張鼎元，曹瀟，郭春陽，童巧瓊，徐善良

1. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315211 2. 寧波大學(xué)應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室，寧波 315211

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乙酸銅對銀鯧幼魚急性毒性及抗氧化酶活性的影響

張鼎元1，曹瀟1，郭春陽1，童巧瓊1，徐善良2,*

1. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315211 2. 寧波大學(xué)應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室，寧波 315211

為評價乙酸銅對銀鯧的安全性及毒性效應(yīng)，采用靜水急性暴露實驗，研究了8個乙酸銅濃度梯度(0、0.150、0.206、0.282、0.387、0.531、0.729、1.00 mg·L-1)對銀鯧幼魚的急性毒性，以肝臟和鰓組織的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化酶(GSH—PX)以及谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)活性為指標研究乙酸銅對銀鯧幼魚的毒理作用，并進行安全評價。結(jié)果表明，高濃度乙酸銅會對銀鯧幼魚產(chǎn)生了較大的毒性，48 h和96 h-LC50分別為0.898 mg·L-1、0.264 mg·L-1，安全質(zhì)量濃度為0.026 mg·L-1；不同濃度乙酸銅脅迫下銀鯧幼魚組織中的SOD、CAT、GSH-PX和GST活性均表現(xiàn)為低濃度被誘導(dǎo)而高濃度受抑制的規(guī)律，與乙酸銅濃度呈拋物線型劑量效應(yīng)關(guān)系，此外，肝臟中4種抗氧化酶活性普遍高于鰓組織。研究發(fā)現(xiàn)，乙酸銅脅迫對抗氧化酶的影響，可以反映銀鯧幼魚機體的受損狀況，其中SOD可較靈敏地指示早期低濃度的銅污染。

乙酸銅；銀鯧幼魚；急性毒性；抗氧化酶

銅離子是生物生長發(fā)育所必需的微量元素，在提供營養(yǎng)、腸道吸收、生長繁殖和增強機體抵抗力等方面具有不可替代的作用，但是銅過量也會對蛋白質(zhì)和酶產(chǎn)生毒害作用[1]。近年來，重金屬污染日趨嚴重，其中銅儼然成為水環(huán)境的主要污染物之一。乙酸銅是水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用最廣泛的藥物之一，在治療魚類白點病上有著良好的效果。但目前對乙酸銅的毒性效應(yīng)研究不足，使得生產(chǎn)上因用藥不當而造成養(yǎng)殖魚類大量死亡的事故時有發(fā)生，因此需要對乙酸銅毒性效應(yīng)進行深入研究。魚類的急性毒性試驗是研究藥物對魚類毒性強度的常用方法，抗氧化酶又是生物體氧化脅迫和損傷的主要標志物[2]，也是當前重金屬在水產(chǎn)動物毒理學(xué)上研究的熱點之一。

銀鯧(Pampus argenteus)隸屬鱸形目，鯧科，鯧屬，是我國重要的海洋經(jīng)濟魚種之一，主要分布在我國東海北部及黃海南部[3]。目前，國內(nèi)對銀鯧的繁殖、生長、營養(yǎng)、餌料等方面已進行了相關(guān)研究[4-7]，但有關(guān)重金屬對銀鯧毒性方面的研究很少。本文以人工養(yǎng)殖的銀鯧幼魚為實驗對象，分析了乙酸銅對銀鯧幼魚的急性毒性，同時也測定了急性暴露試驗后銀鯧幼魚肝臟及鰓組織中4種抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-PX和GST)活性的變化，旨在了解乙酸銅對銀鯧幼魚的急性毒性及對魚體抗氧化酶活性的影響，為銀鯧養(yǎng)殖中的安全用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗用魚及條件

銀鯧幼魚由寧波象山魚得水水產(chǎn)養(yǎng)殖公司提供，試驗用魚體長(6.2±0.15) cm，體質(zhì)量(4.3±0.15) g。在容積為100 L的聚乙烯塑料桶內(nèi)進行試驗，試驗前銀鯧幼魚在桶中暫養(yǎng)適應(yīng)5 d，每天定時投喂5#“魚寶”飼料(產(chǎn)自日本林兼產(chǎn)業(yè)株式會社)，試驗前停食1 d。本試驗采用二級沙濾海水，pH值為8.01±0.3，鹽度為27，水溫為(25±1) ℃，DO為(6.35±0.25) mg·L-1。

