mg2+、K+分別以MgCl2、KCl的形式添加，濃度梯度均為0、40 mg/kg、60 mg/kg、80 mg/kg，在最后一次浸麥時(shí)以噴淋方式添加。GA3添加時(shí)間和方式同金屬離子，添加濃度梯度為0、0.1 mg/kg、0.2 mg/kg、0.3 mg/kg、0.4 mg/kg。

1.3.3熱穩(wěn)定蛋白的提取及含量測(cè)定[4]

麥芽制備過(guò)程中，添加不同濃度金屬離子及赤霉素，并測(cè)定制麥過(guò)程中總的熱穩(wěn)定蛋白含量變化。稱取適量待測(cè)樣品，加一定量提取液（NaCl 10 mmol/L，Tris-HCl 50 mmol/L，乙二胺四乙酸二鈉1 mmol/L，二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）1 mmol/L），搖勻后置于4℃、浸提2 h，每隔一段時(shí)間后搖勻。4 000 r/min離心，上清液即為蛋白粗提液，將粗提液置于沸水浴中20 min后，4 000 r/min離心，上清液即為熱穩(wěn)定蛋白提取液，采用Bradford法測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)含量。

1.3.4SDS-PAGE電泳

電泳使用不連續(xù)系統(tǒng)在4℃條件下進(jìn)行，15%分離膠，5%濃縮膠。若提取液蛋白含量較低，可先經(jīng)丙酮沉淀濃縮。電泳結(jié)束后染色1～2 h，后將凝膠置于脫色液中，至背景清晰明亮。以制麥過(guò)程中熱穩(wěn)定蛋白提取液為原料進(jìn)行SDS-PAGE電泳，上樣量為10～15 μL。

1.3.5數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)中主要采用Excel、Origin對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2　結(jié)果與分析

2.1大麥及麥芽相關(guān)指標(biāo)

啤酒釀造的各環(huán)節(jié)對(duì)啤酒成品的質(zhì)量都有影響，有文獻(xiàn)指出[22]，大麥、麥芽對(duì)啤酒成品質(zhì)量包括啤酒色度、泡沫等的影響分別為25%、17%。蛋白質(zhì)含量高的大麥溶解困難，進(jìn)一步影響淀粉類物質(zhì)的分解，浸出率低，麥芽利用率低。蛋白質(zhì)含量高的大麥需要浸麥時(shí)間相對(duì)延長(zhǎng)，才能達(dá)到較高的浸麥度，使大麥粒充分吸水，有利于大麥粒的發(fā)芽及淀粉等物質(zhì)充分溶解，避免形成玻璃質(zhì)。表1為澳麥Gairdner經(jīng)發(fā)芽后的成品麥芽品質(zhì)指標(biāo)。由表2可知，麥芽的浸出物含量高，即淀粉類和蛋白類的溶解度高，有利于原料利用率提高。糖化力、氨基酸態(tài)氮含量高，質(zhì)量適宜用于釀造。

表2　澳麥Gairdner麥芽品質(zhì)指標(biāo)Table 2　Quality indicators of Gairdner malt

2.2Mg2+對(duì)熱穩(wěn)定蛋白含量的影響

Mg2+是多種酶的活化因子，是三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪）代謝的相關(guān)酶類的活化劑并參與遺傳物質(zhì)核酸的合成，是植物體的一種必需元素[18，23]。發(fā)芽階段每次間隔24 h取樣，為發(fā)芽1 d、發(fā)芽2 d、發(fā)芽3 d、發(fā)芽4 d，采用SDS-PAGE方法對(duì)添加不同質(zhì)量濃度Mg2+的各樣品中熱穩(wěn)定蛋白分布進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。在浸麥最后一天，以氯化鎂形式添加Mg2+，測(cè)定制麥過(guò)程中熱穩(wěn)定蛋白含量變化，結(jié)果如圖2所示。

圖1　添加Mg2+后熱穩(wěn)定蛋白電泳結(jié)果Fig.1　SDS-PAGE of heat-stable protein with Mg2+addition

圖2　Mg2+對(duì)熱穩(wěn)定蛋白含量影響Fig.2　Effect of Mg2+on heat-stable protein content

由圖1可知，40 ku附近蛋白質(zhì)條帶隨著發(fā)芽過(guò)程進(jìn)行而明顯增加，即蛋白質(zhì)Z含量的增加，可能是結(jié)合態(tài)不斷轉(zhuǎn)變?yōu)樽杂蓱B(tài)。蛋白質(zhì)Z在胚乳中以自由和結(jié)合兩種形式存在[9，24]，發(fā)芽過(guò)程中隨著胚乳的溶解，后者不斷釋放，成為自由形式，處于自由態(tài)時(shí)可溶于水和鹽溶液。在發(fā)芽第1天，14.4～20.1 ku蛋白質(zhì)含量相對(duì)少，隨著發(fā)芽過(guò)程進(jìn)行，各種水解酶類被激活或重新合成，貯藏蛋白得到分解，使14.4～20.1 ku內(nèi)蛋白質(zhì)含量增加。由圖2可知，浸麥階段，熱穩(wěn)定蛋白含量的有下降趨勢(shì)，隨發(fā)芽過(guò)程持續(xù)，蛋白質(zhì)含量不斷增加并在發(fā)芽最后一天達(dá)最大值。添加鎂離子后，熱穩(wěn)定蛋白含量減少。蛋白質(zhì)Z絲氨酸蛋白酶類抑制劑，脂轉(zhuǎn)移蛋白（lipid transfer protein，LTP）是半胱氨酸蛋白酶類抑制劑，鎂離子可能對(duì)這兩種蛋白有激活作用[19，24]。隨著蛋白酶被激活，蛋白質(zhì)分解增加。

