王海斌，葉江華，孔祥海，丁力，邱豐艷，賈小麗,

1. 龍巖學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，龍巖 364012 2. 武夷學(xué)院 生態(tài)與資源工程學(xué)院，武夷山 354300 3. 福建農(nóng)林大學(xué) 福建省農(nóng)業(yè)生態(tài)過程與安全監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗室，福州 350002

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2種茶樹對銅脅迫的響應(yīng)及其組織銅化學(xué)形態(tài)變化的比較研究

王海斌1,3，葉江華2,3，孔祥海1，丁力1，邱豐艷1，賈小麗2,3,

1. 龍巖學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，龍巖 364012 2. 武夷學(xué)院 生態(tài)與資源工程學(xué)院，武夷山 354300 3. 福建農(nóng)林大學(xué) 福建省農(nóng)業(yè)生態(tài)過程與安全監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗室，福州 350002

為了分析不同茶樹對Cu脅迫的生理響應(yīng)及其組織中不同化學(xué)形態(tài)Cu的累積特性，本研究采用水培法，探討鐵觀音、肉桂2種茶樹在不同濃度Cu脅迫下，茶樹根系活力、葉綠素含量、茶樹組織Cu含量及不同化學(xué)形態(tài)Cu含量的變化，以期為重金屬對茶樹毒害機(jī)理和茶樹對重金屬的自我防御研究提供理論依據(jù)。結(jié)果表明，隨著Cu脅迫濃度的增加，茶樹根系活力及葉片葉綠素含量呈現(xiàn)下降趨勢，而與對照相比，鐵觀音下降的幅度遠(yuǎn)高于肉桂。不同茶樹品種在相同濃度Cu脅迫下，其根、莖、葉組織的Cu含量差異不顯著，而不同組織中則表現(xiàn)為根>葉>莖。不同化學(xué)形態(tài)Cu含量分析結(jié)果表明，隨著Cu脅迫濃度的升高，2種茶樹根部可交換態(tài)Cu、碳酸鹽結(jié)合態(tài)Cu、有機(jī)結(jié)合態(tài)Cu含量百分比呈現(xiàn)下降趨勢，而鐵錳氧化態(tài)Cu和殘留態(tài)Cu呈現(xiàn)上升趨勢；莖部可交換態(tài)Cu、有機(jī)結(jié)合態(tài)Cu含量百分比呈現(xiàn)下降趨勢，碳酸鹽結(jié)合態(tài)Cu、鐵錳氧化態(tài)Cu和殘留態(tài)Cu呈現(xiàn)上升趨勢；葉部可交換態(tài)Cu、碳酸鹽結(jié)合態(tài)Cu、有機(jī)結(jié)合態(tài)Cu含量、鐵錳氧化態(tài)Cu含量的百分比均呈現(xiàn)上升趨勢，而殘留態(tài)Cu呈現(xiàn)下降趨勢。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Cu脅迫下，鐵觀音茶樹根、葉部主要以采取提高有機(jī)結(jié)合態(tài)Cu的形式來降低Cu離子毒害，而肉桂則以提高鐵錳氧化態(tài)Cu形式降低Cu離子毒害，葉部則以提高鐵錳氧化態(tài)Cu和殘留態(tài)Cu的形式降低Cu離子毒害?？梢?，不同的茶樹在Cu脅迫下所表現(xiàn)解毒模式存在著一定的差異。

銅脅迫；茶樹；生理特性；化學(xué)形態(tài)

Received 14 November 2015 accepted 5 February 2016

銅(Cu)是植物生長所需的微量元素，是植物體內(nèi)多酚氧化酶、細(xì)胞色素氧化酶、抗壞血酸氧化酶等多種酶類組成成分之一，然而，植物攝入過量的Cu也會對植物的生長產(chǎn)生毒害作用[1]。植物對Cu離子的吸收是一種主動吸收的過程，植物根系吸收Cu離子后，在植物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，分布并積累于不同的部位。因此，當(dāng)外界環(huán)境存在較大量的Cu時，極易導(dǎo)致植物攝入過量Cu并在植物體內(nèi)積累，影響植物生長[2-3]。

