丁城,高冰,劉璐,胡勇*

（1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北武漢430068；2.工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢430068；3.湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，湖北武漢430068）

紫外誘變選育醋酸菌及其發(fā)酵梨醋風(fēng)味研究

丁城1,2,3,高冰1,2,3,劉璐1,2,3,胡勇1,2,3*

（1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北武漢430068；2.工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢430068；3.湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，湖北武漢430068）

本實驗探究了醋酸菌Hg109、Hg214、Hg105和Hg215產(chǎn)醋酸的能力。以產(chǎn)酸最高的菌株Hg109為出發(fā)菌，利用紫外進行誘變，以產(chǎn)醋酸量作為衡量指標(biāo)，通過篩選獲得遺傳性穩(wěn)定、高產(chǎn)醋酸菌株Hg110。以菌株Hg110為發(fā)酵菌株，進行梨醋發(fā)酵，利用氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）對梨醋進行了風(fēng)味分析，共得到35種化合物，其中酯類最多（13種），其次是醇類（9種）、醛類（3種）、酮類（2種）、酸類（2種）以及其他類（8種）。

醋酸菌；選育；紫外誘變；風(fēng)味分析

我國是食醋生產(chǎn)大國，而醋酸菌是生產(chǎn)食醋必不可少的微生物，目前，醋酸菌可以分為10個屬，59個不同種[1-3]。在發(fā)酵中，主要是葡糖酸醋桿菌屬和醋酸桿菌屬，葡糖酸醋桿菌是將葡萄糖氧化為葡萄糖酸，而醋酸桿菌主要用于食醋發(fā)酵[4-5]。醋酸菌是好氧菌，在發(fā)酵過程中，氧氣對醋酸菌影響較大，在一定條件下，醋酸菌利用自身酶系將乙醇進一步轉(zhuǎn)化為乙酸以及CO2和H2O、乳酸、丙酸等物質(zhì)[6-7]。

食醋的品種已經(jīng)越來越多，原料也多元化，以水果為原料釀造成果醋，已經(jīng)成為全球熱點[8]。目前國內(nèi)對果醋菌種，優(yōu)勢菌種的開發(fā)和保藏研究較少，菌種選育也存在大量問題。在果醋釀造中，醋酸菌菌種是生產(chǎn)的關(guān)鍵，優(yōu)良的醋酸菌種可以提高生產(chǎn)量、減少成本、降低食品危害成分[9]。梨是一種營養(yǎng)豐富的水果，具有廣闊的發(fā)展前景，對其果實及果醋產(chǎn)品的研究有利于梨產(chǎn)業(yè)的發(fā)展及推動作用[10]。

因此，本研究以醋酸菌為研究對象，通過紫外誘變，獲得高產(chǎn)醋酸的醋酸菌菌種，并且將獲得誘變菌株用于梨醋發(fā)酵，并采用氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法對梨醋的香氣成分進行分析，旨在為梨醋在發(fā)酵過程中產(chǎn)生特殊香氣成分提供相關(guān)理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

醋酸菌Hg109、Hg214、Hg105、Hg215：本實驗室儲藏。酵母浸膏（生化試劑）：安琪酵母股份有限公司；瓊脂粉：華順生物技術(shù)有限公司；氫氧化鈉、葡萄糖、碳酸鈣、無水乙醇、溴甲酚綠（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；砂梨：購買于農(nóng)貿(mào)市場。

1.2儀器與設(shè)備

Agilent GC7890/MS5975氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent公司；手動SPME進樣器、75/CarboxenTM-PDMS固相微萃取頭：美國Supelco公司；ZHWY-2102C恒溫搖床培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器有限公司；PHX-280H智能生化培養(yǎng)箱：寧波萊?？萍加邢薰?；Unico2000可見分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司；303-2電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海崇明實驗儀器廠；HY0155血細胞計數(shù)板：上海求精生化儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1培養(yǎng)基制備

種子兼富集培養(yǎng)基：1%葡萄糖，1%酵母膏，1.5%CaCO3，使用前加入2%（V/V）無水乙醇，pH自然。

篩選培養(yǎng)基：1%葡萄糖，1%酵母膏，1.5%CaCO3，2%瓊脂，使用前加入2%（V/V）無水乙醇，0.022%溴甲酚綠，pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：1%葡萄糖，1%酵母膏，1.5%CaCO3，使用前加入6%（V/V）無水乙醇，pH自然，培養(yǎng)基在121℃下，滅菌20 min。