2.3K+對(duì)熱穩(wěn)定蛋白的影響

K+是生物體必須的大量元素中一種，是構(gòu)成細(xì)胞滲透勢(shì)的重要組分。在植物體內(nèi)K+幾乎全部呈離子狀態(tài)，鉀不參與重要有機(jī)物的組成，主要作為植物體內(nèi)各種生化反應(yīng)中的酶的活化劑，如通過(guò)對(duì)三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝必須丙酮磷酸激酶的活化影響呼吸速率，活化蛋白質(zhì)代謝過(guò)程中谷胱甘肽合成酶[18，23]等。發(fā)芽階段每次間隔24 h取樣，為發(fā)芽1 d、發(fā)芽2 d、發(fā)芽3 d、發(fā)芽4 d，采用SDS-PAGE方法對(duì)各樣品中熱穩(wěn)定蛋白分布進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。按1.3.2方法添加金屬鉀離子，測(cè)定發(fā)芽過(guò)程中熱穩(wěn)定蛋白含量變化，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖3　添加K+的熱穩(wěn)定蛋白電泳結(jié)果Fig.3　SDS-PAGE of heat-stable protein with K+addition

圖4　K+對(duì)熱穩(wěn)定蛋白含量影響Fig.4　Effect of K+on heat-stable protein content

由圖3可知，在發(fā)芽最后一天，在6.2～20.1 ku內(nèi)，蛋白質(zhì)條帶增多，熱穩(wěn)定蛋白含量在6.2～20.1 ku范圍內(nèi)分布增多。由圖4可知，K+加入后，熱穩(wěn)定蛋白含量增加，可能是K+促進(jìn)了熱穩(wěn)定蛋白向自由態(tài)轉(zhuǎn)化，當(dāng)K+添加量為60 mg/kg時(shí)，熱穩(wěn)定蛋白總含量增加40%，在發(fā)芽最后一天，熱穩(wěn)定蛋白含量達(dá)到最大值。K+是多種酶的活化劑，K+的添加有利于酶活的增加，對(duì)麥芽中貯藏蛋白的分解有促進(jìn)作用。2.4赤霉素（GA3）對(duì)熱穩(wěn)定蛋白含量的影響

赤霉素（GA3）是植物激素的一種，在未發(fā)芽大麥中赤霉素（GA3）以束縛態(tài)形式存在，在萌發(fā)過(guò)程中，束縛態(tài)轉(zhuǎn)化為游離態(tài)發(fā)揮生物調(diào)節(jié)作用[17，26]。赤霉素（GA3）是由胚合成并分泌到胚乳中，但只有擴(kuò)散到糊粉層才能誘導(dǎo)各種水解酶類的合成[18，22]。外源添加GA3，可以促進(jìn)各種水解酶類的形成而無(wú)需使種子發(fā)芽。發(fā)芽階段每次間隔24 h取樣，為發(fā)芽1 d、2 d、3 d、4 d，采用SDS-PAGE方法對(duì)各樣品中熱穩(wěn)定蛋白分布進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。按照1.3.2方法添加赤霉素（GA3），測(cè)定發(fā)芽過(guò)程中熱穩(wěn)定蛋白含量變化，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖5　添加GA3的熱穩(wěn)定蛋白電泳結(jié)果Fig.5　SDS-PAGE of heat-stable protein with GA3 addition

圖6　GA3對(duì)熱穩(wěn)定蛋白含量影響Fig.6　Effect of GA3 on heat-stable protein content

由圖5可知，赤霉素添加明顯促進(jìn)了蛋白質(zhì)分解活動(dòng)，在進(jìn)入發(fā)芽第一天后，電泳圖譜中位于14.4～20.1 ku的條帶明顯增多，此范圍內(nèi)蛋白質(zhì)含量增加。糊粉層中熱穩(wěn)定蛋白的合成與組織中脫落酸的含量之間存在某種正相關(guān)關(guān)系，而在浸麥初期，大麥糊粉層中脫落酸含量與赤霉素含量呈負(fù)相關(guān)，赤霉素添加抑制了麥芽中脫落酸合成，這也可能是導(dǎo)致熱穩(wěn)定蛋白含量下降的因素之一[17]。由圖6可知，雖然赤霉素添加可以促進(jìn)蛋白質(zhì)分解，增加大麥汁得率，降低生產(chǎn)成本，但隨發(fā)芽過(guò)程的進(jìn)行，位于40 ku附近蛋白條帶，在發(fā)芽最后一天明顯變淺，即蛋白含量減少，最終會(huì)對(duì)啤酒泡沫產(chǎn)生影響。

