鄒謀勇，朱新貴*

（李錦記（新會(huì)）食品有限公司，廣東江門(mén)529100）

幾種豆科植物抗菌肽的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)與分析

鄒謀勇，朱新貴*

（李錦記（新會(huì)）食品有限公司，廣東江門(mén)529100）

植物抗菌肽是存在于植物組織細(xì)胞中的一類(lèi)對(duì)于對(duì)外來(lái)侵害有防御作用的小分子蛋白，可抑制或殺傷多種細(xì)菌和真菌。隨著人們健康意識(shí)的提高以及技術(shù)手段的進(jìn)步，植物來(lái)源抗菌肽的發(fā)掘和應(yīng)用逐漸成為食品開(kāi)發(fā)領(lǐng)域的重要研究方向。該試驗(yàn)從蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選了7種豆科植物的抗菌肽，并對(duì)其蛋白序列進(jìn)行了比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)合生物信息學(xué)研究工具對(duì)豆科植物抗菌肽的疏水性、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)域、蛋白空間結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析。結(jié)果表明，7種豆科植物抗菌肽序列相似度達(dá)到71.94%，均具有8個(gè)半胱氨酸保守位點(diǎn)；豆科植物抗菌肽為堿性膜結(jié)合蛋白，分布于液泡膜、細(xì)胞核膜或者細(xì)胞膜上；其3D結(jié)構(gòu)均由一組β-折疊和一個(gè)α-螺旋組成，與硫堇、植物防衛(wèi)素蛋白結(jié)構(gòu)相似。

豆科植物；植物抗菌肽；生物信息學(xué)；預(yù)測(cè)

抗菌肽是一種廣泛存在于生物體內(nèi)，對(duì)生物體相應(yīng)病原體具有抑制或者殺傷效應(yīng)的小分子多肽。目前已經(jīng)從植物、哺乳動(dòng)物、水生動(dòng)物、昆蟲(chóng)、細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)抗菌肽[1-2]，并已累計(jì)發(fā)現(xiàn)2 000種以上[3]。近年來(lái)，對(duì)于抗菌肽的研究日益深入，特別是在食品防腐[4]和動(dòng)物免疫調(diào)節(jié)[5-6]方面涌現(xiàn)了系列研究成果。植物抗菌肽是抗菌肽家族的重要組成部分，已報(bào)道的植物抗菌肽有硫堇、植物防衛(wèi)素、脂轉(zhuǎn)移蛋白、幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白四類(lèi)抗菌肽[7-8]，現(xiàn)階段得到公認(rèn)的作用機(jī)制包括4種模型：桶-板模型、毯式模型、環(huán)孔模型和凝聚模型，大部分抗菌肽是通過(guò)破壞細(xì)胞膜來(lái)實(shí)現(xiàn)其抗菌活性的[9-10]。不同植物合成不同種類(lèi)的抗菌肽，其作用機(jī)制也不盡相同[11]。

豆科植物種子是人類(lèi)食物和動(dòng)物飼料的重要植物蛋白質(zhì)來(lái)源，特別是大豆種子的蛋白質(zhì)占干質(zhì)量40%以上[12]，其在豆制食品（如豆油、豆奶、豆腐、豆干、豆?jié){）以及發(fā)酵調(diào)味食品（如醬油、醬料、腐乳等）中扮演重要角色。隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)不斷進(jìn)步，人們對(duì)食品的質(zhì)量安全要求日益提高，促使食品研究工作者致力于綠色、零添加、天然、健康的食品開(kāi)發(fā)。植物抗菌肽作為來(lái)源于植物的抗菌物質(zhì)，其在食品健康領(lǐng)域的應(yīng)用前景非常廣闊[13-14]。豆科植物抗菌肽的發(fā)掘與分析，對(duì)于研究豆科植物自帶蛋白對(duì)調(diào)味食品發(fā)酵微生物的影響以及對(duì)豆科植物抗菌肽的分離提取和應(yīng)用有重要意義。然而，豆科植物抗菌肽的研究卻鮮有研究報(bào)道[15-16]。