1.2 主要儀器和試劑

751-GW紫外分光光度計、冷凍離心機(GL-166-11型)等。乙酸銅試劑為分析純，SOD試劑盒、CAT試劑盒、GSH—PX試劑盒、GST試劑盒、考馬斯亮藍總蛋白試劑盒、標準蛋白均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 試驗方法1.3.1 急性毒性試驗

參照《魚類急性毒性試驗方法》[8]，包括預(yù)試驗以及正式試驗。經(jīng)預(yù)實驗得到24 h和96 h銀鯧幼魚全部存活、全部死亡的乙酸銅濃度范圍。再按等對數(shù)梯度設(shè)計7個乙酸銅濃度組，分別為0.150、0.206、0.282、0.387、0.531、0.729和1.000 mg·L-1，并設(shè)1個對照組，每個梯度3個平行，每平行10尾幼魚。給藥后按時觀察并記錄實驗組銀鯧幼魚的活動狀態(tài)，中毒癥狀以及死亡數(shù)量，及時撈出死魚，玻璃棒觸及尾部無反應(yīng)即視為死亡。每天換水時更換新的藥液，實驗持續(xù)96 h。統(tǒng)計24 h、48 h、72 h和96 h的死亡尾數(shù)。毒性實驗結(jié)束后，從各濃度組每個平行中取魚2尾，置于冰盤中迅速解剖取肝臟和鰓組織保存液氮中待測。

1.3.2 酶液制備及酶活性的測定

將用凍存的組織于低溫下解凍，用預(yù)冷的生理鹽水沖凈，然后加入4倍體積預(yù)冷生理鹽水勻漿后，用冷凍離心機于4 ℃、2 500 r·min-1條件下離心10 min，取上清液置于4 ℃下保存，24 h內(nèi)測定完畢?？偟鞍缀?、SOD、CAT、GSH-PX和GST的測定分別按照南京建成生物研究所的考馬斯亮藍總蛋白試劑盒、SOD(酶標法)、CAT(可見分光法)、GSH-PX(可見分光法)和GST(可見分光法)說明書測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS16.0對所得數(shù)據(jù)進行分析統(tǒng)計，采用直線內(nèi)插法[9]求算48 h及96 h的半致死濃度(48 h-LC50及96 h-LC50)，安全濃度SC=96 h-LC50×0.1[10-12]。并采用單因子方差分析(One-way ANOVA)和Duncan’s多重比較法對不同濃度組間進行差異顯著性檢驗，同一濃度不同組織間差異顯著性檢驗采用t檢驗(P<0.05為差異顯著)。

2 結(jié)果(Results and analysis)

2.1 銀鯧幼魚的中毒癥狀

銀鯧幼魚在不同濃度的乙酸銅實驗組中的表現(xiàn)如下：在最高濃度組，銀鯧幼魚很快出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，具體表現(xiàn)為游速加快，脫離魚群，獨自進行無規(guī)律的游動，鰓蓋開合頻率加快，6 h后有4尾魚逐漸失去平衡能力，在桶的上層側(cè)翻游動，12 h后身體僵直，沉入桶底，此時鰓蓋繼續(xù)保持開合狀態(tài)。隨著時間的推移，沉入桶底的銀鯧幼魚偶爾又會掙扎游動，不久再次沉底，經(jīng)過幾次反復(fù)，24 h后9尾死亡；對于低濃度組受試的幼魚而言，中毒的時間會有所延遲，但是中毒的癥狀相同。

2.2 乙酸銅對銀鯧幼魚的急性毒性

對各試驗組中的受試銀鯧幼魚死亡情況進行統(tǒng)計，計算得到24 h、48 h、72 h和96 h死亡率和半致死濃度(LC50)以及安全濃度(SC)，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，除了對照組之外，銀鯧幼魚在其余濃度實驗組中均出現(xiàn)死亡的情況，死亡率隨著乙酸銅濃度的增大以及實驗時間的延長而顯著遞增(P<0.05)，呈較為明顯的劑量-效應(yīng)和時間-效應(yīng)關(guān)系。用直線內(nèi)插法得出，48 h和96 h乙酸銅對銀鯧幼魚的半致死濃度LC50分別為0.898和0.264 mg·L-1，安全濃度為0.026 mg·L-1。

