張筱梅，朱維紅，苗曉燕*，王楠楠，吳艷清

（保定學院，河北保定071000）

茶薪菇子實體分化發(fā)育中總蛋白二維電泳譜的變化與分析

張筱梅，朱維紅，苗曉燕*，王楠楠，吳艷清

（保定學院，河北保定071000）

采用TCA-丙酮法和尿素-硫脲法提取了茶薪菇不同分化時期的蛋白質，并利用雙向電泳對蛋白質二維圖譜的變化進行了分析。結果表明，TCA-丙酮法提取的蛋白較適宜茶薪菇雙向電泳；在菌絲體期、原基期、幼菇期、成熟期子實體蛋白質的雙向電泳圖譜中共檢測到1261個特異蛋白斑點，其中幼菇期出現(xiàn)的特異蛋白斑點數(shù)在整個分化發(fā)育過程中最多，達570個，成熟菌蓋出現(xiàn)的蛋白斑點數(shù)為515個，而菌絲體期出現(xiàn)的僅為146個，表明子實體幼菇期細胞分化發(fā)育處于高峰期，差異蛋白表達十分活躍。分析認為茶薪菇子實體的分化發(fā)育與菌絲體的特異蛋白斑點變化規(guī)律有一定的相似性，這些特異蛋白斑點有些在隨后的子實體發(fā)育中消失。推測這些特異蛋白可能與相應子實體的形體特征發(fā)育有關。

茶薪菇；子實體；分化；二維電泳圖譜

茶薪菇（Agrocybe aegeritaHuang）已成為我國食用菌重要的新品種之一[1]，目前其有效成分研究多集中在多糖、凝集素方面[2-5]，蛋白質研究主要限于總蛋白、同工酶方面[6-7]，有關雙向電泳蛋白組譜分析報道較少，雙向電泳技術具有高通量、高靈敏度、高分辨率、重復性好等優(yōu)點[8]，越來越多地被應用在蛋白質組學研究方面。由于茶薪菇含有大量多糖、色素等次生代謝產(chǎn)物，同時常規(guī)提取方法對雙向電泳干擾較大，限制了蛋白質的純度及蛋白雙向電泳技術的進行，致使食用菌蛋白質提取的方法及雙向電泳技術研究相對較少，如虎奶菇自溶蛋白質提取使用Tris-飽和酚法和三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）/丙酮沉淀法[9]、靈芝菌絲體蛋白質提取使用高濃度的尿素-硫脲法[10]、靈芝子實體原基雙向電泳技術的建立[11]等。本研究的目的在于探討雙向電泳蛋白質提取純化的方法，初步探究茶薪菇子實體分化發(fā)育過程中蛋白組的變化情況，為研究茶薪菇生長發(fā)育規(guī)律，茶薪菇高產(chǎn)育種提供實驗依據(jù)。同時探討茶薪菇不同材料的雙向電泳實驗條件，為后續(xù)雙向電泳條件進一步優(yōu)化及蛋白質組學研究進行鋪墊。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種

茶薪菇（Agrocybe aegerita）SM菌株：由本院細胞實驗室提供。

1.1.2實驗試劑

（1）提取液

磷酸緩沖液（Na2HPO4、NaH2PO4）、TCA-丙酮（10%TCA和0.07%β-巰基乙醇）、冰浴丙酮、提取液I（8 mol/L尿素、2.5 mol/L硫脲、1.5 mol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、10 mmol/L Tris、20 mmol/L苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、2 mg/L脫氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease，DNase）、5mg/L核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）、提取液II（2%3-[（3-膽固醇氨丙基）二甲基氨基]-1-丙磺酸（3-[（3-cholanidopropyl）dimethy lammonio]-1-propanesulfonate，CHAPS）、4%1,4-二硫代蘇糖醇（1,4-dithiothreitol，DTT）、0.5%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）。

