焦玉雙，王冕，王如福*

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷030801）

海藻酸鈉-阿拉伯膠固定化酸性蛋白酶及其性質(zhì)的研究

焦玉雙，王冕，王如福*

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷030801）

以海藻酸鈉（SA）與阿拉伯膠（GA）為載體固定化酸性蛋白酶，以酶活回收率為評價指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化固定化條件。得到以SA-AG復(fù)合凝膠為載體制備固定化酸性蛋白酶的最佳工藝條件為：復(fù)合凝膠質(zhì)量濃度3.5 g/100 mL，SA與AG質(zhì)量比2∶1，氯化鈣質(zhì)量濃度7.0 g/100 mL，固定化時間1.0 h，給酶量1 540 U/g，吸附時間2.0 h，酶液pH值為3.0。此最佳條件下，固定化酸性蛋白酶酶活回收率為67.34%，酶活力為1 380 U/g。固定化酶酶學(xué)性質(zhì)的研究結(jié)果表明，固定化酸性蛋白酶的最適作用溫度（45℃）和最適反應(yīng)pH值（pH=3）均與游離酶相同，但其熱穩(wěn)定性優(yōu)于游離酶，且隨著溫度的升高這種優(yōu)勢越明顯。

酸性蛋白酶；固定化酶；海藻酸鈉；阿拉伯膠

酸性蛋白酶是指具有較低的最適pH值的蛋白酶，一般pH值在2.0～5.0，酸性蛋白酶在食品工業(yè)中最主要的應(yīng)用是在酒類、醬油和食醋的釀造等方面[1-4]。游離蛋白酶直接應(yīng)用于生產(chǎn)，不利于再次回收利用，同時也可能會對產(chǎn)品造成一定的污染。固定化技術(shù)是20世紀(jì)50年代發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù)，固定化酶技術(shù)就是用載體將游離酶束縛在一定空間里，但不影響其特有的催化作用的一項(xiàng)技術(shù)，相較游離酶具有易于控制、易于分離、可重復(fù)使用的優(yōu)點(diǎn)[5]。目前傳統(tǒng)的酶固定化的方法主要有吸附法、共價結(jié)合法、包埋法及交聯(lián)法四大類[6]，其中吸附法制備固定化酶因其操作簡單、載體選擇范圍較廣、固定化操作過程簡單、制備條件溫和、不易破壞酶分子的高級結(jié)構(gòu)以及活性中心的構(gòu)象且酶活回收率較高、載體可回收重復(fù)利用[7]等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。

海藻酸鈉（sodium alginate，SA）是從海帶中提取的天然多糖碳水化合物，易溶于水且易與一些二價陽離子相結(jié)合形成凝膠[8]。阿拉伯膠（Arabic gum，AG）是應(yīng)用最廣泛的一種樹膠，有很好的酸穩(wěn)定性[9]。二者均為食品級天然膠體，安全無毒、廉價易得，在營養(yǎng)學(xué)、醫(yī)學(xué)、食品工業(yè)等方面具有廣泛的應(yīng)用[10-12]。

目前，有較多關(guān)于使用海藻酸鈉制備固定化載體材料的研究。李曉卉等[13]以海藻酸鈉和明膠為載體，對L-阿拉伯糖異構(gòu)酶進(jìn)行固定，得到性能較穩(wěn)定的固定化酶；張富新等[14]研究了中性蛋白酶在海藻酸鈉中的固定化技術(shù)，并確定了最佳固定化工藝條件；崔松松等[15]以海藻酸鈉為載體、戊二醛為交聯(lián)劑，制備固定化生姜蛋白酶，制得與游離酶相比對溫度和酸堿適應(yīng)范圍更加寬泛的固定化生姜蛋白酶。而將SA-AG作為固定化載體材料的研究較少。王冕等[16]以SA與AG為載體固定化糖化酶，研究出最佳制備工藝條件，并得到熱穩(wěn)定性及操作穩(wěn)定性均較強(qiáng)的固定化酶。

