王艷玲，周盼盼，李楠楠，韓麗榮，王春玲*

（天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院，天津300457）

蛋白酶制劑對發(fā)酵牛肉醬風味物質(zhì)的影響

王艷玲，周盼盼，李楠楠，韓麗榮，王春玲*

（天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院，天津300457）

以復合蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、風味蛋白酶分別酶解牛肉，得到牛肉酶解液，將4種牛肉酶解液分別和大曲混合后兌鹽水發(fā)酵，比較不同蛋白酶制劑對發(fā)酵牛肉醬風味物質(zhì)的影響。結(jié)果表明，添加復合蛋白酶組的總酸、氨基酸態(tài)氮和總氮含量分別為1.67 g/100 g、1.11 g/100 g和1.53 g/100 g，優(yōu)于其他3種酶制劑組。添加復合蛋白酶和風味蛋白酶組的牛肉醬基質(zhì)檢出有機酸7種，提高了丙酸、酒石酸、蘋果酸和琥珀酸的含量。在風味物質(zhì)種類及含量方面，添加復合蛋白酶組檢出67種，在酯類、醇類及酸類的種類和含量上比添加其他酶制劑組略有優(yōu)勢。

蛋白酶制劑；牛肉酶解液；發(fā)酵牛肉醬；風味物質(zhì)

我國牛肉醬種類繁多，有傳統(tǒng)牛肉醬[1]，也有復合型牛肉醬[2-3]。但是調(diào)配型牛肉醬的口味不夠醇厚，未經(jīng)完全水解的牛肉蛋白不能被人體充分吸收。發(fā)酵型牛肉醬使用的菌種是米曲霉3.042，其具有分解原料能力強、生長繁殖速度快、孢子產(chǎn)量大、不產(chǎn)生毒素等特點[4]，但不能充分利用動物蛋白生成易于人體吸收的氨基酸和小分子肽類，形成的風味物質(zhì)也受到限制。蛋白酶制劑是純度相對較高的蛋白酶生化制品，廣泛用于制備氨基酸或多肽。蛋白質(zhì)酶解是指在酶的作用下蛋白質(zhì)水解成多肽以及氨基酸的一系列過程，蛋白酶酶解蛋白質(zhì)能有效改造蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，酶解產(chǎn)物是肽鏈型酶解產(chǎn)物，與原始蛋白的氨基酸組成相比較，其物理化學性質(zhì)和活性是獨一無二的[5-8]。原始蛋白的性質(zhì)和水解過程的條件決定了酶解產(chǎn)物獨有的特性[9]。

因此，本實驗以不同的蛋白酶制劑對牛肉蛋白進行酶解，然后進行米曲霉發(fā)酵，比較不同蛋白酶制劑對牛肉醬風味物質(zhì)的影響。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

豆粕、炒小麥、麩皮、香菇粉、面粉、生牛肉等：市售；米曲霉（Aspergillus oryzae）3.042：天津科技大學菌種保藏中心；復合蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、風味蛋白酶：天津春發(fā)香精香料有限公司。

氫氧化鈉：天津鵬坤化工有限公司；甲醛：天津市北方天醫(yī)化學試劑廠；硫酸銅、硫酸鉀、無水碳酸鈉、磷酸二氫鉀（均為分析純）：天津金匯太亞化學試劑有限公司；濃硫酸、磷酸、鹽酸（均為分析純）：淄博建龍化工有限公司；甲基橙：天津市南開化工廠；甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、草酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸、富馬酸、甲醇（均為色譜純）：天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心。

1.2儀器與設備

DHG-9203B干燥箱：上海市實驗儀器廠；95-1磁力攪拌器：上海司樂儀器廠；LRH-250-A生化培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠；LC-10ATvp高效液相色譜分析儀、GC-2000氣相色譜分析儀：日本島津公司；SKD-100凱氏自動定氮儀：上海新嘉電子有限公司；HZF-A100分析天平：上海天平儀器廠。

1.3方法

1.3.1種曲的制備

從米曲汁斜面培養(yǎng)基上挑取3～4環(huán)米曲霉3.042孢子，接種至冷卻至30℃左右的三角瓶種曲培養(yǎng)基中，當整體培養(yǎng)約40 h左右，觀察種曲表面整體全部變?yōu)辄S綠色，于60℃的條件下干燥約4 h后裝入牛皮紙袋中備用。