眾多學(xué)者開展了大量研究，探討重金屬脅迫對植物生長的影響，并認(rèn)為高劑量重金屬對植物生長產(chǎn)生一定的毒害作用并形成普遍共識[4-6]。然而重金屬對植物生長的影響并不是停留在表面的毒害，重金屬離子進(jìn)入到植物體后，其在植物體的分布及其存在的形態(tài)是影響植物生長的關(guān)鍵，不同的植物其體內(nèi)重金屬的形態(tài)、分布特征、活性、遷移能力等存在著顯著的差異[7-8]。例如，黑麥草在種植過程中可通過自身的分泌物改變土壤中的重金屬形態(tài)，將活性轉(zhuǎn)惰性，進(jìn)而減少重金屬的攝入和毒害作用[9]。熱帶海藻泰來藻和海菖藻可將根部吸收的Cu轉(zhuǎn)化為鐵錳氧化態(tài)Cu降低毒性，而轉(zhuǎn)移進(jìn)入莖部的Cu以有機(jī)蛋白結(jié)合態(tài)形式進(jìn)行固定，進(jìn)入葉部的Cu離子則以殘留態(tài)不可利用Cu的形式存在[10]?？梢娭参镌谖者^量重金屬離子后，通過自身特有的生理機(jī)制對過量重金屬進(jìn)行轉(zhuǎn)化降低毒性以達(dá)到抵抗重金屬脅迫的效果。

茶樹是喜酸作物，土壤pH值在4.5～6.0之間時適合于茶樹種植，其中pH值為5.5時最適合茶樹種植[11]。茶樹在連續(xù)栽培過程中極易導(dǎo)致土壤酸化，引起茶樹土壤酸化的原因眾多，包含自然因素、人為因素、環(huán)境因素、降雨因素、土壤自身因素等[12-13]。土壤酸化程度的加重致使土壤中Cu離子活化程度提高，土壤中活性Cu離子含量增加，茶樹Cu離子吸收量增大，茶樹受Cu離子的危害程度加重[14]。近年來，由于茶葉經(jīng)濟(jì)效益的提升，為了有效保證茶葉的產(chǎn)量，茶園中含金屬的化肥、農(nóng)藥、有機(jī)肥等大量施用，一方面導(dǎo)致茶園土壤重金屬含量增加，另一方面引起茶樹體內(nèi)重金屬元素積累量提升[15-17]。然而，長期以來眾多學(xué)者主要集中探討茶葉成品加工后重金屬的溶出率、重金屬對茶樹生長的影響，茶樹重金屬的累積特性等[18-20]，而對于茶樹受到重金屬脅迫后，金屬離子在茶樹體內(nèi)的積累及形態(tài)變化并未做深入的研究。本研究以福建著名的茶樹品種鐵觀音、肉桂為研究對象，探討不同濃度Cu脅迫下，2種茶樹響應(yīng)Cu脅迫的生理特性及其茶樹Cu累積特性和銅形態(tài)變化，以期為研究重金屬對茶樹毒害機(jī)理和茶樹對重金屬的自我防御提供理論依據(jù)。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 實(shí)驗材料

福建安溪鐵觀音1年生無性系茶苗，茶苗高度35 cm左右，主莖約4.2 mm；福建武夷山1年生無性系茶苗，茶苗高度33 cm左右，主莖4.1 mm。

實(shí)驗采用水培法，將茶苗置于預(yù)培養(yǎng)液中培養(yǎng)直至恢復(fù)正常生長；恢復(fù)生長后的茶苗移至含有不同濃度Cu離子的溶液中進(jìn)行Cu暴露；暴露結(jié)束后收集水培茶樹的新根、一芽二葉及其莖部測定茶樹不同組織Cu含量及不同化學(xué)形態(tài)Cu含量；同時，取樣前先采用葉綠素測定儀測定不同濃度Cu暴露下茶樹倒二葉的葉綠素含量，收集的根部樣品中一部分用于測定不同濃度Cu暴露下茶樹根系活力。

1.2 茶苗的預(yù)培養(yǎng)

將取回的茶苗用自來水淋洗清潔植株，清洗完成后用蒸餾水沖洗植株5次，洗凈后的茶苗定植于裝有3 L蒸餾水的黑色塑料盆中(容量5 L)，每盆定植8株(每種茶樹30盆)，培養(yǎng)7 d后，將蒸餾水倒凈，添加3 L營養(yǎng)液進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)，培養(yǎng)時間30 d。培養(yǎng)條件為：采用微型氣泵連續(xù)供氣，每隔3 h，停止供氣1 h，每天傍晚18:00左右補(bǔ)充水培液至3 L，每7 d更換1次培養(yǎng)液，培養(yǎng)室溫度23～25 ℃，空氣濕度70%～75%，光照強(qiáng)度2 000 Lx，光照時間10 h (8:00～18:00)，預(yù)培養(yǎng)時間30 d[22]。預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，取出茶苗，用蒸餾水反復(fù)沖洗茶苗的植株，特別是根系位置，除去雜質(zhì)及根系所帶營養(yǎng)液及無機(jī)離子，沖洗后的茶苗置于含Cu溶液中進(jìn)行Cu暴露處理。