2.3 乙酸銅對銀鯧幼魚肝臟及鰓組織超氧化物歧化酶活性的影響

圖1為銀鯧幼魚在不同濃度乙酸銅中鰓組織和肝臟的SOD活性變化。結(jié)果顯示，銀鯧幼魚鰓組織中SOD活性明顯低于肝臟，鰓組織中SOD活性在不同濃度的乙酸銅條件下變化不明顯，但在肝臟中變化較大，總體呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢，兩者的SOD活性均在乙酸銅濃度為0.15 mg·L-1時達到最大值，分別為301.61和67.13 U·mg-1，其中肝臟SOD活性為對照組的5倍，而鰓組織的SOD活性只為對照組的1.5倍。之后隨著乙酸銅濃度的增加肝臟和鰓組織SOD活性隨之降低，均在乙酸銅最高濃度組達到最小值，分別為38.32 U·mg-1和36.17 U·mg-1，均顯著低于對照組(P<0.05)。

2.4 乙酸銅對銀鯧幼魚肝臟及鰓組織過氧化氫酶活性的影響

圖2為銀鯧幼魚在不同濃度乙酸銅中鰓組織和肝臟的CAT活性變化。結(jié)果顯示，銀鯧幼魚肝臟和鰓組織中的CAT活性與SOD相比，表現(xiàn)出更為明顯的先升后降的趨勢，兩者在乙酸銅濃度為0.387 mg·L-1時達到最大值，分別為1 293.02 U·mg-1和735.26U·mg-1，均顯著高于對照組(P<0.05)，分別達到對照組的5.7和3.1倍。當乙酸銅濃度增加到0.531 mg·L-1時，肝臟中的CAT活性下降明顯且僅為最高值的25%；當乙酸銅濃度為1 mg·L-1時肝臟的CAT活性最低，為159.02 U·mg-1，與對照組差異顯著(P<0.05)。而鰓組織CAT活性在濃度0.729 mg·L-1組達到最小值，為224.99 U·mg-1，也顯著低于對照組(P<0.05)。

圖1 不同濃度乙酸銅脅迫48 h對銀鯧幼魚鰓和肝組織SOD活性的影響注：上標第一個字母不同表示不同濃度組的顯著性差異(P< 0.05)，第二個字母不同表示不同組織間的顯著性差異(P<0.05)。下同。Fig. 1 Effects of copper acetate on SOD activity in juvenile Pampus argenteus after 48 h exposureNote: If the first letters are different, it denotes significant difference in different concentration groups (P< 0.05); if the second letters are different, it denotes significant difference in different organs (P< 0.05). The same below.

表1 乙酸銅對銀鯧幼魚急性毒性試驗結(jié)果

圖2 不同濃度乙酸銅脅迫48 h對銀鯧幼魚鰓和肝組織CAT活性的影響Fig. 2 Effects of copper acetate on CAT activity in juvenile Pampus argenteus after 48 h exposure

圖3 不同濃度乙酸銅脅迫48 h對銀鯧幼魚鰓和肝組織GSH-PX活性的影響Fig. 3 Effects of copper acetate on GSH-PX activity in juvenile Pampus argenteus after 48 h exposure

圖4 不同濃度乙酸銅脅迫48 h對銀鯧幼魚鰓和肝組織GST活性的影響Fig. 4 Effects of copper acetate on GST activity in juvenile Pampus argenteus after 48 h exposure

2.5 乙酸銅對銀鯧幼魚肝臟及鰓組織谷胱甘肽過氧化酶活性的影響

圖3為銀鯧幼魚在不同濃度乙酸銅中鰓組織和肝臟的GSH-PX活性變化。和SOD、CAT及GST活性相比銀鯧幼魚肝臟中GSH-PX活性變化較小，兩者均在乙酸銅濃度為0.282 mg·L-1時達到最大值，分別為403.02和86.93 U·mg-1，均顯著高于對照組(P<0.05)，其中肝臟GSH-PX活性達到對照組的3倍，而鰓組織的GSH-PX活性為對照組的1.5倍。之后肝臟和鰓組織GSH-PX活性又隨著乙酸銅濃度的增加而降低，均在乙酸銅濃度為0.729 mg·L-1時達到最小值，為104.05和28.11 U·mg-1，分別為最高值的25%和32%，均顯著低于對照組(P<0.05)。