1.3.2大曲的制備

將原料按質(zhì)量比豆粕∶炒小麥∶小麥粉∶香菇粉=3∶1∶1∶1混合均勻，拌入原料總質(zhì)量的30%的水，121℃滅菌15～20 min后接入為原料質(zhì)量3‰的種曲，于30℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40 h后，待曲料變?yōu)榫鶆虻狞S綠色，說明曲料成熟。

1.3.3牛肉醬的制作

將制好的大曲與酶解后的牛肉按照質(zhì)量比4∶3混合，將14°Bx的鹽水（40℃）與整體原料按照1∶0.8的質(zhì)量比混合后裝入發(fā)酵罐，于42℃生化培養(yǎng)箱發(fā)酵10 d后，將生化培養(yǎng)箱溫度調(diào)至32℃繼續(xù)發(fā)酵20 d。

1.3.4牛肉的酶解

將牛肉打碎后與水按質(zhì)量比1∶1混勻，根據(jù)表1給出的條件以復合蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和風味蛋白酶分別對牛肉進行酶解，酶解過程中進行恒溫攪拌操作，各樣品均水解3 h。其中復合蛋白酶是桿菌蛋白酶復合體，主酶是堿性蛋白酶，酶活力根據(jù)主酶活力定義。

表1　四種蛋白酶酶解的條件Table 1　Enzymatic hydrolysis conditions of four kinds of protease

1.3.5測定方法

總酸、氨基酸態(tài)氮含量測定：按照國標GB/T 5009.39—2003《醬油衛(wèi)生標準的分析方法》；總氮含量測定：按照凱氏定氮法；有機酸含量、揮發(fā)性風味物質(zhì)測定：按照參考文獻[10]的方法進行測定。

2　結(jié)果與分析

2.1總酸含量的跟蹤測定

在發(fā)酵過程中影響醬制品總酸含量變化最主要的原因是蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶水解后生成含有羰基的多肽和氨基酸。發(fā)酵過程中總酸含量的變化趨勢見圖1。

圖1　不同酶制劑對醬醪的總酸含量的影響Fig.1　Effect of different enzymes on total acid contents in the paste sauce

由圖1可以看出，不同酶制劑的牛肉醬制品中總酸含量在發(fā)酵前期上升速率較快，之后趨于平緩，終端含量相差不大，其中添加復合蛋白酶組總酸含量最高，為1.67 g/100 g。

2.2氨基酸態(tài)氮含量的跟蹤測定

以氨基酸態(tài)氮的含量值來檢驗氨基酸的含量，氨基酸態(tài)氮含量越低，牛肉醬質(zhì)量越差[11]。氨基酸是醬制品形成多種風味不可缺少的成分，如谷氨酸構(gòu)成了醬制品的鮮味，其他氨基酸則具有相應的甜味、苦味、酸味等[12]。發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量變化見圖2。

圖2　不同酶制劑對醬醪的氨基態(tài)氮含量的影響Fig.2　Effect of different enzymes on amino nitrogen contents in the paste sauce

由圖2可以看出，空白組、添加酶制劑組均在發(fā)酵前10 d增幅較大，而后趨于穩(wěn)定，在第21天時，氨基酸態(tài)氮含量下降，可能是由于氨基酸態(tài)氮被醬中其他微生物（如酵母、乳酸菌等）利用。添加酶制劑組的氨基酸態(tài)氮含量較空白組略高。其中，添加復合蛋白酶組的氨基酸態(tài)氮含量明顯高于其他發(fā)酵組，發(fā)酵終端含量為1.11 g/100 g。由此可見，復合蛋白酶發(fā)揮的作用較大，在此指標上，比較適合牛肉醬基質(zhì)的發(fā)酵。

2.3總氮含量的跟蹤測定

在蛋白酶和多肽酶的分解作用下，總氮的含量會隨著發(fā)酵時間的增加而增加，但由于發(fā)酵后期微生物的生長消耗部分氮源，而且產(chǎn)生的氨基酸會和某些還原糖發(fā)生美拉德反應等，總氮含量在發(fā)酵過程中出現(xiàn)一定變化。發(fā)酵過程中總氮含量變化見圖3。