1.3 茶苗Cu鹽溶液培養(yǎng)

選擇預(yù)培養(yǎng)后長勢較為一致的茶苗按上述水培條件進(jìn)行Cu鹽水溶液試驗，培養(yǎng)液中不添加營養(yǎng)成分。水培液中的Cu鹽質(zhì)量濃度設(shè)定為40 mg·L-1、80 mg·L-1、120 mg·L-1，以未添加Cu鹽設(shè)為對照(0 mg·L-1)，每個處理設(shè)置6個重復(fù)，每種茶樹24盆，處理時間30 d。處理結(jié)束后，先行測定不同處理下茶樹倒二葉(功能葉)的葉綠素含量和根系活力。此后將茶樹取出用蒸餾水反復(fù)沖洗茶樹，去除茶樹表面離子，特別是根系部位。沖洗完成后，將茶樹的根、莖、葉分開用于測定茶樹不同組織的Cu含量及不同化學(xué)形態(tài)Cu含量。

1.4 茶苗葉綠素含量和根系活力測定

茶苗葉綠素含量測定：采用葉綠素儀(SPAD-502，日本)測定茶樹倒二葉的葉綠素含量(SPAD值)，每個樣品重復(fù)6次。

茶苗根系活力測定[23]：稱取新鮮根(距茶樹根尖1 cm)樣品0.5 g，放入試管中并加入5 mL的0.4%的TTC溶液和5 mL濃度為0.067 mol·L-1pH7.0的磷酸緩沖液，并將其置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃，暗處保存1 h，此后加入1 mol·L-1的硫酸溶液2 mL終止反應(yīng)。將根取出，吸干水分后，添加4 mL的乙酸乙酯和少量石英砂一起研磨提取三苯基甲腙，將提取液轉(zhuǎn)移進(jìn)試管中，用少量的乙酸乙酯洗滌殘渣并一同移入試管中，以乙酸乙酯定容至10 mL，采用分光光度計于485 nm下比色，計算根系活力，每個樣品3次重復(fù)。

1.5 茶苗組織Cu含量測定[22]

將一部分茶苗的根、莖、葉于80 ℃下干燥至恒重并分別粉碎過40目篩，待測。分別稱取上述樣品0.5 g置于150 mL聚四氟乙烯燒杯中，加入濃硝酸和高氯酸混合液(體積比5:1) 25 mL，蓋上表面皿浸泡過夜。次日于電熱板上加熱消解，消解溫度為160 ℃，消解至消化液呈淡黃色或無色，體積約為1～2 mL為止。冷卻后，用少量蒸餾水多次洗滌燒杯，合并洗滌液并轉(zhuǎn)入50 mL的容量瓶中，定容，混勻過濾，待測，每個樣品設(shè)置3個重復(fù)。同時做試劑空白作為對照。采用原子吸收分光光度法測定。

1.6 茶苗組織不同化學(xué)形態(tài)Cu含量測定

茶苗組織不同化學(xué)形態(tài)Cu的提取采用化學(xué)試劑逐步提取法[24-25]，提取劑及其提取順序依次為：1) 80%乙醇提取，主要提取可交換態(tài)Cu；2) 去離子水提取，主要提取碳酸鹽結(jié)合態(tài)Cu；3) 1 mol·L-1的氯化鈉溶液提取，主要提取有機(jī)結(jié)合態(tài)Cu；4) 2%醋酸提取，主要提取鐵錳氧化態(tài)Cu；5) 0.6 mol·L-1的鹽酸提取，主要提取殘留態(tài)Cu。