2.6 乙酸銅對銀鯧幼魚肝臟及鰓組織谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶活性的影響

圖4為銀鯧幼魚在不同濃度乙酸銅中鰓組織和肝臟的GST活性變化。銀鯧幼魚鰓組織中GST活性也明顯低于肝臟，而且隨著乙酸銅濃度的增加，肝臟和鰓組織中的GST活性同樣也呈現(xiàn)明顯的先升后降的趨勢。當乙酸銅濃度達到0.531 mg·L-1時，肝臟及鰓組織的GST活性首次低于對照組，此時鰓組織的GST活性達到最小值，僅為6.99 U·mg-1，為對照組的80%。兩者均在乙酸銅濃度為0.206 mg·L-1時達到最大值，分別為141.83 U·mg-1和33.85 U·mg-1，均顯著高于對照組(P<0.05)，分別達到對照組的4.98和3.84倍。

3 討論(Discussion)

3.1 乙酸銅對銀鯧幼魚的致毒效應(yīng)及安全濃度評價

銅作為生物體的必需元素之一，同時也具有很強的毒性，在其濃度過高時會對生物體產(chǎn)生嚴重的毒性影響。陳光蕓等[13]等報道肝臟中積累的大量銅鹽會抑制許多酶的活性，從而損傷肝功能甚至導(dǎo)致肝壞死，同時銅鹽會降低血紅蛋白含量，破壞鰓絲結(jié)構(gòu)，這與實驗中銀鯧幼魚的中毒癥狀相一致。在水產(chǎn)養(yǎng)殖上，乙酸銅作為一種殺蟲劑發(fā)揮著重要的作用，尤其是可以替代硝酸亞汞和孔雀石綠這類禁用藥來治療海水魚的小瓜蟲病。本試驗結(jié)果顯示，乙酸銅對銀鯧幼魚的安全質(zhì)量濃度為0.026 mg·L-1，明顯低于生產(chǎn)推薦使用量(0.7～1.0 mg·L-1)，表明銀鯧幼魚對乙酸銅的耐受性非常低。因此，在使用乙酸銅防治“白點病”時要嚴格控制乙酸銅的藥浴時間，以免引起銀鯧中毒死亡。

3.2 乙酸銅對銀鯧鰓及肝臟抗氧化酶活性的影響

機體憑借一系列抗氧化酶構(gòu)建防御體系，抗氧化酶可以反映重金屬離子對養(yǎng)殖動物的毒害程度并維持機體自由基動態(tài)平衡，減少氧自由基對細胞組織的損傷[14-18]。本實驗結(jié)果顯示，鰓組織的抗氧化酶活性總體上要顯著低于肝臟組織，這與孔祥會等[19]、高靜等[20]等研究鋸緣青蟹(Scylla serrata)和斑馬魚(Danio retio)抗氧化酶得出的結(jié)論相一致，這是因為肝臟是生物體代謝活動的中心，為了保證肝臟中物質(zhì)和能量代謝的高效進行，擁有一套較為完善的抗氧化系統(tǒng)，可以防止肝臟受損。

一些研究表明，抗氧化酶活性的變化與污染物的濃度具有相關(guān)性[21]。本研究結(jié)果表明，4種不同抗氧化酶的活性在不同濃度乙酸銅條件下均表現(xiàn)出相似的規(guī)律，即低濃度的乙酸銅對抗氧化酶活性起誘導(dǎo)作用，而高濃度的乙酸銅對抗氧化酶活性起抑制作用，符合毒性試驗中較常見的拋物型劑量效應(yīng)關(guān)系，王凡等[22]、張林寶等[23]等對牙鲆(Paralichthys olivaceus)和菲律賓蛤仔(Venerupis philippinarum)抗氧化酶的研究中也得出同樣的結(jié)論。此外，對水生動物而言，銅離子濃度對抗氧化酶活性的影響表現(xiàn)為低濃度誘導(dǎo)，高濃度抑制，這與其他重金屬離子對抗氧化酶活性的影響相類似[24]。Stebbing[25]把這種現(xiàn)象定義為生物的“毒物興奮效應(yīng)”，而魯雙慶等[26]則認為低濃度的Cu2+誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生大量的自由基，從而導(dǎo)致抗氧化酶活性的升高，高濃度Cu2+會增加自由基反應(yīng)速度，使得那些未被及時清除的自由基損害細胞并破壞其結(jié)構(gòu)，加速細胞的衰老，最終導(dǎo)致抗氧化酶的活性降低。