本試驗(yàn)以海藻酸鈉和阿拉伯膠復(fù)合制備酶的固定化載體，采用吸附法制得固定化酸性蛋白酶。研究了復(fù)合凝膠濃度、SA與AG質(zhì)量比、氯化鈣濃度、固化時間、給酶量、吸附時間等因素對固定化效果的影響，并對所制得的酸性蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，為固定化酸性蛋白酶的實(shí)際應(yīng)用提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

酸性蛋白酶（50 000 U/g）：蘇柯漢生物工程有限公司；海藻酸鈉：青島邁潮海洋科技發(fā)展有限公司；阿拉伯膠：艾納提化工科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

TGL-20MG高速臺式冷凍離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；PHSJ-3F型pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；BS210S萬分之一電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；85-2型恒溫磁力攪拌器：上海思樂儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1固定化酸性蛋白酶的制備方法[17]

（1）以載體溶液總體積30 mL計(jì)，設(shè)定復(fù)合凝膠質(zhì)量濃度2.0 g/100 mL，SA與AG質(zhì)量比1∶1，稱取膠體于50～60℃蒸餾水中溶解，混合均勻，超聲波快速消泡至復(fù)合凝膠中無氣泡。

（2）使用10 mL醫(yī)用注射器以約1滴/s的速度，將復(fù)合凝膠滴到濃度為5.0 g/100 mL的氯化鈣溶液中，在4℃冰箱中固化1.0 h，用紗布濾出載體顆粒，并用pH值為3.0的乳酸-乳酸鈉緩沖液沖洗3～5次除去表面的氯化鈣。

（3）用濾紙吸干表面水分，放入pH值3.0、給酶量1 760 U/g的酶液中吸附1.0 h后用紗布濾出固定化顆粒，用緩沖液清洗，并用濾紙吸干表面的水分，制成球狀顆粒，即得固定化酶，0～4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2酸性蛋白酶固定化條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

設(shè)定復(fù)合凝膠質(zhì)量濃度分別為2.0 g/100 mL、2.5 g/100 mL、3.0 g/100 mL、3.5 g/100 mL、4.0 g/100 mL、4.5 g/100 mL，SA與GA質(zhì)量比分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1，氯化鈣質(zhì)量濃度分別為5.0g/100mL、6.0g/100mL、7.0g/100mL、8.0g/100mL、9.0 g/100mL，固定化時間分別為0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h，給酶量分別為1 100 U/g、1 320 U/g、1 540 U/g、1760U/g、1980U/g、2200U/g，吸附時間分別為1.0h、1.5h、2.0 h、2.5 h、3.0 h，酶液pH值分別為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5，考察復(fù)合凝膠質(zhì)量濃度、SA與AG質(zhì)量比、氯化鈣質(zhì)量濃度、固定化時間、給酶量、吸附時間、酶液pH值對酶活回收率的影響。

1.3.4酸性蛋白酶固定化條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇對固定化過程影響較大的3個因素，每個因素設(shè)定3個水平，以酶活回收率為評價指標(biāo)，采用L9（33）正交設(shè)計(jì)對固定化條件進(jìn)行優(yōu)化，正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1　酸性蛋白酶固定化條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1　Factors and levels of orthogonal experiments for conditions optimization of acid protease immobilization

1.3.3固定化酸性蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)的研究

（1）最適反應(yīng)pH值

在不同pH的緩沖液中，以1%酪蛋白為底物，放入一定量的固定化酶及游離酶，30℃保溫振蕩反應(yīng)10 min，測定固定化酶和游離酶的酶活。

（2）最適作用溫度

取一定量的固定化酶及游離酶，以1%酪蛋白為底物，不同溫度條件下，在上一步得到的酶最適反應(yīng)pH緩沖液中保溫振蕩反應(yīng)10 min，測定其酶活。