1.3.2菌種活化液的制備以及發(fā)酵培養(yǎng)方法

裝液量為100 mL/250 mL種子兼富集液體培養(yǎng)基中，將斜面菌種Hg109、Hg214、Hg105、Hg215分別接種于培養(yǎng)基中，在30℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)2 d后，再將菌種活化液按4%接種量接種于裝液量為100 mL/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)5 d。

1.3.3菌株產(chǎn)酸量測定

精密量取3.0 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中菌液于250 mL錐形瓶中，加50 mL水，滴加1～2滴酚酞試劑，邊攪拌邊用堿式滴定管滴入氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液進行滴定，當(dāng)溶液由無色變?yōu)榉奂t色時停止滴加，讀取氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液消耗的體積。總酸[10]含量計算公式如下：

式中：X為樣品中總酸（以醋酸計）含量，g/L；C為NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度，0.1 mol/L；V0為空白試驗消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL；V為樣品滴定時消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL；V樣為樣品的體積，mL。

1.3.4紫外線致死曲線繪制

（1）菌懸液的制備

取活化48～60 h處于對數(shù)生長期的醋酸菌種子活化液，用血細胞計數(shù)板顯微鏡直接計數(shù)法計數(shù)，用生理鹽水調(diào)整細胞濃度約108個/mL[11]。

（2）紫外誘變處理

取上述108個/mL級的菌懸液10 mL至裝有磁力轉(zhuǎn)子的培養(yǎng)皿中，將紫外線開關(guān)打開，預(yù)熱約20 min，在功率為15 W的紫外燈下20 cm處，攪拌狀態(tài)下照射處理0、1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min、9 min。將紫外誘變后的菌懸液在紅燈下取1 mL至9 mL無菌生理鹽水中，依次10倍稀釋成10-4、10-6和10-8。每個稀釋度菌液取0.1 mL分別用無菌玻璃涂棒均勻地涂于篩選培養(yǎng)基上，用不透光的紙將上述篩選平板包好，置于30℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5 d。

1.3.5篩選正突變菌株

從培養(yǎng)誘變菌株中挑取透明圈大的菌株，同時測量透明圈直徑，30℃培養(yǎng)48 h。按方法1.3.3進行總酸測定，篩選出產(chǎn)酸量最高的突變菌株，用于遺傳穩(wěn)定性試驗。

1.3.6梨醋發(fā)酵加工工藝流程

新鮮砂梨→去皮、去核→切塊→榨汁→果膠酶處理→過濾→調(diào)糖、酸度→接種活化酵母菌→酒精發(fā)酵→接種活化醋酸菌→醋酸發(fā)酵→梨醋→澄清→過濾→滅菌→成品

1.3.7操作要點

梨汁的制備：將新鮮的梨清洗，切碎后稱質(zhì)量。按梨∶水為2∶1進行榨汁，將配制好的1%果膠酶液加入梨汁中，添加量為0.3%（按梨汁的重量）置于50℃酶解2 h。

酒精質(zhì)酵：準(zhǔn)確稱量20 g酵母粉，用100 mL無菌水充分混勻，放入30℃培養(yǎng)箱中活化20 min。將活化好的酵母液加入梨汁中，添加量為5%（按梨汁的質(zhì)量），充分?jǐn)嚢韬?，密封，發(fā)酵四天，溫度控制在25℃～30℃。

醋酸發(fā)酵：將上述獲得的梨酒，調(diào)節(jié)乙醇濃度為6%，接種活化醋酸菌液4.5%，在轉(zhuǎn)速160 r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)，每隔12 h測定其總酸。

梨醋澄清：將得到的梨醋，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的明膠和殼聚糖（比例為7∶3），在30℃下靜置6 h。

1.3.8梨醋感官評價

將梨汁按照上述工藝流程進行發(fā)酵制作梨醋，一共10位鑒定員對梨醋品嘗后進行嗅覺和味覺評定[12]，滿分為100分，梨醋評價標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1　梨醋感官品評標(biāo)準(zhǔn)Table 1　Sensory evaluation standards of pear vinegar

1.3.9梨醋風(fēng)味成分GC-MS分析

（1）梨醋風(fēng)味成分采集

取10 mL待測樣品，將固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）萃取頭插入樣品瓶中，萃取時，萃取頭與待測樣品液面每次都要保持在同一水平，并將其放入52℃的集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中水浴平衡5min，保溫40min，攪拌速度為20 r/min，再將萃取頭插入GC-MS儀器進樣口解吸5 min，同時啟動GC-MS采集數(shù)據(jù)。

