高昆，陳娟，李圓圓，劉春，秦占芬

1. 河北科技大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，石家莊 050018 2. 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心 環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國家重點實驗室，北京 100085

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三氯生和三氯卡班對兩棲動物蝌蚪的急性毒性

高昆1,2，陳娟2，李圓圓2，劉春1,，秦占芬2

1. 河北科技大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，石家莊 050018 2. 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心 環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國家重點實驗室，北京 100085

三氯生(TCS)和三氯卡班(TCC)是個人護理品中常用抗菌劑，在水體中普遍存在，但目前其對兩棲動物的毒性研究仍較少。本研究以黑斑蛙蝌蚪和非洲爪蛙蝌蚪為受試生物，研究TCS和TCC對蝌蚪的急性毒性。將處于第一個蝌蚪發(fā)育期的黑斑蛙蝌蚪(Gosner 26期)和非洲爪蛙蝌蚪(NF 46期)分別暴露于系列濃度的TCS和TCC，測定其對蝌蚪的半數(shù)致死濃度(96 h-LC50)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TCS對黑斑蛙蝌蚪和非洲爪蛙蝌蚪的96 h-LC50分別為441 μg·L-1和280 μg·L-1；TCC對黑斑蛙蝌蚪和非洲爪蛙蝌蚪的96 h-LC50為252 μg·L-1和217 μg·L-1。這些數(shù)據(jù)顯示TCS和TCC對兩種蝌蚪的毒性較高，且對非洲爪蛙蝌蚪毒性均略高于對黑斑蛙蝌蚪的毒性，整體來看TCC的毒性略高于TCS。

三氯生；三氯卡班；黑斑蛙；非洲爪蛙；蝌蚪；急性毒性

三氯生(TCS)和三氯卡班(TCC)是2種常添加于個人護理品中的抗菌劑[1]，在護理品中TCS的含量通常在0.1%～0.3%[2-3]，TCC的含量可以達到2%[4]。據(jù)估計2014年中國的TCS使用量約為100 t[5-7]，并且呈現(xiàn)逐年上升的趨勢。TCS和TCC主要通過生活污水排放進入水體。研究顯示，在北美、歐洲、澳洲、亞洲的河口、河流和湖泊中都有這些污染物的檢出，一般濃度在ng·L-1水平，部分河流中濃度高達μg·L-1[3, 8]，沉積物中濃度達μg·g-1水平[9-11]。在污水處理廠附近的魚類等水生生物體內(nèi)，甚至人類尿液、血液、母乳中也有TCS和TCC的檢出[12-14]。由于持續(xù)排放，TCS和TCC在環(huán)境中的存在及對生物體的不良影響值得關(guān)注。

有資料顯示，TCS、TCC對嚙齒類動物、魚類、藻類有一定的影響并產(chǎn)生毒性效應(yīng)。如大鼠皮膚注射TCS的半致死劑量LD50為5 000 mg·kg-1，大鼠口服TCS的半致死劑量LD50為4 500～5 000 mg·kg-1[15]；TCS對日本青鳉魚仔魚和成魚的96 h-LC50分別為600 μg·L-1和1 700 μg·L-1；對斑馬魚胚胎和成魚的96 h-LC50為420 μg·L-1和340 μg·L-1[16]；對黑頭呆魚成魚的96 h-LC50為260 μg·L-1[17]；TCC對海洋小球藻、眼點擬微綠球藻、球形棕囊藻和東海原甲藻4種微藻的96 h-EC50分別為108 μg·L-1、63 μg·L-1、61 μg·L-1和58 μg·L-1[18]。從已有數(shù)據(jù)來看，TCS和TCC對水生生物(魚類、藻類)的毒性高于對陸生生物的毒性，對同類生物(如魚類)的毒性存在較大的種屬差異。兩棲動物介于水生與陸生動物之間，既能活躍在陸地上，又能游動于水中。兩棲動物蝌蚪生長在水環(huán)境中，皮膚具有高滲透性，對水體污染物十分敏感。Palenske等[19]曾研究TCS對49期非洲爪蛙蝌蚪的急性毒性，報道96 h-LC50為259 μg·L-1。TCS對其他種屬兩棲動物的急性毒性如何目前還少有研究，而且沒有關(guān)于TCC對兩棲動物急性毒性的數(shù)據(jù)。