（3）熱穩(wěn)定性

取一定量的固定化酶于pH 3.0的緩沖液中，在不同溫度條件下加熱處理30 min后，迅速冷卻。在固定化酶最適作用溫度條件下，測定其酶活。

1.3.4游離酸性蛋白酶活力的測定

酶活力測定采用國標(biāo)GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》中的福林-酚法。

酸性蛋白酶活力定義：單位質(zhì)量的酸性蛋白酶在溫度為40℃，pH 3.0條件下，1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸為1個酶活力單位（U）。樣品的酸性蛋白酶活力按下式計(jì)算：

式中：X為樣品的酶活力，U/g；A為由酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的樣品最終稀釋液的酶活力，U/mL；V為溶解樣品所使用的容量瓶的體積，mL；N為樣品稀釋倍數(shù)；4為反應(yīng)試劑總體積，mL；為酶液分解酪蛋白的反應(yīng)時間1為10 min，以1 min計(jì)。

L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：分別配制L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為0、10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL，以波長680 nm處吸光度值（y）作縱坐標(biāo)，酪氨酸的質(zhì)量濃度（x）作橫坐標(biāo)，繪制L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算其回歸方程。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中酸性蛋白酶活力

1.3.5酶活回收率及相對酶活的計(jì)算

固定化酶所顯示的活力占加入酶液中酶的總活力的

百分?jǐn)?shù)為固定化酶的活力回收率。其計(jì)算公式如下：

相對酶活是指以同組最高酶活為參照，計(jì)算出的比值為相對酶活，設(shè)定同組酶活力最高的相對酶活為100%。其計(jì)算公式如下：

2　結(jié)果與分析

2.1酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

以吸光度值（y）作縱坐標(biāo)，酪氨酸的質(zhì)量濃度（x）作橫坐標(biāo)，繪制L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。由圖1可知，L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.010 4x+0.008 4，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 2，表明二者線性關(guān)系良好。

圖1　酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of tyrosine

2.2載體選擇及固定化條件對固定化酸性蛋白酶活力的影響

2.2.1復(fù)合凝膠濃度對酸性蛋白酶固定化效果的影響

圖2　復(fù)合凝膠質(zhì)量濃度對固定化酶活回收率的影響Fig.2　Effect of composite gel content on the recovery rate of immobilized enzymes activity

由圖2可知，在較低凝膠質(zhì)量濃度時，隨著復(fù)合凝膠質(zhì)量濃度的增加固定化酶酶活回收率增加；當(dāng)復(fù)合凝膠質(zhì)量濃度達(dá)到3.5 g/100 mL時酶活回收率達(dá)到最大，之后隨著凝膠質(zhì)量濃度的增加酶活回收率開始降低，這是由于當(dāng)凝膠質(zhì)量濃度過大時其表面空隙過于緊密，不利于酶的吸附。因此，最佳復(fù)合凝膠質(zhì)量濃度為3.5 g/100 mL

2.2.2SA-AG比例對酸性蛋白酶固定化效果的影響

由圖3可知，隨著SA-AG凝膠比例的增加酶活回收率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在凝膠質(zhì)量比為3∶1時酶活回收率達(dá)到最大。因此，最佳SA-AG凝膠質(zhì)量比為3∶1。

圖3　SA-AG凝膠質(zhì)量比對固定化酶活回收率的影響Fig.3　Effect of SA-AG mass ratios on the recovery rate of immobilized enzymes activity

2.2.3氯化鈣質(zhì)量濃度對酸性蛋白酶固定化效果的影響

由圖4可知，隨著氯化鈣質(zhì)量濃度的增大，固定化酶酶活回收率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，并在氯化鈣質(zhì)量濃度為7.0 g/100 mL時達(dá)到最大，這是因?yàn)镾A與氯化鈣作用是由于離子強(qiáng)度所決定，同時離子濃度會影響AG的分子結(jié)構(gòu)，從而影響其效果[18-19]。因此，隨著離子強(qiáng)度的增強(qiáng)，作用越明顯；而當(dāng)離子強(qiáng)度過大時，酶會受到影響而發(fā)生失活，表現(xiàn)為酶活回收率的降低。因此，最佳氯化鈣質(zhì)量濃度為7.0 g/100 mL。