提取方法：分別稱取茶苗組織鮮樣樣品2 g置于燒杯中，加入25 mL提取劑，使樣品保持浸沒狀態(tài)并將其置于30 ℃恒溫箱中放置18 h后，回收提取液。繼續(xù)添加同樣體積的相同提取劑浸提2 h后再回收提取液，重復(fù)提取3次，即在24 h內(nèi)同一提取劑提取4次。同一提取劑的回收提取液轉(zhuǎn)移至150 mL的燒杯中。按照該方法對同一樣品進(jìn)行不同提取劑順序、連續(xù)提取。樣品提取過程中，每個樣品設(shè)置3個平行重復(fù)。

測定方法：將不同提取劑提取后獲得的提取液蒸發(fā)至近干，用去離子水定容至10 mL，相應(yīng)提取劑作為空白對照，采用原子吸收分光光度法測定Cu含量。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗數(shù)據(jù)分析過程中的方差、顯著性分析以及相關(guān)性分析均使用Excel軟件和DPS軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果(Results)

2.1 Cu暴露下不同茶樹根系活力、葉綠素含量分析

Cu暴露下，茶樹根系活力及葉片葉綠素含量分析結(jié)果表明(圖1)。隨著Cu濃度的增加茶樹根系活力及葉片葉綠素含量呈現(xiàn)下降趨勢。與對照相比，隨著Cu濃度的升高(40～120 mg·L-1)，鐵觀音的根系活力下降率由21.89%上升至50.57%，肉桂則由8.70%上升至30.04%。對于葉綠素含量，隨著Cu濃度的升高(40～120 mg·L-1)，鐵觀音的葉綠素含量下降率由17.81%上升至38.30%，肉桂則由12.49%上升至27.81%?？梢?，Cu暴露下，茶樹的根系活力、葉綠素含量受到影響。2個不同的茶樹品種，鐵觀音對Cu脅迫的敏感性高，表現(xiàn)為下降率較大。

2.2 Cu暴露下不同茶樹組織Cu含量分析

茶樹不同組織Cu含量分析結(jié)果表明(表1)，Cu暴露下，隨著Cu濃度的升高，茶樹不同組織的Cu含量呈現(xiàn)上升趨勢。不同茶樹品種在相同濃度Cu暴露下，其根、莖、葉組織的Cu含量差異不顯著。但是，同一茶樹品種不同組織在Cu暴露下，其組織內(nèi)部Cu含量存在明顯的區(qū)別。表現(xiàn)為，在相同濃度Cu暴露下鐵觀音、肉桂不同組織中Cu含量以根部最高、葉片次之、莖部最少?？梢?，Cu暴露下，2種茶樹不同組織內(nèi)部Cu元素累積特性相似，而同一茶樹不同組織對Cu元素的積累存在一定的差異。

圖1 Cu暴露下不同茶樹根系活力和葉綠素含量變化Fig. 1 Root activity and chlorophyll content of tea tree under Cu stress

表1 Cu暴露下不同茶樹組織Cu含量變化

注：同列不同小寫字母表示不同茶樹相應(yīng)指標(biāo)在P<0.05水平差異顯著。

Note: Different small letters in the same column indicate the corresponding index of different tea tree have significant difference at P<0.05 levels, respectively.

圖2 Cu暴露下不同茶樹根部不同化學(xué)形態(tài)Cu所占百分比 (左：肉桂；右：鐵觀音)注：A，可交換態(tài)銅；B，碳酸鹽結(jié)合態(tài)銅；C，有機(jī)結(jié)合態(tài)銅；D，鐵錳氧化態(tài)銅；E，殘留態(tài)銅；下同。Fig. 2 Percentages of Cu with different chemical forms in roots from different tea trees (Left: Rougui; Right: Tieguanyin)Note: A, Exchangeable Cu; B, Carbonate-bound Cu; C, Organic-bound Cu; D, Fe-Mn oxidation bound Cu; E, Residual Cu; The same below.

圖3 Cu暴露下不同茶樹莖部不同化學(xué)形態(tài)Cu所占百分比 (左：肉桂；右：鐵觀音)Fig. 3 Percentages of Cu with different chemical forms in shoots from different tea trees (Left: Rougui; Right: Tieguanyin)