圖3　不同酶制劑對醬醪總氮含量的影響Fig.3　Effect of different enzymes on total nitrogen contents in the paste sauce

由圖3可以看出，5個發(fā)酵組的總氮含量均在發(fā)酵初期的3 d內(nèi)增長速度較快，這說明原料自身的氮源被逐步利用隨后增長速率變緩，穩(wěn)定后添加酶制劑組別的總氮含量比空白組高，說明添加酶制劑能明顯提高醬醪中總氮含量。其中添加復合蛋白酶發(fā)酵組的總氮含量最高，達到1.53 g/100 g。

2.4有機酸含量的測定

有機酸對醬制品呈香、呈味有較大的促進效果。如乙酸對醬制品的香氣作出了較大的貢獻，能顯著改善醬制品的口感和風味[13]。有機酸本身具有滋味，同時是形成酯香味的基礎(chǔ)[14]。10種有機酸混合標準溶液液相色譜圖見圖4。

圖4　10種有機酸的混合標準溶液液相圖譜Fig.4　Chromatograms of mixed standard solution of ten organic acids

由表2可以看出，空白組、添加復合蛋白酶組和添加風味蛋白酶組均檢出7種有機酸，添加木瓜蛋白酶、胰蛋白酶組均檢測出6種有機酸。除了胰蛋白酶增加了基質(zhì)中草酸含量之外，其他4種酶制劑均減少了草酸含量。草酸是對人體有害的有機酸，過量的草酸會導致人體酸堿失衡。蘋果酸和琥珀酸是重要的食品添加劑，添加4種蛋白酶制劑組均增加了這兩種有機酸的含量，增強了牛肉醬的風味。

表2　五個發(fā)酵組中有機酸含量的比較Table 2　Content of organic acids in five fermentation groups

2.5揮發(fā)性風味物質(zhì)的測定

風味是衡量食品質(zhì)量的重要指標之一，研究醬制品中風味物質(zhì)對醬的工藝改善和品質(zhì)調(diào)控非常必要[15]。微生物釋放出來的復雜酶系或添加的酶制劑分解原料中的蛋白質(zhì)生成多肽、氨基酸風味前體物，這些物質(zhì)在發(fā)酵過程中再經(jīng)過復雜的反應，形成一些風味物質(zhì)[16-17]。AISHIMA T等[18]對醬油中的揮發(fā)性風味物質(zhì)進行檢測，就是用氣相色譜檢測的方法，迄今為止，利用氣相色譜法檢測出的風味物質(zhì)種類已經(jīng)達到300多種；王春玲等[19]利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析耐鹽醬油中酵母所產(chǎn)香氣成分的種類和含量，并對其酵過程中主要香氣成分的動態(tài)變化進行研究。WANAKCHAHORNKRA P等[17]研究了頂空萃取、直接溶劑萃取和真空同時蒸汽-溶劑萃取對泰式醬油風味物質(zhì)分析鑒定結(jié)果的影響；LEE S M等[20]對利用固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用法測定發(fā)酵醬油和酸水解醬油風味物質(zhì)，并對二者進行了對比研究。利用氣-質(zhì)聯(lián)用法對不同酶制劑的牛肉醬制品中風葉物質(zhì)進行測定，結(jié)果見表3。

表3　五個發(fā)酵組檢測到的揮發(fā)性風味物質(zhì)分析Table 3　Analysis of flavor substance in the five fermentation groups

由表3可知，空白組共檢出揮發(fā)性風味物質(zhì)57種，添加木瓜蛋白酶組共檢測出揮發(fā)性風味物質(zhì)59種，添加胰蛋白酶組共檢測出揮發(fā)性風味物質(zhì)57種，添加風味蛋白酶組共檢測出揮發(fā)性風味物質(zhì)53種，添加復合蛋白酶組共檢測出揮發(fā)性風味物質(zhì)67種。其中檢出酯類物質(zhì)種類最多的是添加復合蛋白酶組，且添加酶制劑組較空白組多檢出了乙酸乙酯，其是食品中重要的增香物質(zhì)；醇類是食品中助香物的主要來源，同時是構(gòu)成酯類物質(zhì)的前提。含有醇類物質(zhì)最多的是添加復合蛋白酶組，多檢出了1-辛烯-3-醇和3,7-二甲基-7-辛烯醇，并使得Z-3-壬烯-1-醇的含量明顯升高。其中1-辛烯-3-醇具有玫瑰和干草香氣。3,7-二甲基-7-辛烯醇呈類似玫瑰的濃郁香氣，有甜味；醛類在發(fā)酵制品中主要來自微生物的轉(zhuǎn)化和氨基酸的分解。在5個發(fā)酵組中都檢測到了苯乙醛，苯乙醛具有類似風信子的香氣，稀釋后具有水果的甜香氣，在添加復合蛋白酶組中含量較空白組增加，而其他發(fā)酵組較空白組含量減少；對風味貢獻較大的酚類物質(zhì)是4-甲氧基苯酚，它具有焦飴糖和酚的氣味，能增強發(fā)酵制品的醬香味道，其中添加復合蛋白酶組含量最高。