圖4　氯化鈣質(zhì)量濃度對固定化酶活回收率的影響Fig.4　Effect of calcium chloride content on the recovery rate of immobilized enzymes activity

2.2.4固定化時間對酸性蛋白酶固定化效果的影響

由圖5可知，隨著固定化時間的延長，固定化酶酶活回收率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，且在固定化時間為1.0 h時達(dá)到最大。這是由于隨著固定化時間的延長，載體的結(jié)構(gòu)受到影響，對酶的吸附作用增強(qiáng)，酶活回收率增大；而當(dāng)時間過長時固定化顆粒浸泡在氯化鈣溶液中的時間較長，受Ca2+和Cl-影響的時間較長，導(dǎo)致酶活力下降。因此，最佳固定化時間為1.0 h。

圖5　固定化時間對固定化酶活回收率的影響Fig.5　Effect of immobilized time on the recovery rate of immobilized enzymes activity

2.2.5給酶量對酸性蛋白酶固定化效果的影響

由圖6可知，隨著給酶量的增加，給酶量為1 540～2 200 U/g時，酶活回收率呈下降趨勢，相對酶活呈先增加后減小的趨勢，相對酶活呈先增加后減小的趨勢，并在給酶量為1 760 U/g時達(dá)到最高，在給酶量為1 540 U/g時，酶活回收率和相對酶活均處于較高水平，分別為87.2%和86%。這是由于給酶量的增加不利于酶被載體充分吸附，導(dǎo)致酶活回收率的降低；而一定質(zhì)量的載體可吸附的酶量有限，當(dāng)載體的吸附酶量達(dá)到飽和后繼續(xù)增加給酶量反而會影響酶的繼續(xù)吸附效果，所以相對酶活呈先增加后減小的趨勢。因此，綜合考慮酶活回收率和固定化酶相對酶活兩個指標(biāo)，確定最佳給酶量為1 540 U/g載體。

圖6　給酶量對固定化酶活回收率的影響Fig.6　Effect of the enzyme addition on the recovery rate of immobilized enzymes activity

2.2.6吸附時間對酸性蛋白酶固定化效果的影響

由圖7可知，吸附時間在1.0～3.0 h，固定化酶酶活回收率呈先增大后減小的趨勢；在吸附時間為2.0 h時，固定化酶酶活回收率達(dá)到最大值；吸附時間＞2.0 h時，固定化酶酶活回收率有所下降。因此，最佳吸附時間為2.0 h。

圖7　吸附時間對固定化酶活回收率的影響Fig.7　Effect of absorption time on the activity recovery rate of immobilized enzymes

2.2.7酶液pH值對酸性蛋白酶固定化效果的影響

由圖8可知，pH值在2.5～4.5，固定化酶酶活回收率呈先增大后減小的趨勢；在pH值為3.0時固定化酸性蛋白酶活力最大；pH值＞3.0，固定化酶酶活回收率有所下降。因此，最佳pH值為3.0。

圖8　酶液pH值對固定化酶活回收率的影響Fig.8　Effects of pH of the enzyme solution on the activity recovery rate of immobilized enzymes

2.3正交試驗(yàn)優(yōu)化固定化工藝條件

表2　酸性蛋白酶固定化條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2　Results and analysis of orthogonal experiments for conditions optimization of immobilized acid protease

續(xù)表

由表2可知，影響因素的主次順序?yàn)锽＞A＞C，即氯化鈣質(zhì)量濃度＞SA-AG質(zhì)量比＞固定化時間。固定化酶的理論最優(yōu)水平為A1B2C2，即當(dāng)SA-AG質(zhì)量比為2∶1，氯化鈣質(zhì)量濃度為7.0 g/100 mL，固定化時間為1.0 h時，固定化酶的酶活回收率達(dá)到最高，為67.34%。