黑斑蛙是我國分布最廣的本土兩棲物種之一，隸屬兩棲綱、無尾目、蛙科、側(cè)褶蛙屬。本文旨在研究TCS和TCC對處于第一個蝌蚪發(fā)育期的黑斑蛙蝌蚪(Gosner26期)[20]的急性毒性，并與對非洲爪蛙蝌蚪(NF46期)[21]的急性毒性比較，為合理使用三氯生類殺菌劑及其相應(yīng)的環(huán)境管理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法( Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

儀器和設(shè)備：蛙類誘導(dǎo)繁育設(shè)備(本實驗室研發(fā))；尼龍紗網(wǎng)；500 mL燒杯。

試劑：三氯生(CAS NO. 3380-34-5；98%，東京化成工業(yè)朱式會社，日本)；三氯卡班(CASNO.101-20-2；98%，梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司，上海)；人絨毛膜促性腺激素(HCG，北京欣生科科技有限公司，中國)；注射用促黃體激素釋放激素(LHRH，Sigma，美國)。

1.2 試驗生物

黑斑蛙蝌蚪：成年黑斑蛙飼養(yǎng)在水陸兩棲的玻璃缸中，每天清洗。水溫(24±1) ℃，模擬自然光照射，明暗光周期為12 h:12 h。成蛙每天喂食面包蟲1次。成年雌蛙注射2.5 μg LHRH(以0.6%的鹽水配制)和300 IU的HCG；成年雄蛙注射2.5 μg LHRH和150 IU的HCG，然后放入蛙類誘導(dǎo)繁育設(shè)備中，誘導(dǎo)其抱對產(chǎn)卵。受精卵在水溫(24±1) ℃明暗光周期為12 h:12 h的環(huán)境下孵化，胚胎發(fā)育至26期的蝌蚪，用于急性毒性試驗。

非洲爪蛙蝌蚪：本實驗室飼養(yǎng)的非洲爪蛙成年雌蛙和雄蛙，分養(yǎng)于盛有去氯自來水的玻璃缸中，水溫(22±1) ℃，明暗光周期為12 h:12 h。成蛙喂食1:1配比的豬肝和商品飼料，喂食2 h后換水，1周2次。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%的鹽水配制HCG溶液，非洲爪蛙雌蛙皮下注射300～500 IU，雄蛙注射200～300 IU，將雌雄蛙放于產(chǎn)卵容器中，置于黑暗安靜的環(huán)境中讓其抱對，12 h左右即可產(chǎn)卵。受精卵在水溫(22±1) ℃、明暗光周期為12 h:12 h的環(huán)境下孵化，胚胎發(fā)育至46期的蝌蚪，用于急性毒性試驗。

1.3 蝌蚪急性毒性試驗

TCS和TCC分別以800 μg·L-1和1 000 μg·L-1為最高濃度，設(shè)置6個濃度暴露組進行預(yù)試驗。隨機選取10只蝌蚪放于盛有300 mL暴露液的燒杯中，設(shè)置3個平行，每隔24 h換液，清除死亡個體并記錄死亡數(shù)，實驗持續(xù)96 h。

根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果設(shè)置濃度范圍，進行正式試驗。TCS對黑斑蛙蝌蚪的系列暴露濃度為330 μg·L-1、363 μg·L-1、399 μg·L-1、439 μg·L-1、483 μg·L-1、531 μg·L-1；非洲爪蛙蝌蚪的系列暴露濃度為103 μg·L-1、135 μg·L-1、175 μg·L-1、228 μg·L-1、296 μg·L-1、384 μg·L-1、500 μg·L-1。TCC對黑斑蛙蝌蚪的系列暴露濃度為101 μg·L-1、152 μg·L-1、228 μg·L-1、342 μg·L-1、513 μg·L-1、770 μg·L-1；非洲爪蛙蝌蚪的系列暴露濃度為45 μg·L-1、68 μg·L-1、101 μg·L-1、152 μg·L-1、228 μg·L-1、342 μg·L-1、513 μg·L-1、770 μg·L-1。每個處理設(shè)置3個平行，暴露試驗在500 mL燒杯中進行。每個燒杯中盛有300 mL暴露液，隨機投放入10尾蝌蚪。每隔24 h換液，觀察蝌蚪生命狀態(tài)，記錄死亡數(shù)，并清除死亡個體，試驗持續(xù)96 h。