（2）GC-MS檢測條件

色譜條件：DB-5ms毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），程序升溫：初溫40℃以5℃/min的速率升溫到130℃，保持2 min，再以8℃的速率升溫到250℃，保持1 min。進樣口溫度為250℃，不分流；載氣為氦氣（He）；流速為1.0 mL/min[13-14]。

質(zhì)譜條件：電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源，離子源溫度為230℃，傳輸線280℃，四級桿150℃[13-14]，掃描質(zhì)量范圍50～350 amu。

（3）定性定量的方法

定性方法：利用隨機標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索分析，參考相關(guān)資料對結(jié)果進行核對和確認(rèn)。

定量方法：采用峰面積歸一化法求各成分的相對含量。

2　結(jié)果與分析

2.1醋酸菌產(chǎn)酸量

表2　醋酸菌的產(chǎn)酸量Table 2　Acetic acid yield of acetic acid bacteria

實驗室儲藏的4株醋酸菌產(chǎn)酸量，如表2所示，四株菌經(jīng)過連續(xù)多次發(fā)酵，在5 d后產(chǎn)酸量保持穩(wěn)定，平均產(chǎn)酸量分別為20.48 g/L、19.65 g/L、18.31 g/L、19.83 g/L。因此，以產(chǎn)酸最高的Hg109為出發(fā)菌株進行紫外誘變育種。

2.2菌株紫外線致死曲線

圖1　紫外線對出發(fā)菌Hg109致死率曲線Fig.1　Lethality curve of original strain Hg109 by ultraviolet light

菌株Hg109培養(yǎng)48 h的種子液取10 mL進行紫外誘變，紫外線致死率曲線見圖1。由圖1可知，菌株Hg109的致死率與紫外處理時間呈正相關(guān)，1 min紫外線處理劑量致死率約為19%、2 min致死率約為36%、3 min致死率約為54%、4 min致死率約為69%、5 min致死率約為80%、9 min致死率為100%。

紫外照射的致死率在75%～85%時，菌株誘變效果較好[15]，將4%誘變菌株菌液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，以未經(jīng)處理的醋酸菌接入發(fā)酵培養(yǎng)基作為空白對照，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)5 d。透明圈與產(chǎn)酸量呈正比，選取透明圈相對較大的10株醋酸菌菌株活化培養(yǎng)，采用直接滴定法測定醋酸菌的產(chǎn)酸量，測定結(jié)果見表3。

表310　株誘變醋酸菌產(chǎn)酸性能測定結(jié)果Table 3　Determination results of acid-producing performance of 10 strains mutation acetic acid bacteria

由表3可知，10種醋酸菌菌株產(chǎn)酸量差異很大，其中7號菌株產(chǎn)酸最大，產(chǎn)酸量達到（25.94±0.086）g/L，因此，選擇7號菌株活化保藏，并編號為Hg110。

2.3誘變菌株Hg110遺傳穩(wěn)定性

將誘變菌株Hg110種子活化液分別按4%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃條件下靜置培養(yǎng)5 d，測定菌株Hg110的產(chǎn)酸量，結(jié)果見圖2。

圖2　突變菌株Hg110遺傳穩(wěn)定性Fig.2　Genetic stability of mutant strain Hg110

由圖2可知，誘變菌株Hg110平均產(chǎn)酸量測定結(jié)果為25.94 g/L，將醋酸產(chǎn)量進一步提高的誘變菌株連續(xù)5次傳代，用直接滴定法測得每代醋酸產(chǎn)量分別為：25.85 g/L、25.96g/L、25.78g/L、25.83g/L、25.97g/L，表明突變菌株Hg110遺傳性相對穩(wěn)定。

2.4梨醋感官評價及理化指標(biāo)

按照表1要求，10位鑒定員對梨醋進行了打分，并檢測了梨醋相關(guān)理化指標(biāo)。梨醋清澈、透明，有濃郁的醋香和酯香，口感柔和、醇厚綿長，醋體清亮無雜質(zhì)無沉淀，平均感官得分為93.4分。梨醋中總酸、總糖、維生素C、多酚和黃酮含量依次為23.96 g/L、9.83 g/L、185.78 mg/L、18.16 μg/L和25.17 μg/L。

2.6梨醋風(fēng)味成分的GC-MS分析

采用固相微萃取與GC-MS聯(lián)用，對梨醋的揮發(fā)性香氣成分進行檢測分析，其風(fēng)味成分GC-MS分析總離子流色譜圖見圖3，分析鑒定結(jié)果見表4。

圖3　梨醋風(fēng)味成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.3　Total ions chromatogram of flavor components in pear juice vinegar analysis by GC-MS