2.4固定化酶酶學(xué)性質(zhì)的研究

2.4.1固定化酸性蛋白酶的最適作用溫度

由圖9可知，固定化酶和游離酶在不同的作用溫度下相對酶活有一定的差異，當(dāng)作用溫度為45℃時，兩種酶的酶活均達(dá)到最大。因此，固定化酶的最適溫度為45℃。

圖9　游離酶和固定化酶的最適作用溫度Fig.9　Optimum temperature of free enzyme and immobilized enzymes

2.4.2固定化酸性蛋白酶的最適反應(yīng)pH值

圖10　游離酶和固定化酶的最適pH值Fig.10　Optimum pH of free enzyme and immobilized enzymes

由圖10可知，固定化酶和游離酶的最適反應(yīng)pH值均為3.0，且在相同pH值的情況下固定化酶的相對酶活均高于游離酶，證明經(jīng)過固定化的酸性蛋白酶的pH穩(wěn)定性有所提高。因此，固定化酶的最適pH值為3.0。

2.4.3固定化酸性蛋白酶的熱穩(wěn)定性

由圖11可知，隨著溫度的升高，固定化酶和游離酶的酶活力均有所下降，且隨著溫度的升高固定化酶相對酶活高于游離酶的趨勢越明顯，證明固定化酶的熱穩(wěn)定性要高于游離酶。

圖11　游離酶和固定化酶的熱穩(wěn)定性Fig.11　Thermostability of free enzyme and immobilized enzymes

3　結(jié)論

SA-AG復(fù)合凝膠為載體制備固定化酸性蛋白酶的最佳工藝條件為：復(fù)合凝膠質(zhì)量濃度3.5 g/100 mL，SA-AG質(zhì)量比為2∶1，氯化鈣質(zhì)量濃度為7.0 g/100 mL，固定化時間為1.0 h，給酶量為1 540 U/g，吸附時間為2.0 h，酶液pH值為3.0。

通過對固定化酸性蛋白酶與游離酶酶學(xué)性質(zhì)的研究得出：固定化酶和游離酶的最適pH均為3.0，最適作用溫度為45℃，而且固定化酶的熱穩(wěn)定性則明顯優(yōu)于游離酶。

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Immobilization of acid protease with sodium alginate-Arabic gum and study of protease properties

JIAO Yushuang,WANG Mian,WANG Rufu*
(College of Food Science and Engineering,Shanxi Agricultural University,Taigu 030801,China)

Using the sodium alginate(SA)and Arabic gum(AG)as carrier to immobilize acid protease,and using enzyme activity recovery rate as the evaluation index,the immobilization conditions were optimized by orthogonal experiments on the basis of single factor experiments.The result s showed that the optimum technological conditions of acid protease immobilization with SA-AG composite gel as the carrier were composite gel content 3.5 g/100 ml,SA-AG mass ratio 2∶1,calcium chloride content 7.0 g/100 ml,immobilization time 1.0 h,enzyme addition 1 540 U/g,adsorption time 2.0 h,pH of enzyme liquid 3.0.Under the conditions,the recovery rate of immobilized acid protease activity was 67.34%,and enzyme activity 1 380 U/g.The research results of immobilized enzyme properties showed that the optimal temperature(45℃)and the optimal pH(3.0)of immobilized acid protease were the same as the free enzyme.The thermal stability of immobilized acid protease was better than that of the free enzyme,and this advantage was more and more obvious with the increase of temperature.

acid protease;immobilized enzyme;sodium alginate;Arabic gum

Q814

0254-5071（2016）10-0062-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.014

2016-06-21

山西省科技重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2015-TN-10）

焦玉雙（1989-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵食品工藝、果蔬采后生理及貯運(yùn)技術(shù)。

王如福（1960-），男，教授，博士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵食品工藝、果蔬采后生理及貯運(yùn)技術(shù)。