1.4 統(tǒng)計分析

每天詳細(xì)記錄每個燒杯內(nèi)蝌蚪死亡數(shù)及蝌蚪異常情況；以受試化學(xué)品的濃度對數(shù)值為自變量(x)，以相應(yīng)濃度下蝌蚪累積死亡率為因變量(y)，采用SPSS數(shù)據(jù)處理軟件，使用Probit進行回歸分析，建立“劑量-效應(yīng)”線性方程，并計算LC50值及其95%置信區(qū)間。如果試驗數(shù)據(jù)不適于用標(biāo)準(zhǔn)方法計算LC50，以不引起死亡的最高濃度和引起100%死亡的最低濃度的幾何平均值為最終的LC50。

2 結(jié)果( Results)

通過預(yù)試驗設(shè)定黑斑蛙蝌蚪正式試驗濃度范圍，26期黑斑蛙蝌蚪暴露于TCS、TCC的范圍分別為330～531 μg·L-1，101～770 μg·L-1。TCS和TCC暴露后黑斑蛙蝌蚪在24 h、48 h、72 h和96 h的死亡率情況如圖1。

溶劑對照組均無蝌蚪死亡，顯示試驗質(zhì)量控制良好。黑斑蛙蝌蚪急性毒性結(jié)果顯示，26期黑斑蛙蝌蚪暴露于TCS 24 h后，439 μg·L-1濃度下的蝌蚪出現(xiàn)死亡，存活的蝌蚪出現(xiàn)游動緩慢或沉于缸底等行為異?，F(xiàn)象，531 μg·L-1濃度下的蝌蚪全部死亡；26期黑斑蛙蝌蚪暴露于TCC 24 h后，342 μg·L-1濃度下的蝌蚪出現(xiàn)死亡，72 h后770 μg·L-1濃度下的蝌蚪全部死亡。TCS在363 μg·L-1的濃度下，對黑斑蛙蝌蚪?jīng)]有明顯的毒性作用，而TCC在342 μg·L-1濃度時毒性明顯，96 h時死亡率為80%。比較96 h TCS和TCC各濃度下的致死率，可以更明顯地看出，TCC對26期黑斑蛙蝌蚪的毒性高于TCS。

圖1 三氯生(TCS)和三氯卡班(TCC)對26期黑斑蛙蝌蚪的96 h內(nèi)致死率Fig. 1 Mortality of Pelophylax nigromaculatus tadpoles (Gosmer stage 26) following exposure to triclosan (TCS) and triclocarban (TCC) within 96 h

圖2 三氯生(TCS)和三氯卡班(TCC)對46期非洲爪蛙蝌蚪的96 h內(nèi)致死率Fig. 2 Mortality of Xenopus laevis tadpoles (NF stage 46) following exposure to triclosan (TCS) and triclocarban (TCC) within 96 h

通過預(yù)試驗設(shè)定非洲爪蛙蝌蚪正式試驗濃度范圍，46期非洲爪蛙蝌蚪暴露于TCS、TCC的范圍分別為103～500 μg·L-1，45～770 μg·L-1。TCS和TCC暴露后非洲爪蛙蝌蚪在24 h、48 h、72 h和96 h的死亡率情況如圖2。