表4　梨醋中香氣成分GC-MS分析結(jié)果Table 4　GC-MS analysis results of flavor components in pear vinegar

續(xù)表

試驗報道匹配度均大于60（最大值100）的鑒定結(jié)果如表4所示。由圖4可知，從梨醋中一共鑒定出35種香氣成分，包括酯類（13種）、醇類（9種）、酸類（2種）、酮類（2種）、醛類（3種）及其他類（8類），主要有正己酸乙酯（17.470%），2-乙基己醇（20.876%），醋酸-2-乙基己酯（10.993%）以及乙酸己酯（8.278%）等香型物質(zhì)。酯類是一類較易揮發(fā)且氣味較強的化合物，如乙酸乙酯有強烈的醚似的氣味，清靈，具有強烈的果香味，辛酸乙酯有玫瑰香及清涼的果香，癸酸乙酯有椰子香味[15]。含碳鏈較高的醇類顯示出芳香氣味，在一定程度上起到了組香的作用。低級的飽和羧酸一般均有讓人感覺不舒服的嗅感，如己酸有汗臭味。酮類化合物隨著碳鏈的增加，香氣成分由較強的刺激性氣味逐漸向果實氣味、脂肪氣味轉(zhuǎn)變[13]。低級醛類化合物常常伴有不愉快的刺激性氣味，但隨著醛類化合物C鏈的增長，分子量的增加，此氣味逐漸減弱[16]。在文獻報道中顯示[17]，梨的主要香氣成分有乙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、2-甲基-丁酸乙酯、己酸、辛酸乙酯等。梨醋主要香氣組分包括乙酸乙酯、正己酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、1-壬醇、己酸、大馬士酮、α-法呢烯、辛酸乙酯等，與崔濤等[18]在對砂梨及其果醋的香氣成分的分析中，其檢測到的乙酸乙酯、2-甲基-丁酸乙酯、丁醛、3-甲基丁醇、丁炔二醇、苯丙醇、環(huán)丙烯、2-庚酮等化合物結(jié)果比較相似。

3　結(jié)論

本研究通過紫外誘變，篩選得到正突變醋酸菌株Hg110，總酸含量提高了55.2%。菌株Hg110連續(xù)傳代5次，其產(chǎn)酸能力基本穩(wěn)定。

菌株Hg110作為發(fā)酵菌株制作梨醋，成品清澈、透明，有濃郁的醋香和酯香，口感柔和、醇厚綿長。通過GC-MS分析，共檢出6類35種物質(zhì)，其中酯類13種、醇類9種、醛類3種、酮類2種、酸類2種和其他類8種。被檢測相對含量較高的香氣物質(zhì)有正己酸乙酯（17.470%）、2-乙基己醇（20.876%）、醋酸-2-乙基己酯（10.993%）和乙酸己酯（8.278%）。

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Breeding of acetic acid bacteria by ultraviolet mutation and analysis of volatile components in fermented pear vinegar

DING Cheng1,2,3,GAO Bing1,2,3,LIU Lu1,2,3,HU Yong1,2,3*
(1.College of Bioengineering and Food Science,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China; 2.Research Center of Food Fermentation Engineering and Technology of Hubei,Wuhan 430068,China; 3.Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China)

The acetic acid-producing capacity of acetic acid bacteria Hg109,Hg214,Hg105 and Hg215 was investigated.Using the strain Hg109 with the highest acid yield as original strain,the acetic acid yield as evaluation index,the strain Hg110 with genetic stability and high acetic acid yield was obtained by ultraviolet mutation and screening.With the strain Hg110 as fermentation strain,pear vinegar was fermented.The volatile components in pear vinegar were analyzed by GC-MS.The 35 volatile components and were identified,and the esters were the most(13 kinds),followed by the alcohols(9 kinds),aldehydes(3 kinds),ketones(2 kinds),acids(2 kinds)and other classes(8 kinds).

acetic acid bacteria;breeding;ultraviolet mutation;flavor analysis

Q939

0254-5071（2016）10-0051-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.012

2016-07-01

湖北省教育廳科學(xué)技術(shù)研究計劃青年人才項目（Q20151412）；湖北省自然科學(xué)基金（2015CFB678）；湖北工業(yè)大學(xué)博士啟動基金（Grant No.BSQD10036）

丁城（1991-），男，碩士研究生，研究方向為食品發(fā)酵與分子生物學(xué)。

胡勇（1980-），男，講師，博士，研究方向為工業(yè)微生物遺傳學(xué)、基因組學(xué)和代謝組學(xué)。