生物信息學(xué)是以數(shù)據(jù)庫(kù)龐大數(shù)據(jù)信息為基礎(chǔ)，采用計(jì)算機(jī)信息處理手段解決遺傳數(shù)據(jù)挖掘、生物進(jìn)化、分子模擬、藥物設(shè)計(jì)等重要課題[17]。本研究通過(guò)生物信息學(xué)對(duì)豆科植物的抗菌肽進(jìn)行了序列比對(duì)、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，并對(duì)其理化特性、信號(hào)肽、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)域、蛋白空間結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位進(jìn)行了初步預(yù)測(cè)和分析。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

豆科植物抗菌肽蛋白序列來(lái)源于Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)。采用豇豆抗菌蛋白序列[18]，在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，選取序列相似度達(dá)到51.2%以上且來(lái)源于豆科植物的蛋白序列進(jìn)行進(jìn)一步生物信息學(xué)分析。

1.2儀器與設(shè)備

生物信息學(xué)數(shù)據(jù)采用ThinkPadE40（0578B31）計(jì)算機(jī)進(jìn)行分析，所用生物信息學(xué)軟件：ClustalX，DNAMAN，Mega4，PyMOL，Endnote；其他數(shù)據(jù)均采用在線工具進(jìn)行分析。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1豆科植物抗菌肽多重序列比對(duì)

采用Clustal X[19]軟件對(duì)豆科植物抗菌肽同源序列進(jìn)行多重比對(duì)，并導(dǎo)入DNAMAN軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和輸出。

1.3.2豆科植物抗菌肽系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

將Clustal X多重序列比對(duì)結(jié)果導(dǎo)入Mega 4軟件[20]，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。Bootstrap值設(shè)為1 000，其他參數(shù)為默認(rèn)值。

1.3.3豆科植物抗菌肽生物信息學(xué)分析

豆科植物抗菌肽基本理化特性采用蛋白理化特性采用在線工具ProtParam進(jìn)行分析。抗菌肽信號(hào)肽與拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)域分析采用在線分析工具Phobius進(jìn)行預(yù)測(cè)。蛋白空間結(jié)構(gòu)采用SWISS-MODEL的自動(dòng)模式進(jìn)行同源模建，從數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)篩選相似度最高的蛋白結(jié)構(gòu)作為同源模建模板。蛋白亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位采用在線工具Plant-mPLoc進(jìn)行預(yù)測(cè)。

理化特性中總平均疏水度（grandaverage ofhydropathy，GRAVY）為蛋白序列中所有氨基酸疏水值的總和與氨基酸數(shù)量的比值，負(fù)值越小表示親水性越好，正值越大表示疏水性越強(qiáng)。

2　結(jié)果與分析

2.1豆科植物抗菌肽多重序列比對(duì)

從Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到來(lái)源于7種豆科植物的抗菌肽序列，多重序列比對(duì)結(jié)果如圖1所示，序列相似度達(dá)到了71.94%，完全一致的保守氨基酸20個(gè)，其中半胱氨酸保守位點(diǎn)8個(gè)，可形成4個(gè)二硫鍵，以保持蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)穩(wěn)定。FRANCO O L等[18]對(duì)不同植物來(lái)源的硫堇（Cp-thionin II）進(jìn)行了多重序列比對(duì)，其主要保守位點(diǎn)與圖1顯示的保守氨基酸位點(diǎn)基本一致。GARCíA-OLMEDO F等[21]分析認(rèn)為植物抗菌肽硫堇具有5種不同的二硫鍵結(jié)合方式，植物防衛(wèi)素有一種保守的二硫鍵結(jié)合方式（見(jiàn)圖2A），豆科植物抗菌肽有4個(gè)保守二硫鍵，空間分布與已報(bào)道的植物防衛(wèi)素（defensin）高度相似，與硫堇I、II型（見(jiàn)圖2B）也有一定的相似性。因此從蛋白質(zhì)氨基酸序列的保守性以及二硫鍵的結(jié)合方式可以推測(cè)來(lái)自于7種豆科植物的抗菌肽為硫堇或植物防衛(wèi)素的相似蛋白。