2.3 Cu暴露下茶樹組織不同化學(xué)形態(tài)Cu含量分析

茶樹根部不同化學(xué)形態(tài)Cu含量百分比分析結(jié)果表明(圖2)，隨著Cu濃度的增加(0～120 mg·L-1)，肉桂根部可交換態(tài)Cu、碳酸鹽結(jié)合態(tài)Cu、有機(jī)結(jié)合態(tài)Cu含量百分比呈現(xiàn)下降趨勢，變化范圍分別在9.44%～22.35%、7.72%～13.92%、15.96%～49.27%，鐵錳氧化態(tài)Cu和殘留態(tài)Cu呈現(xiàn)上升趨勢，變化范圍在15.96%～49.27%和10.34%～21.22%。鐵觀音根部可交換態(tài)Cu、碳酸鹽結(jié)合態(tài)Cu、有機(jī)結(jié)合態(tài)Cu含量百分比呈現(xiàn)下降趨勢，變化范圍分別在8.07%～24.39%、10.79%～15.80%、24.61%～28.99%，鐵錳氧化態(tài)Cu和殘留態(tài)Cu呈現(xiàn)上升趨勢，變化范圍在9.97%～35.10%和20.86%～21.44%。

茶樹莖部不同化學(xué)形態(tài)Cu含量百分比分析結(jié)果表明(圖3)，隨著Cu濃度的增加(0～120 mg·L-1)，2種茶樹莖部可交換態(tài)Cu、有機(jī)結(jié)合態(tài)Cu含量百分比呈現(xiàn)下降趨勢，且2種茶樹的變化范圍相當(dāng)，即肉桂的變化范圍在4.34%～5.67%和62.41%～44.84%，而鐵觀音的變化范圍在4.21%～5.15%和45.24%～63.24%；碳酸鹽結(jié)合態(tài)Cu、鐵錳氧化態(tài)Cu和殘留態(tài)Cu含量百分比，2種茶樹均呈現(xiàn)上升趨勢，表現(xiàn)為肉桂的變化范圍在8.51%～12.82%、14.89%～21.37%和8.51%～16.63%，鐵觀音的變化范圍則為9.56%～12.70%、12.50%～21.62%和9.56%～16.23%?？梢姡珻u暴露下，隨著Cu濃度的增加，2種茶樹莖部不同化學(xué)形態(tài)Cu含量的百分比變化趨勢一致，且同一化學(xué)形態(tài)Cu含量百分比，2種茶樹變化范圍較為相似。

圖4 Cu暴露下不同茶樹葉部不同化學(xué)形態(tài)Cu所占百分比 (左：肉桂；右：鐵觀音)Fig. 4 Percentages of Cu with different chemical forms in leaves from different tea trees (Left: Rougui; Right: Tieguanyin)

茶樹葉部不同化學(xué)形態(tài)Cu含量百分比分析結(jié)果表明(圖4)，隨著Cu濃度的增加(0～120 mg·L-1)，2種茶樹葉部可交換態(tài)Cu、碳酸鹽結(jié)合態(tài)Cu、有機(jī)結(jié)合態(tài)Cu含量、鐵錳氧化態(tài)Cu含量的百分比均呈現(xiàn)上升趨勢，肉桂葉部的變化范圍分別在12.79%～14.59%、5.05%～5.77%、6.40%～7.18%、13.13%～20.85%，鐵觀音葉部的變化范圍則分別在12.08%～17.27%、4.91%～8.94%、5.66%～9.12%、11.70%～15.66%。葉部殘留態(tài)Cu含量百分比，2種茶樹均呈下降趨勢，表現(xiàn)為肉桂從62.63%下降至51.61%，鐵觀音從65.66%下降至49.02%?？梢?，當(dāng)高濃度Cu暴露下(120 mg·L-1)，鐵觀音除鐵錳氧化態(tài)Cu和殘留態(tài)Cu含量的百分比低于肉桂，其余化學(xué)形態(tài)均高于肉桂。

2.5 Cu暴露濃度、茶樹生理指標(biāo)及對應(yīng)組織Cu含量的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果表明(表2、表3)，Cu暴露濃度與鐵觀音根系活力及葉片的葉綠素含量呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)，與鐵觀音根部Cu含量、葉片Cu含量及對應(yīng)的根部、葉片不同化學(xué)形態(tài)Cu含量呈顯著正相關(guān)。鐵觀音根系活力與根部Cu含量及根部不同化學(xué)形態(tài)Cu含量呈顯著負(fù)相關(guān)；鐵觀音根部Cu含量與根部不同化學(xué)形態(tài)Cu含量呈顯著正相關(guān)。鐵觀音葉片葉綠素含量與葉片Cu含量及葉片不同化學(xué)形態(tài)Cu含量呈顯著負(fù)相關(guān)；鐵觀音葉片Cu含量與葉片不同化學(xué)形態(tài)Cu含量呈顯著正相關(guān)。肉桂在不同濃度Cu暴露下，Cu暴露濃度、茶樹根系活力、葉片葉綠素含量及對應(yīng)的根部、葉片Cu含量、不同化學(xué)形態(tài)Cu之間的相關(guān)性變化與鐵觀音一致(表4、表5)。