（2）膠體配方

本實驗均采用BIO-RAD電泳儀專用配套試劑。濃縮膠：Milli Q水、30%丙烯酰胺溶液、1.5 mol/L Tris（pH6.8）、10%SDS、10%過硫酸銨、四甲基乙二胺（N,N,N',N'-Tetraethylmethylenediamine，TEMED）。分離膠：Milli Q水、30%丙烯酰胺溶液、1.5 mol/L Tris（pH8.8）、10%SDS、10%過硫酸銨、TEMED。

（3）緩沖液

十二烷基硫酸納-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE）上樣緩沖液、膠條平衡緩沖液母液、膠條平衡緩沖液I和II、水化上樣緩沖液、電極緩沖液、低熔點瓊脂糖封膠液等。

（4）染色劑

考馬斯亮藍R-250染色液、聚丙烯酰胺凝膠脫色液、銀染固定液、銀染敏化液、銀染液、銀染顯色液、銀染終止液。

1.2儀器與設備

TES-240超低溫冰箱：美國Thremo科技公司；JY92-2D超聲波細胞粉碎儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；3K18 SIGMA高速冷凍離心機：德國Sigma公司；FD8-4B冷凍干燥機：美國SIM國際有限公司；WD-9405型水平搖床：北京市六一儀器廠；SZ-1型快速混勻器：江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；Molcular Devices Filter MaxF5酶標儀：美國美谷分子儀器公司；BIO-RAD雙向電泳儀：美國伯樂公司。

1.3方法

1.3.1菌絲體與子實體培養(yǎng)

保藏菌株斜面活化后，25℃平板培養(yǎng)8～10 d，刮取菌絲，將菌絲置于濾紙上，吸干表面水分待用?；罨N轉接栽培袋，25℃培養(yǎng)80 d出菇，得到鮮原基和子實體，選取生長均勻大小適中子實體、原基，清除培養(yǎng)基備用。

1.3.2子實體總蛋白提取

（1）超聲破碎協(xié)同TCA-丙酮法[12]

取茶薪菇菌絲體、原基、子實體各2 g于研缽剪碎并研磨至粉末狀，加10倍體積磷酸緩沖液，冰浴超聲（400 W）處理5 s，間隔5 s，全程20 min，保護溫度40℃。處理后液體快速移至離心管，于4℃、11 000 r/min離心10 min，取上清加20 mL TCA-丙酮搖勻，-20℃過夜保存。次日4℃、11 000 r/min離心30 min，棄上清；加20 mL 4℃儲藏條件下的100%丙酮，11 000 r/min離心30 min棄上清；再加20 mL 4℃儲藏條件下的體積分數(shù)80%丙酮，11 000 r/min離心30 min，沉淀冷凍干燥1 h后稱質量，-20℃保存。所得沉淀待裂解后用于測定蛋白質濃度和SDS-PAGE凝膠電泳。

（2）液氮研磨協(xié)同高濃度尿素-硫脲法

分別取茶薪菇菌絲體、原基、子實體2 g于陶瓷研缽中，剪碎加入適量液氮研至粉末狀，移至50 mL離心管，分別加入15 mL提取液I，于4℃水浴60 min，分別加入提取液II 5 mL，渦旋30 s×6次，間隔1 min置于冰上，4℃、10 000 r/min離心10 min，上清液冷凍干燥2 d，干粉待裂解后用于蛋白含量測定及SDS-PAGE凝膠電泳。

1.3.3蛋白質含量測定

蛋白質含量按Bradfrod法[13]進行測定：分別取蛋白質溶液和超純水共100 μL及1 000 μL G250染色液，振蕩混勻各樣品取200 μL，利用酶標儀進行測定，程序為SoftMax Pro6.1。以不同質量濃度（X）的牛血清蛋白（bull serum albumin，BSA）為橫坐標，波長595 nm處的吸光度值（Y）為縱坐標繪制標準曲線，結果表明，標準曲線方程為Y= 0.0162X+0.6553，R2=0.9951。各樣品中蛋白質含量（μg/μL）根據(jù)樣品吸光度值、樣品質量、稀釋倍數(shù)算出。