圖17　種豆科植物抗菌肽多重序列比對(duì)結(jié)果Fig.1　Multiple alignment of antimicrobial peptides from seven kinds of leguminous plants

圖2　硫堇I、II型二硫鍵結(jié)合方式(A)和植物防衛(wèi)素二硫鍵結(jié)合方式(B)Fig.2　Disulfide bridge structures of thionin I,II types(A), disulfide bridge structures of plant defensins(B)

2.2豆科植物抗菌肽系統(tǒng)進(jìn)化分析

由圖3可知，赤小豆（Phaseolus angularis）和紅豆變種（Vigna angularisvar.angularis）的抗菌肽聚為一支，其親緣關(guān)系較近；那卡豆（Vignanakashimae）和綠豆（Vignaradiata）的抗菌肽聚為一支；豇豆（Vigna unguiculata）和上述4種豆科植物的抗菌肽聚為一支。野生大豆（Glycine soja）和大豆（Glycine max）抗菌肽聚為一支，與上述5種豆科植物存在一定的進(jìn)化距離。但是從整體的進(jìn)化距離分析，7種不同豆科植物的抗菌肽的親緣關(guān)系相對(duì)較近。

圖3　7種豆科植物抗菌肽系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.3　Phylogenetic tree analysis of antimicrobial peptides from seven kinds of leguminous plants

2.3豆科植物抗菌肽理化特性分析

采用在線工具ProtParam對(duì)7種豆科植物的抗菌肽蛋白進(jìn)行理化特性分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示。由表1可知，抗菌肽蛋白分子質(zhì)量在4.29～6.23u之間，分子大小接近；蛋白等電點(diǎn)（isoelectric point，pI）在8.74以上，大豆和野生大豆的pI較高，分別為9.37和9.54，說(shuō)明豆科植物抗菌肽均帶有一定量的負(fù)電荷，為堿性蛋白質(zhì)。這一結(jié)果對(duì)后續(xù)豆科植物抗菌肽分離純化方法優(yōu)化（如等電點(diǎn)沉淀）和應(yīng)用對(duì)象的pH值環(huán)境設(shè)定有重要指導(dǎo)意義?？咕钠骄杷龋?0.439，最小平均疏水度為-0.706（紅豆變種、赤小豆），從疏水度數(shù)值特征分析認(rèn)為7種豆科植物具有一定的親水性；這一特性使得其可以在絕大部分以水為溶劑的飲料食品或者含水的固體半固體食品中發(fā)揮抑菌、殺菌活性，表明其在食品保鮮方面具有較大的應(yīng)用空間。

表17　種豆科植物抗菌肽的理化特性預(yù)測(cè)Table 1　Physicochemical properties prediction of antimicrobial peptides from seven kinds of leguminous plants

2.4幾種豆科植物抗菌肽的信號(hào)肽與拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析

在線分析工具Phobius預(yù)測(cè)結(jié)果如表2所示，赤小豆、紅豆、綠豆和那卡豆的信號(hào)肽長(zhǎng)度相等，氨基酸序列僅有一個(gè)位點(diǎn)差異，進(jìn)一步證實(shí)了豆科植物蛋白在進(jìn)化上的保守性。拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)域分析表明7種豆科植物抗菌肽成熟肽段均為非胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，結(jié)合非胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的定義和蛋白疏水性分析結(jié)果（表1），推斷豆科植物抗菌肽為膜結(jié)合蛋白。因此在進(jìn)行豆科植物抗菌肽提取時(shí)應(yīng)當(dāng)優(yōu)先考慮將胞質(zhì)和膜結(jié)構(gòu)分開(kāi)，進(jìn)而從膜結(jié)構(gòu)中分離目標(biāo)蛋白，提高蛋白提取效率。為了更大量獲得豆科植物抗菌肽，需從分子生物學(xué)角度提高生物反應(yīng)器目標(biāo)蛋白的合成量，通過(guò)信號(hào)肽序列改造或置換實(shí)現(xiàn)其穿膜運(yùn)輸，使其分泌到培養(yǎng)液中，以降低后續(xù)分離提取難度。