3　結(jié)論

酶制劑的添加在一定程度上影響了發(fā)酵牛肉醬基質(zhì)的風味物質(zhì)組成，添加復合蛋白酶組在醇類、酯類及醛類的種類和含量上比其他添加酶制劑組略好，因而對風味的影響更明顯，原因可能是復合蛋白酶的主酶堿性蛋白酶與許多其他內(nèi)切蛋白酶不同，更適用于動物蛋白的水解，即使在低水解度的情況下也能產(chǎn)出沒有苦味的蛋白水解液，因此對牛肉中蛋白質(zhì)的降解更充分，使得游離氨基酸和揮發(fā)性風味成分的含量更多，對風味形成有更加積極的影響。木瓜蛋白酶是番木瓜中含有的一種低特異性蛋白水解酶，屬于巰基蛋白酶，具有酶活高、熱穩(wěn)定性好、天然衛(wèi)生安全等特點[21]。胰蛋白酶是從牛、羊或豬胰中提取的一種蛋白水解酶，能選擇地水解蛋白質(zhì)中由賴氨酸或精氨酸的羧基所構(gòu)成的肽鏈，能消化溶解變性蛋白質(zhì)，對未變性的蛋白質(zhì)無作用。風味蛋白酶是利用米曲霉發(fā)酵提取而來，可以用來去除低水解度產(chǎn)物的苦肽鏈，將其徹底降解為氨基酸。添加復合蛋白酶組的總酸、氨基酸態(tài)氮和總氮含量分別為1.67 g/100g、1.11 g/100g和1.53 g/100g，優(yōu)于其他3種酶制劑組。添加復合蛋白酶和風味蛋白酶組的牛肉醬基質(zhì)檢出有機酸7種，提高了丙酸、酒石酸、蘋果酸和琥珀酸的含量。在風味物質(zhì)種類及含量方面，添加復合蛋白酶組檢出67種，在酯類、醇類及酸類的種類和含量上比添加其他酶制劑組略有優(yōu)勢。因此，選擇添加復合蛋白酶來增強發(fā)酵牛肉醬的風味。參考文獻：

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Effect of protease on the flavor substances of fermented beef paste

WANG Yanling,ZHOU Panpan,LI Nannan,HAN Lirong,WANG Chunling*
(College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China)

Using protamex,papain,trypsin and flavourzyme respectively to hydrolysis beef,four kinds of beef hydrolysis was obtained,the four kinds of beef hydrolysis were fermented with brine after mixed withDaqu.The effect of protease on flavor substance of fermented beef paste was compared.The results showed that protamex was superior to other types of proteases,and the content of total nitrogen,total acids,and amino nitrogen in the paste was 1.67 g/100 g,1.11 g/100 g,1.53 g/100 g,respectively.Seven kinds of organic acids were detected in the group with protamex or flavourzyme addition,the content of propionic acid,tartaric acid,malic acid and succinic acid were improved.In the type and content of flavor substance,67 kinds of flavor substance were detected in the group with protamex addition,which was slightly better than the groups with other enzyme addition in the type and content of alcohols,acids and aldehyde.

protease;beef enzymolysis;fermented beef paste;flavor substance

TS264.2

0254-5071（2016）10-0027-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.007

2016-05-10

十二五國家科技計劃（2013AA102106）

王艷玲（1991-），女，碩士研究生，研究方向為發(fā)酵食品。

王春玲（1977-），女，教授，博士，研究方向為功能性食品、釀造食品的研究與開發(fā)。