2.5麥芽熱穩(wěn)定蛋白與啤酒泡沫蛋白

麥芽熱穩(wěn)定蛋白與啤酒泡沫蛋白的SDS-PAGE圖譜見(jiàn)圖7。由圖7可知，相較于原料大麥，經(jīng)發(fā)芽過(guò)程后，麥芽中蛋白條帶明顯減少，特別是分子質(zhì)量在20.1～43 ku的蛋白質(zhì)，這可能是因?yàn)榈鞍酌傅姆纸庾饔?。處于約40 ku附近的蛋白質(zhì)含量明顯增多，在6.2～20.1 ku范圍內(nèi)一直分布較多蛋白質(zhì)。對(duì)比大麥、麥芽、啤酒泡沫蛋白可知，麥芽和啤酒中都含有40 ku、6.2～14.4 ku蛋白質(zhì)，而這兩種分子質(zhì)量蛋白都被認(rèn)為對(duì)啤酒泡沫形成有積極作用，可在生產(chǎn)中依據(jù)這兩種蛋白的含量，預(yù)測(cè)成品啤酒中泡沫蛋白的含量。

圖7　熱穩(wěn)定蛋白電泳結(jié)果Fig.7　SDS-PAGE of heat-stable protein

3　結(jié)論

利用微型制麥儀模擬工業(yè)制麥環(huán)境，以澳麥Ganider為原料，在浸麥最后一天添加金屬離子及赤霉素（GA3）調(diào)節(jié)麥芽中蛋白酶酶系的活性，并比較了添加金屬離子及赤霉素（GA3）后熱穩(wěn)定蛋白含量變化，從電泳條帶分析，處于40 ku附近蛋白質(zhì)較為穩(wěn)定，各種物質(zhì)添加不改變其分布。添加赤霉素明顯促進(jìn)了6.2～20.1 ku分子質(zhì)量范圍內(nèi)蛋白質(zhì)含量，各蛋白條帶分散開(kāi)來(lái)。從總體含量上來(lái)講鎂離子和赤霉素添加降低了熱穩(wěn)定蛋白含量，鉀離子有利于熱穩(wěn)定蛋白生成。

本研究建立了測(cè)定大麥發(fā)芽過(guò)程中熱穩(wěn)定蛋白的含量和變化趨勢(shì)的方法，研究表明，麥芽中熱穩(wěn)定蛋白分子量主要分布在約40 ku和10 ku兩個(gè)區(qū)域。在電泳圖譜7中40 ku處條帶和10 ku的條帶分別為蛋白質(zhì)Z和LTP1。在發(fā)芽進(jìn)程中隨著胚乳的溶解，結(jié)合態(tài)蛋白質(zhì)Z不斷釋放，因此在電泳圖譜7中能夠觀察到蛋白質(zhì)Z含量的增加，LTP1含量基本穩(wěn)定。

對(duì)比麥芽中熱穩(wěn)定蛋白及啤酒中泡沫蛋白分布規(guī)律，建立啤酒泡沫蛋白與麥芽中熱穩(wěn)定蛋白間聯(lián)系從而為制麥工藝的調(diào)節(jié)提供依據(jù)。今后可從分子組成和結(jié)構(gòu)角度進(jìn)一步探明賦予其熱穩(wěn)定性的因素和機(jī)理，將為隨后應(yīng)用蛋白質(zhì)工程手段改造和生產(chǎn)具有商業(yè)價(jià)值的耐熱蛋白創(chuàng)造條件。

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Effects of different additives on heat-stable proteins content in malting process

ZHAO Xule1,GUAN Bin1,2*,KONG Qing1,DONG Jianjun2,YIN Hua2,HOU Songzhen2,YU Junhong2,YANG Mei2
(1.College of Food Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266003,China; 2.Tsingtao Brewery Co.,Ltd.,Qingdao 266061,China)

In order to know the dynamic changes of heat-stable proteins during malting process,the heat-stable proteins were studied under simulated condition in industry.The protease activity and protein degradation were regulated by adding Mg2+,K+and gibberelin(GA3)at the last day of malt steeping.The metal ions and GA3 addition on heat-stable protein distribution and contents was studied by SDS-PAGE and Coomassie brilliant blue staining(Bradford)method.Results showed that the heat-stable proteins in malt were mainly distributed in the molecular mass of 40 ku and 10 ku.The content of proteins with molecular mass of 40 ku was significantly increased,while the contents of proteins with molecular mass of 10 ku was not obviouslychangedaftergermination.Theheat-stableproteinscontentsweredecreasedbyaddingMg2+andGA3,whiletheywereincreasedbyaddingK+.

heat-stable protein;malting additives;gibberelin

TS262.5

0254-5071（2016）10-0144-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.032

2016-06-07

山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（ZR2010CM050）；啤酒生物發(fā)酵工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（K2012002）；青島市公共領(lǐng)域科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（11-2-3-63-nsh）

趙旭樂(lè)（1989-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。

管斌（1957-），男，教授，博士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程方面。