2.5豆科植物抗菌肽3D結(jié)構(gòu)同源模建

表27　種豆科植物抗菌肽的信號(hào)肽與拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析Table 2　Signal peptide and topological structure of antimicrobial peptides from seven kinds of leguminous plants

由表3可知，大豆和野生大豆抗菌肽與模板硫堇（γ-1-p thionin）的序列相似度為46.81%。綠豆和那卡豆與模板植物防御素（plant defensin）的序列相似度達(dá)到100.00%，即可以鑒定為同一蛋白。紅豆變種和赤小豆與模板植物防御素的序列相似度為78.26%，豇豆抗菌肽與模板植物防御素的序列相似度為73.91%，可以推斷這3種植物抗菌肽與植物防御素高度同源?？咕牡鞍缀湍０逑嗨贫鹊谋葘?duì)結(jié)果與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析（圖3）所示的同源聚類(lèi)情況基本一致，推測(cè)大豆與野生大豆抗菌肽進(jìn)化方向?yàn)榱蜉?，與其他5種豆科植物的同源蛋白（植物防御素）雖然有較高的序列相似性，但進(jìn)化方向出現(xiàn)了明顯的分支。

表37　種豆科植物抗菌肽同源模建模板Table 3　Homology modeling templates of antimicrobial peptides from seven kinds of leguminous plants

以表3所列蛋白作為模板，采用SWISS-MODEL對(duì)豆科植物抗菌肽進(jìn)行同源模建，繪制蛋白3D圖像如圖4所示，7種蛋白具有相似的3D結(jié)構(gòu)，均由一組β-折疊和一個(gè)α-螺旋組成，大豆抗菌肽和野生大豆抗菌肽空間結(jié)構(gòu)上非常接近，另外5種抗菌肽蛋白空間結(jié)構(gòu)相似性較高。圖4（C、D、E、F、G）所示5種植物抗菌肽的空間結(jié)構(gòu)與BROEKAERT W F等[24]展示的植物防御素（Rs-AFP1）非常相近，Rs-AFP1來(lái)自于十字花科蘿卜種子。結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)、序列相似度和蛋白3D結(jié)構(gòu)分析，推斷豆科植物中存在與植物防御素、硫堇蛋白序列空間結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)，這類(lèi)蛋白可能參與了豆科植物抵御病原微生物入侵的生理過(guò)程，即為抗菌肽。從空間結(jié)構(gòu)上解析豆科植物抗菌肽，為后續(xù)抗菌肽晶體結(jié)構(gòu)解析，蛋白活性位點(diǎn)改造和蛋白穩(wěn)定性分子改造提供了重要數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，同時(shí)也為抗菌肽殺菌機(jī)制的研究提供了理論參考。

圖4　7種豆科植物抗菌肽蛋白的同源模建3D圖Fig.4　3D homology modeling of antimicrobial peptides from seven kinds of leguminous plants