1.3.4蛋白質電泳

（1）SDS-PAGE電泳

分別取蛋白質樣液30 μL進行等體積上樣，濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V，電泳后凝膠用考馬斯亮藍染色處理后掃描觀察。

（2）雙向電泳[14-16]

先進行第一向等電聚焦（isoelectricfocusing，IEF）電泳，采用7 cm pH3-10聚焦電泳（immobilized pH gradient，IPG）膠條，上樣（據(jù)樣品濃度確定蛋白上樣體積）。IPG膠條膠面朝下于水化盤樣品液上，每膠條覆蓋2.5 mL礦物質油，等電聚焦程序見表1。

表1　等電聚焦程序Table 1　Program of isoelectric focusing

第一向等電聚焦后，膠條15 min兩次平衡，進行第二向SDS-PAGE電泳。采用12%凝膠，膠條膠面朝外推入瓊脂糖封膠液，待瓊脂糖封膠液凝固后將凝膠移至電泳槽，加電極緩沖液，進行SDS-PAGE電泳，濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V。電泳后取出凝膠，染色觀察。

2　結果與分析

2.1不同時期子實體蛋白質含量比較

茶薪菇子實體分化不同時期蛋白質含量見表2。由表2可知，茶薪菇隨子實體開始分化到成熟過程中，蛋白質含量不斷增加，且子實體發(fā)育不同時期蛋白質含量差別較大，以幼嫩子實體及成熟菌蓋中含量較為豐富，其中TCA-丙酮法的幼嫩子實體蛋白含量高達4.786 μg/μL，為菌絲體2倍，成熟菌蓋蛋白質含量達3.033 μg/μL，為菌絲體的1.3倍，原基蛋白含量為2.984 μg/μL，為菌絲體的1.25倍。研究表明兩種方法提取的子實體各時期蛋白含量均表現(xiàn)出相同的分化發(fā)育規(guī)律：即菌蓋幼菇最高，原基次之，菌絲體最低。但TCA-丙酮法提取的蛋白質含量偏高，而高濃度尿素-硫脲法提取的蛋白質含量偏低。

表2　茶薪菇子實體不同分化時期蛋白質含量比較Table 2　Comparison of protein content in different differentiation stages ofAgrocybe aegeritafruiting body

2.2不同提取方法的蛋白質SDS-PAGE電泳圖譜分析

兩種方法提取蛋白質SDS-PAGE電泳圖譜見圖1。研究表明，兩種方法提取的茶薪菇各時期的蛋白質，分子質量大小主要集中在25～100 ku。TCA-丙酮法提取的蛋白質含量高、豐度較大，條帶較多，分布均勻；高濃度尿素-硫脲法提取的蛋白質含量低，豐度小，條帶較少，其中泳道5幾乎沒有條帶。TCA-丙酮法提取的蛋白質電泳中，泳道2條帶較多染色深，道中間一些蛋白由于濃度過大，未能有效分離，說明幼嫩子實體中蛋白種類較多含量高，上樣量較大，后續(xù)電泳時應稀釋上樣量；泳道1為成熟子實體菌蓋提取的蛋白質，相比較泳道2淺一些，說明比幼菇中蛋白含量少一些，但高于原基和菌絲體；泳道3、4染色較淺且條帶少，表明原基、菌絲體中蛋白含量較子實體低，蛋白種類較少。高濃度尿素-硫脲法提取的蛋白質染色較淺，泳道5幾乎看不到條帶，說明提取的蛋白含量極少，不適宜進行后續(xù)雙向電泳，以免影響上樣量效果。分析認為茶薪菇細胞多糖色素含量較高，提取液粘度較高，尿素-硫脲法對色素、多酚等干擾物去除能力不足，影響了蛋白質溶解提?。欢鳷CA-丙酮法去除多糖及核酸效果較好，綜合比較，TCA-丙酮法提取的蛋白較適合進行后續(xù)雙向電泳實驗。