3 討論(Discussion)

Cu元素是植物生長所需的微量元素之一，植物對Cu離子的吸收是一種主動吸收的過程，植物根系吸收Cu離子后，在植物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，分布并積累于不同的部位[26]。然而，植物攝入過量的金屬離子極易導(dǎo)致植物體的光合作用能力及呼吸作用受到抑制，葉綠體及線粒體受到破壞，進(jìn)而影響植物的產(chǎn)量和品質(zhì)[27-28]。本研究結(jié)果表明，Cu脅迫下，隨著Cu濃度的升高，茶樹不同組織的Cu含量呈現(xiàn)上升趨勢，茶樹不同組織中Cu含量趨勢為根>葉>莖，2種茶樹相同組織中的Cu的累積量相似，差異不顯著(表1)?？梢?，不同茶樹在對Cu元素的吸收積累上存在著一定的相似性。然而2種茶樹對于Cu脅迫的反應(yīng)是否也存在一致性呢？據(jù)報道，植物根系活力的強(qiáng)、弱，葉綠素含量的高低可用于反應(yīng)植物對重金屬離子的耐受性及植物對逆境條件下的適應(yīng)性[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著Cu脅迫濃度的增加不同茶樹根系活力及葉片葉綠素含量呈現(xiàn)下降趨勢。然而，與對照相比，相同濃度Cu脅迫下，鐵觀音根系活力及葉綠素含量的下降率明顯高于肉桂(圖1)?？梢?，Cu脅迫易于導(dǎo)致茶樹的生理特性發(fā)生變化，鐵觀音對Cu脅迫的敏感性高于肉桂，肉桂具有更強(qiáng)的耐受性及對逆境條件的適應(yīng)性。

表2 Cu暴露下鐵觀音茶樹根系不同指標(biāo)的相關(guān)性分析

注：*顯著相關(guān)；**極顯著相關(guān)；下同。

Note: * Significant correlation at the 0.05 level; ** Significant correlation at the 0.01 level; the same below.