2.6豆科植物抗菌肽亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位

采用在線工具Plant-mPLoc對(duì)幾種豆科植物的抗菌肽進(jìn)行亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位，結(jié)果如表4所示。由表4可知，大豆、赤小豆抗菌肽定位于液泡，野生大豆的抗菌肽定位于細(xì)胞核和液泡，紅豆變種的抗菌肽定位于細(xì)胞核，綠豆和那卡豆的抗菌肽定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞核。結(jié)合7種豆科植物抗菌肽的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，推斷抗菌肽位于上述亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的膜上。這一結(jié)果對(duì)于研究植物抗菌肽殺菌機(jī)制的進(jìn)化過(guò)程以及建立豆科植物抗菌肽分離提取方案具有參考意義。汪少蕓等[16]從豆科植物入手，研究了植物、動(dòng)物的防御蛋白及其進(jìn)化趨勢(shì)，驗(yàn)證了生物功能分子效率與進(jìn)化趨勢(shì)相關(guān)聯(lián)的理論。董璐[15]從脫脂大豆中提取了大豆球蛋白堿性抗菌肽（glycinin basic antibacterial peptide，GBAP），并研究了GBAP對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜的影響，驗(yàn)證了GBAP對(duì)冷藏鮮肉中微生物的抑制作用；堿性抗菌肽的提取進(jìn)一步證實(shí)了生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)大豆抗菌肽為堿性蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確性。這一研究表明大豆抗菌肽在食品保鮮有重要應(yīng)用前景，也提示大豆抗菌肽的存在對(duì)于以大豆為主要原料的調(diào)味食品發(fā)酵有重要影響，需要關(guān)注發(fā)酵過(guò)程中大豆抗菌肽含量和性質(zhì)變化，并評(píng)估對(duì)發(fā)酵微生物生長(zhǎng)代謝的影響。

表47　種豆科植物抗菌肽亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位Table 4　Subcellular structure localization of antimicrobial peptides from seven kinds of leguminous plants

3　結(jié)論

7種豆科植物的抗菌肽序列相似度為71.49%，具有20個(gè)完全一致的氨基酸保守位點(diǎn)；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明7種不同豆科植物抗菌肽的親緣關(guān)系較近。蛋白理化性質(zhì)分析表明7種豆科植物均為堿性蛋白質(zhì)，具有一定的親水性；拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析預(yù)測(cè)抗菌肽成熟肽段均為非胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，推測(cè)抗菌肽為膜結(jié)合蛋白；同源模建表明豆科植物抗菌肽3D結(jié)構(gòu)與硫堇、植物防衛(wèi)素蛋白結(jié)構(gòu)相似；通過(guò)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位分析認(rèn)為，7種豆科植物抗菌肽定位于液泡膜、細(xì)胞核膜或者細(xì)胞膜上，不同種豆科植物的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位存在差異。豆科植物抗菌肽的序列分析和生物信息學(xué)預(yù)測(cè)為進(jìn)一步研究豆科植物抗菌肽的分離提取、生理生化性質(zhì)研究，及其在食品保鮮和食品發(fā)酵領(lǐng)域的應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

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Bioinformatics prediction and analysis of antimicrobial peptides from leguminous plants

ZOU Mouyong,ZHU Xingui*
(Lee Kum Kee(Xinhui)Foods Co.,Ltd.,Jiangmen 529100,China)

Plant antimicrobial peptides,existing in plant tissue and cell,are micromolecule proteins for resisting foreign invasion.They have the capacity of resisting and killing a variety of bacterium and fungi.With the improvement of health consciousness and advance of technology,exploring and application of plant antimicrobial peptides become an important research aspect in the field of food development.In the test,seven antimicrobial peptides of leguminous plants were screened from protein database,and multiple alignment and phylogenetic tree analysis were conducted.The hydrophobicity,topologicaldomain,protein 3D structure,subcellular structure localization of plant antimicrobial peptides were predicted and analyzed by bioinformatics tools.It showed that the similarity of antimicrobial peptides sequence of seven leguminous plants,which had eight conserved sites of cysteines,was 71.94%.They were alkaline membrane binding proteins which distributed on tonoplast,nuclear membrane or cytomembrane.The 3D structures were constituted by a group of β-sheets and a α-helix,and the structure similarity was found among thionin,plant defensin.

leguminous plant;plant antimicrobial peptides;bioinformatics;prediction

TS202.1

0254-5071（2016）10-0135-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.030

2016-06-18

鄒謀勇（1987-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)檎{(diào)味品發(fā)酵技術(shù)與產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。

朱新貴（1967-），男，博士，副教授，研究方向?yàn)檎{(diào)味品科學(xué)與技術(shù)。