銀鯧幼魚受乙酸銅暴露后4種抗氧化酶的活性變化均為拋物線型劑量效應(yīng)關(guān)系，這與萬敏等[17]對皺紋盤鮑的研究結(jié)果一致。但是江天久等[27]對近江牡蠣的研究發(fā)現(xiàn)，重金屬離子對鰓組織SOD活性的誘導(dǎo)曲線呈非拋物線型，這可能與物種間差異有關(guān)。

譚樹華等[28]指出不同生物對污染物均有一個耐受閾值，超過了這個耐受閾值表明污染物對生物機體產(chǎn)生損傷，此時機體抗氧化酶的活性開始降低，這也是生物發(fā)生中毒反應(yīng)的前兆[29]。而本研究結(jié)果表明，SOD、CAT、GSH-PX和GST各自對應(yīng)Cu2+的耐受閾值各不相同，分別為0.150、0.387、0.282、0.206 mg·L-1，可以發(fā)現(xiàn)SOD對Cu2+的耐受閾值最低，即SOD對Cu2+更加敏感，可以較靈敏地指示早期水體中低劑量的Cu2+污染，張紅霞等[16]在研究重金屬離子對日本蟳抗氧化酶的影響時也得到相似的結(jié)論，程敏紅等[30]利用乙酸銅和阿維菌素對斜帶石斑幼魚進行試驗，結(jié)論也與本文基本一致。SOD被認作是機體防御自由基侵害的首道防線[31]，賈秀英等[32]也指出SOD活性可以作為魚類逆境生理的一個生化指標，因此，在監(jiān)測早期水體Cu2+污染時應(yīng)首選SOD作為指示目標。

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Acute Toxicity of Copper Acetate and Its Effects on Antioxidant Enzyme Activity of Pampus argenteus

Zhang Dingyuan1, Cao Xiao1, Guo Chunyang1, Tong Qiaoqiong1, Xu Shanliang2,*

1. School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China 2. Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology (Ningbo University), Ministry of Education, Ningbo 315211, China

Received 10 March 2016 accepted 5 May 2016

Copper acetate is a common fisheries drug which can be used for the control of parasitic diseases of fish. In order to evaluate the toxic effects and the safety of copper acetate on Pampus argenteus, an acute exposure experiment of copper acetate on Pargenteus was carried out by a static biological test method. According to the results of preliminary experiments, we set eight concentration gradients (0, 0.150, 0.206, 0.282, 0.387, 0.531, 0.729 and 1.00 mg·L-1) of acute exposure experiment. The activity of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GSH-PX) and glutathione S-transferase (GST) in liver and gill served as the indicators to study toxicological effects of copper acetate on P. argenteus. The results showed that the LC50of copper acetate in 48 h and 96 h were 0.898 mg·L-1and 0.264 mg·L-1, respectively. The safe concentration of copper acetate for juvenile P. argenteus was 0.026 mg·L-1. Activities of SOD, CAT, GSH-PX and GST were induced at the low concentration of cooper acetate, whereas were inhibited at the high concentration. In addition, the activities of four antioxidant enzymes in liver was higher than that of gill. The changes of the antioxidant enzyme activities (SOD, CAT, GSH-PX, GST) could reflect the damage degree of P. argenteus by copper acetate stress, and the SOD activity can indicate low concentration copper pollution in the early stage.

copper acetate; Pampus argenteus; acute toxicity; antioxidant enzyme

國家星火計劃項目(2015GA701007)；寧波市重大科技專項(2015C110003)

張鼎元(1992-)，男，研究生，研究方向為海水魚類健康養(yǎng)殖，E-mail: 543840166@qq.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: xushanliang@nbu.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20160310001

2016-03-10 錄用日期：2016-05-05

1673-5897(2016)4-280-07

X171.5

A

簡介：徐善良(1962—)，男，碩士，教授，主要研究方向海水魚類苗期營養(yǎng)和健康養(yǎng)殖，發(fā)表學(xué)術(shù)論文60余篇。

張鼎元, 曹瀟, 郭春陽, 等. 乙酸銅對銀鯧幼魚急性毒性及抗氧化酶活性的影響[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報，2016, 11(4): 280-286

Zhang D Y, Cao X, Guo C Y, et al. Acute toxicity of copper acetate and its effects on antioxidant enzyme activity of Pampus argenteus [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(4): 280-286 (in Chinese)