圖1　兩種方法提取蛋白質SDS-PAGE電泳結果比較Fig.1　Comparison of SDS-PAGE results of two kinds of extraction methods

2.3茶薪菇子實體不同分化期總蛋白的雙向電泳圖譜分析

實驗采用TCA-丙酮法提取的蛋白質樣品進行雙向電泳試驗，樣本包括茶薪菇分化過程中的菌絲體、原基、幼菇、成熟菌蓋四個時期，雙向電泳圖譜見圖2所示。

圖2　茶薪菇子實體不同分化發(fā)育期蛋白質雙向電泳圖譜Fig.2　Comparison of 2-dimensional gel electrophoresis of Agrocybe aegeritafruiting body protein in different differentiation stages

由蛋白質雙向電泳圖譜可以看出，各圖譜的蛋白點有重合有分散，菌絲體和原基蛋白點少、著色較淺，幼菇和菌蓋蛋白點多、著色較深，表明子實體分化發(fā)育不同時期蛋白質種類及含量有所不同。其中菌絲體蛋白點著色淺、數(shù)量較少，主要集中分布在圖譜中部，pI值偏中性，分子質量35～100ku；原基蛋白點著色較淺、數(shù)量有所增加、且顏色加深，與菌絲體相似泳點仍集中于中部，分子質量35～100ku，特別是圖譜下端35～40 ku及上端130～170 ku增加了一些新的蛋白泳點，表明子實體原基分化形成過程中有些分子量較小的蛋白進行了階段性的表達；幼菇的蛋白泳點最多，主要集中分布在35～130 ku，泳點著色深，特別是圖譜中部左端35～100 ku處蛋白泳點明顯增多，表明其pI值偏酸性的蛋白種類及含量明顯增多；成熟子實體菌蓋與幼嫩子實體蛋白泳點依然是圖中部左端蛋白泳點明顯增多，但蛋白點分布不夠集中，成熟菌蓋較幼菇蛋白泳點相對略少，著色稍淺。綜合來看，各樣本電泳有一些相似的共同蛋白泳點，表明在茶薪菇子實體不同發(fā)育階段與菌絲體有共同的蛋白存在，同時茶薪菇菌絲體與子實體不同發(fā)育階段的總蛋白含量及種類數(shù)量存在較為顯著差異。

2.4茶薪菇子實體與菌絲體蛋白圖譜差異比較

采用BIO-RAD PDQuest 8.0軟件分析表明，在茶薪菇子實體發(fā)育不同階段蛋白質的雙向電泳圖譜中共檢測到1 115個特異蛋白斑點，其中原基蛋白點數(shù)30個，幼菇期出現(xiàn)的特異蛋白斑點數(shù)在整個分化發(fā)育過程中最多達570個，成熟菌蓋出現(xiàn)的蛋白斑點數(shù)較多為515個，與菌絲體出現(xiàn)的146個蛋白點相比，幼菇和成熟菌蓋中表達的蛋白明顯增多，說明茶新菇子實體幼菇階段細胞分化發(fā)育處于高峰期，基因表達十分活躍。且由圖3可知，茶薪菇子實體分化發(fā)育過程中與菌絲體的特異蛋白斑點變化規(guī)律有一定的相似性，這些特異蛋白斑點有些在隨后的子實體發(fā)育中消失，有些則進行了上調表達，推測這些特異蛋白可能與相應子實體的形體特征發(fā)育有關，有待進一步的研究。

圖3　茶薪菇菌絲體與子實體蛋白二維圖譜差異比較Fig.3　Comparison of 2-dimensional diagram ofAgrocybe aegerita mycelia and fruiting body protein

2.5討論

2.5.1樣本破碎方法對蛋白電泳效果的影響

茶薪菇細胞壁堅韌不易破碎，胞內蛋白質獲取較困難，因此細胞壁破碎處理方法非常重要。目前研究中多采用超聲波法、液氮研磨法、酶解法、玻璃珠法及幾種結合的方法。酶解法常需要多種酶混合作用，成本較高；玻璃珠法效果有限。液氮研磨配合超聲波處理，以20 min、400 W功率破碎效果較好，采用超聲波處理時需特別注意使用時間、功率及溫度等，否則可能造成蛋白降解，影響電泳效果。