非洲爪蛙蝌蚪急性毒性結(jié)果顯示，46期非洲爪蛙蝌蚪暴露于TCS 24 h后，175 μg·L-1濃度下的蝌蚪出現(xiàn)死亡，存活蝌蚪游動緩慢或沉于缸底，500 μg·L-1濃度下的蝌蚪死亡率為70%；46期爪蛙蝌蚪暴露于TCC 24 h后，101 μg·L-1濃度下的蝌蚪出現(xiàn)死亡，72 h后770 μg·L-1濃度下的蝌蚪全部死亡。TCS在103 μg·L-1的濃度下，對非洲爪蛙蝌蚪?jīng)]有明顯的毒性作用，而TCC在101 μg·L-1濃度時毒性明顯，96 h時死亡率為30%。上述結(jié)果表明TCC對46期非洲爪蛙蝌蚪表現(xiàn)出比TCS更強的毒性，與26期黑斑蛙蝌蚪的急性毒性結(jié)果相一致。

TCS和TCC對26期黑斑蛙蝌蚪、46期非洲爪蛙蝌蚪半致死濃度LC50如表1、表2所示，TCS、TCC對26期黑斑蛙蝌蚪的96 h-LC50分別為441 μg·L-1、252 μg·L-1；TCS、TCC對46期非洲爪蛙蝌蚪的96 h-LC50分別為280 μg·L-1、217 μg·L-1。比較TCS 、TCC對黑斑蛙蝌蚪的LC50值，發(fā)現(xiàn)TCC在48 h、72 h、96 h的LC50值低于TCS的LC50；同樣比較TCS 、TCC對非洲爪蛙蝌蚪的LC50值，發(fā)現(xiàn)TCC在24 h、48 h、72 h、96 h的LC50值低于TCS的LC50。這表明TCC在對黑斑蛙蝌蚪和非洲爪蛙蝌蚪的毒性試驗中都表現(xiàn)出了比TCS更明顯的毒性。

3 討論(Discussion)

本文研究了TCS和TCC對26期黑斑蛙蝌蚪和46期非洲爪蛙蝌蚪的急性毒性。比較了TCS對26期黑斑蛙蝌蚪的96 h-LC50(441 μg·L-1)、46期非洲爪蛙蝌蚪的96 h-LC50(280 μg·L-1)；TCC對26期黑斑蛙蝌蚪的96 h-LC50(252 μg·L-1)、對46期非洲爪蛙蝌蚪的96 h-LC50(217 μg·L-1)。由于目前沒有化學(xué)品對蝌蚪急性毒性的分級標(biāo)準(zhǔn)，我們參考《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則》中關(guān)于農(nóng)藥對天敵兩棲動物急性毒性的分級標(biāo)準(zhǔn)[22]，即：LC50≤0.1 mg·L-1為劇毒，0.1 mg·L-1< LC50≤1.0 mg·L-1為高毒，1.0 mg·L-1< LC50≤10 mg·L-1為中毒，LC50> 10 mg·L-1為低毒，對TCC和TCS的毒性等級進行了大致劃分，認(rèn)為它們都屬高毒化學(xué)品。整體來看TCC的毒性略高于TCS，且TCS、TCC對非洲爪蛙蝌蚪的毒性略大于黑斑蛙蝌蚪。

表1 三氯生(TCS)和三氯卡班(TCC)對黑斑蛙蝌蚪的急性毒性

表2 三氯生(TCS)和三氯卡班(TCC)對非洲爪蛙蝌蚪的急性毒性

有研究報道，TCS對NF41、49、54、66期的非洲爪蛙蝌蚪的96 h-LC50分別為343 μg·L-1、259 μg·L-1、443 μg·L-1、664 μg·L-1[19]，TCS對日本青鳉魚仔魚和成魚的96 h-LC50分別為600 μg·L-1和1 700 μg·L-1；對斑馬魚胚胎和成魚的96 h-LC50為420 μg·L-1和340 μg·L-1，對黑頭呆魚成魚的96 h-LC50為260 μg·L-1，按照危險化學(xué)品魚類急性毒性分級試驗方法分級標(biāo)準(zhǔn)[23]，屬于高等毒性化學(xué)品。本文研究結(jié)果顯示TCS、TCC對非洲爪蛙蝌蚪和黑斑蛙蝌蚪都為高毒。這些結(jié)果表明，TCS、TCC對黑斑蛙蝌蚪和非洲爪蛙蝌蚪的急性毒性與對魚類的急性毒性相當(dāng)。與對鼠類的毒性不同，TCS對大鼠的LD50為5 000 mg·kg-1，按照我國化學(xué)品急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)[24]，屬低毒類化學(xué)品。由此看來，對鼠類具有低毒性的化學(xué)品，對水中生物卻可能有較高的毒性。因此，使用多種生物種測試化學(xué)品的毒性對于全面認(rèn)識化學(xué)品的生物安全性是必要的。