表3 Cu暴露下鐵觀音茶樹葉片不同指標(biāo)的相關(guān)性分析

表4 Cu暴露下肉桂茶樹根系不同指標(biāo)的相關(guān)性分析

表5 Cu暴露下肉桂茶樹葉片不同指標(biāo)的相關(guān)性分析

不同植物對金屬離子的耐受性一方面是由于本身機(jī)制對于金屬離子的拮抗作用不同，另一方面是由于植物體內(nèi)本身在金屬離子吸收后的轉(zhuǎn)化與解毒機(jī)制上存在差異[29-31]。據(jù)報道，植物在吸收金屬離子后，在植物體內(nèi)將金屬離子轉(zhuǎn)化為不同的化學(xué)形態(tài)，而不同化學(xué)形態(tài)金屬離子的含量及其所占比例是植物響應(yīng)金屬離子毒害的策略[32]。本研究發(fā)現(xiàn)，Cu脅迫下，隨著Cu濃度的增加，茶樹不同組織可交換態(tài)Cu、碳酸鹽結(jié)合態(tài)Cu、鐵錳氧化態(tài)Cu、有機(jī)結(jié)合態(tài)Cu、殘留態(tài)Cu含量呈現(xiàn)上升趨勢，且同一茶樹組織在不同濃度Cu脅迫下組織內(nèi)部Cu含量差異達(dá)到顯著水平(圖2、圖3、圖4)。據(jù)報道，可交換態(tài)形式存在的金屬是對植物營養(yǎng)吸收和毒害的關(guān)鍵形態(tài)，碳酸鹽態(tài)金屬結(jié)合較弱，容易釋放，遷移性較強(qiáng)，而2種形態(tài)的金屬的占比可作為金屬離子被植物利用并對植物造成危害能力的評價因子[25,33]。有機(jī)結(jié)合態(tài)Cu主要是以蛋白質(zhì)結(jié)合形式存在的Cu，Cu與蛋白質(zhì)大量結(jié)合后極易影響植物生長發(fā)育過程各種酶活性及功能的表達(dá)，進(jìn)而影響植物的生長[10]。因此，植物在金屬離子脅迫下，常常通過特有的機(jī)制將有毒離子固定形成難溶的化合物，這種化合物一般以鐵錳氧化態(tài)和殘留態(tài)的形式存在[34-35]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在高濃度Cu脅迫下(120 mg·L-1)，鐵觀音根部可交換態(tài)Cu和碳酸鹽結(jié)合態(tài)Cu占比為18.86%，而肉桂則為17.16%。其次分析發(fā)現(xiàn)，高濃度Cu脅迫下鐵觀音根部有機(jī)結(jié)合態(tài)Cu占比(24.61%)明顯高于肉桂(12.35%)、鐵錳氧化態(tài)Cu占比(35.10%)則低于肉桂(49.27%)而殘留態(tài)Cu占比2種茶樹差異不大，表現(xiàn)為鐵觀音殘留態(tài)Cu占比為21.44%，肉桂為21.22%?？梢?，在高濃度Cu脅迫下(120 mg·L-1)，2種茶樹根部存在具有遷移及毒性的化學(xué)形態(tài)Cu占比相當(dāng)，但鐵觀音在響應(yīng)Cu脅迫時采取提高根部蛋白與Cu離子的結(jié)合量以降低毒性，表現(xiàn)為鐵觀音(24.61%)有機(jī)結(jié)合態(tài)Cu含量明顯高于肉桂(12.35%)，這種方式一方面降低了Cu離子直接毒性，但另一方面間接影響了根部蛋白質(zhì)的活性與表達(dá)，影響根部的生長。而肉桂則是大量提高鐵錳氧化態(tài)Cu結(jié)合率來降低Cu離子毒害，一方面即降低了Cu離子毒害，將活性Cu離子轉(zhuǎn)化為惰性態(tài)，一方面又保證了植物的生長。前述研究結(jié)果也證實(shí)，Cu脅迫下，肉桂的根系活力明顯高于鐵觀音。2種茶樹莖部不同化學(xué)形態(tài)Cu含量的百分比變化趨勢一致，且同一化學(xué)形態(tài)Cu含量百分比，2種茶樹變化范圍較為相似?？梢?，2種茶樹莖部在響應(yīng)Cu脅迫上具有一定的相似性。2種茶樹葉部不同化學(xué)形態(tài)Cu含量占比分析結(jié)果表明，當(dāng)高濃度Cu脅迫下(120 mg·L-1)，鐵觀音除鐵錳氧化態(tài)Cu和殘留態(tài)Cu含量的百分比低于肉桂，其余形態(tài)均高于肉桂。可見，Cu脅迫下，與肉桂相比，鐵觀音葉部存在較多的具有毒性作用的可交換態(tài)Cu、碳酸鹽結(jié)合態(tài)Cu，其次葉部蛋白與Cu結(jié)合量明顯高于肉桂，鐵觀音的生長受影響程度高于肉桂。前述，2種茶樹葉部的葉綠素含量變化趨勢也證實(shí)了，在相同濃度Cu脅迫下肉桂葉綠素含量高于鐵觀音且與對照相比其下降率也低于鐵觀音。

此外，不同茶樹根系活力、葉綠素含量與脅迫Cu濃度呈顯著負(fù)相關(guān)，而脅迫Cu濃度與茶樹組織中不同化學(xué)形態(tài)Cu含量呈顯著正相關(guān)(表2、表3、表4、表5)?？梢?，本研究中設(shè)置的Cu濃度脅迫下，隨著脅迫Cu濃度的升高，茶樹根系活力、葉綠素含量呈現(xiàn)下降趨勢，而茶樹組織中不同化學(xué)形態(tài)Cu量呈現(xiàn)上升趨勢。這種趨勢符合一般植物在金屬離子脅迫下，植物所表現(xiàn)離子吸收積累特性。