2.5.2樣本提取方法對蛋白濃度與純度的影響

本文初步探究了較適宜茶薪菇蛋白質提取的方法。TCA-丙酮法提取的蛋白質豐度較高，雙向電泳獲得的點數(shù)也較多，但該法仍存在拖尾現(xiàn)象，表明樣本存在不純問題，主要是由于茶薪菇細胞多糖含量比較多，直接影響到提取蛋白的純度，進而影響到蛋白電泳點的分離度與分辨率，故此在今后研究中需要重點去除菌絲多糖，可通過乙醇、乙醚來除多糖等雜質、減小上樣量的方法來進一步優(yōu)化。本研究采用高濃度尿素-硫脲法也進行了雙向電泳實驗，但蛋白泳點數(shù)極少，原基樣本進行第一向等點聚焦時電壓很低，可能與樣本蛋白濃度過低有關?？傊畠煞N方法相比，TCA-丙酮法提取的蛋白較適合茶薪菇的雙向電泳。

3　結論

TCA-丙酮法去除多糖及核酸效果較好，提取的蛋白種類和數(shù)量較多，較適合茶薪菇蛋白雙向電泳。研究表明，茶薪菇子實體分化發(fā)育過程中蛋白圖譜斑點數(shù)量變化規(guī)律為：較少—速增—減少，其中菌絲體期出現(xiàn)的特異蛋白斑點數(shù)最少，僅146個；幼菇期蛋白斑點數(shù)速增3.9倍，達570個；子實體成熟后菌蓋蛋白數(shù)又降至515個。表明菌絲體階段蛋白種類少，以細胞基本蛋白為主，子實體幼菇期細胞分化發(fā)育達到高峰，差異蛋白表達極其活躍，子實體發(fā)育成熟后細胞分化明顯減少，蛋白質種類亦逐漸減少。另外實驗發(fā)現(xiàn)，菌絲體與子實體成熟菌蓋之間存在一些位置相同的蛋白斑點，分析認為這些可能是細胞中的一些基本蛋白成分，二者之間的關系有待于進一步研究。

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Changes and analysis of two-dimensional electrophoresis profiles ofAgrocybe aegerita fruiting body total protein during differentiation

ZHANG Xiaomei,ZHU Weihong,MIAO Xiaoyan*,WANG Nannan,WU Yanqing (Baoding University,Baoding 071000,China)

The protein ofAgrocybe aegeritain different differentiation stages was extracted by TCA-acetone method and urea-thiourea method,and the two-dimensional electrophoresis(2-DE)of the protein were analyzed.The results showed that the TCA-acetone method was suitable for protein electrophoresis.2-DE protein electrophoresis results revealed 1261 specific protein spots in total from samples of the mycelium stage,primordium stage,young fruiting period stage,and mature fruiting body stage.Among them,the electrophoresis of young fruiting period stage showed the most specific spots(570),mature fruiting body ranked second with specific spots of 515,while the mycelium stage showed the lowest specific spots of just 146,indicating that protein expression reached the peak at young fruiting period stage and differential protein profile expressed very active.Results showed that there were certain similarity between the changing rules of specific protein spots of mycelia and the development of fruiting body differentiation stages.However,some protein spots disappeared in the subsequent development of the fruiting body.It was speculated that the specific proteins might be related to the physical characteristics development of the corresponding fruiting bodies.

Agrocybe aegerita;fruiting body;differentiation;two-dimensional electrophoresis

S646.9

0254-5071（2016）10-0140-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.031

2016-05-27

河北省自然科學基金項目（C2013104055）；保定學院食藥用菌馴化育種與開發(fā)科研團隊資助。

張筱梅（1957-），女，教授，本科，研究方向為微生物學。

苗曉燕（1980-），女，副教授，碩士，研究方向為生物科學。