有研究表明，三氯生類殺菌劑主要通過污水排放進入環(huán)境，污水中和地表水中都有分布。一般地表水中的TCS和TCC污染水平在ng·L-1，從我們的研究數(shù)據(jù)來看，TCS和TCC對黑斑蛙蝌蚪和非洲爪蛙蝌蚪產(chǎn)生急性毒性的濃度要比環(huán)境濃度高1個或2個數(shù)量級。雖然如此，三氯生類殺菌劑仍然存在長期低劑量暴露的風(fēng)險。本研究測定了TCS和TCC在實驗室條件下對2種兩棲動物的急性毒性水平，此結(jié)果只能從一個側(cè)面反映2種抗菌劑對生態(tài)環(huán)境的毒性效應(yīng)，而難以全面準(zhǔn)確地反映出其實際毒害風(fēng)險。已有文獻報道了TCS和TCC在體內(nèi)和體外實驗中產(chǎn)生了內(nèi)分泌干擾效應(yīng)[25-30]，但是其作用機理仍不明確。因此，完全有必要對其環(huán)境行為、生態(tài)毒性和作用機理開展全面深入的研究。

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Acute Toxicity of Triclosan and Triclocarban to Amphibian Tadpoles

Gao Kun1,2, Chen Juan2, Li Yuanyuan2, Liu Chun1,*, Qin Zhanfen2

1. College of Environmental Science and Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang050018, China 2. State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China

Received 29 February 2016 accepted 11 March 2016

Triclosan (TCS) and triclocarban (TCC) are broad-spectrum antimicrobial agents used in personal care products. They have become ubiquitous in aquatic environment due to its wide use. However, information concerning their toxicities to amphibians is limited. This study aimed to investigate acute toxicities of TCS and TCC to Pelophylax nigromaculatus tadpoles and Xenopus laevis tadpoles. P. nigromaculatus (Gosner stage 26) and X. laevis (NF stage 46) at the first tadpole developmental stage were exposed to series of concentrations of TCS and TCC. Median lethal concentrations (LC50) for 24 h, 48 h, 72 h and 96 h were calculated. We found that 96 h-LC50for TCS to P. nigromaculatus tadpoles and X. laevis tadpoles were 441 μg·L-1and 280 μg·L-1, respectively, while 96 h-LC50for TCC to P. nigromaculatus tadpoles and X. laevis tadpoles were 252 μg·L-1and 217 μg·L-1, respectively. The data show that TCS and TCC have relative high toxicity to P. nigromaculatus tadpoles and X. laevis tadpoles, with higher toxicity to the latter. The toxicity of TCC to tadpoles is slightly higher than that of TCS.

triclosan; triclocarban; Pelophylax nigromaculatus; Xenopus laevis; tadpoles; acute toxicity

國家自然科學(xué)基金項目(21377153)；中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(B類)(XDB14040102)

高昆(1990-)，女，碩士，研究方向為環(huán)境毒理學(xué)，E-mail: 15832139933@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: liuchun@hebust.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20160229001

2016-02-29 錄用日期：2016-03-11

1673-5897(2016)4-226-06

X171.5

A

簡介：劉春(1976—)，男，博士，教授，主要從事水污染控制和環(huán)境生物技術(shù)研究工作。

高昆, 陳娟, 李圓圓, 等. 三氯生和三氯卡班對兩棲動物蝌蚪的急性毒性[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報，2016, 11(4): 226-231

Gao K, Chen J, Li Y Y, et al. Acute toxicity of triclosan and triclocarban to amphibian tadpoles [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(4): 226-231 (in Chinese)