綜上所述，Cu脅迫下，隨著Cu濃度的升高，2種茶樹不同組織的Cu含量呈現(xiàn)上升趨勢，并表現(xiàn)為根部Cu積累量最大，葉部次之、莖部最少，但同一組織2種茶樹之間差異不顯著。然而在茶樹根系活力及葉片葉綠素含量上，相同濃度Cu脅迫下，肉桂高于鐵觀音。同時，在Cu脅迫下，鐵觀音茶樹根部、葉部主要以采取提高有機(jī)結(jié)合態(tài)Cu的形式來降低Cu離子毒害，而肉桂在根部則主要以提高鐵錳氧化態(tài)Cu形式降低Cu離子毒害，葉部則以提高鐵錳氧化態(tài)Cu和殘留態(tài)Cu的形式降低Cu離子毒害?？梢姡煌牟铇湓阢~脅迫下所表現(xiàn)解毒模式存在著一定的差異。然而，不同化學(xué)形態(tài)Cu在植物組織中分布后是如何影響不同組織中細(xì)胞的變化進(jìn)而影響植物的生長和發(fā)育，還有待于進(jìn)一步深入研究。

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Comparative Study on Biological Responses and Cu Speciation in Tissues of Two Different Tea Trees after Cu Exposure

Wang Haibin1,3, Ye Jianghua2,3, Kong Xianghai1, Ding Li1, Qiu Fengyan1, Jia Xiaoli2,3,*

1. College of Life Sciences, Longyan University, Longyan 364012, China 2. College of Ecology and Resources Engineering, Wuyi University, Wuyishan 354300, China 3. Fujian Provincial Key Laboratory of Agroecological Processing and Safety Monitoring, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 35002, China

In order to analyze physiological responses of different tea trees to Cu stress and accumulation characteristics of Cu with different chemical forms in different tissues of tea tree, this paper adopted water culture method, and investigated root activity, chlorophyll content, Cu content in different tissues and Cu content with different chemical forms of Tieguanyin and Rougui tea tree under Cu stress with different concentrations. It is hoping to provide theoretical foundation for studies on the mechanism of heavy metal toxicity in tea tree and self-defense of tea tree to heavy metal. Results showed that root activity and chlorophyll content of tea tree decreased with the increase of Cu concentration, but decrease of Tieguanyin was larger than Rougui as compared with the control. At the same concentration of Cu stress, Cu contents in tea tree root, shoot and leaf had no significant difference among different treatments, and followed the order as root> leaf> shoot. The content percentages of exchangeable Cu, carbonate-bound Cu, organic-bound Cu from two tea tree roots had downward trends, while Cu with Fe-Mn oxidation state and residual Cu had upward trends as stress concentration increased. Content percentages of exchangeable Cu, organic-bound Cu in the shoot decreased, and carbonate-bound Cu, Cu with Fe-Mn oxidation state, and residual Cu increased. Content percentages of exchangeable Cu, carbonate-bound Cu, organic-bound Cu and Cu with Fe-Mn oxidation state in the leaf appeared to increase, while residual Cu declined. Further analysis indicated that organic-bound Cu was mainly used to reduce Cu2+toxicity under Cu stress in roots and leaves of Tieguanyin. In contrast, Rougui roots reduced Cu2+toxicity by increasing Cu with Fe-Mn oxidation state and its leaves reduced Cu2+toxicity by increasing Cu with Fe-Mn oxidation state and residual Cu. Thus it is indicated that detoxification patterns of different tea tree varieties are different under Cu stress.

Cu stress; tea tree; physiological characteristics; chemical forms

南平市科技計劃項目(N2013X01-6)；福建省農(nóng)業(yè)生態(tài)過程與安全監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗室(福建農(nóng)林大學(xué))開放基金；武夷學(xué)院青年專項(XQ201015)；龍巖學(xué)院“人才引進(jìn)項目”(LB2015001)

王海斌(1983-)，男，漢族，博士，講師，研究方向為植物生理與分子生態(tài)學(xué)，E-mail: w13599084845@sina.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: jcjyx@126.com;

10.7524/AJE.1673-5897.20151114002

2015-11-14 錄用日期：2016-02-05

1673-5897(2016)4-216-10

X171.5

A

簡介：賈小麗(1980—)，女，植物學(xué)博士，副教授，主要研究方向為植物生理與分子生態(tài)學(xué)，發(fā)表學(xué)術(shù)論文30余篇。

王海斌, 葉江華, 孔祥海, 等. 2種茶樹對銅脅迫的響應(yīng)及其組織銅化學(xué)形態(tài)變化的比較研究[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報，2016, 11(4): 216-225

Wang H B, Ye J H, Kong X H, et al. Comparative study on biological responses and Cu speciation in tissues of two different tea trees after Cu exposure [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(4): 216-225 (in Chinese)