趙 芹，林 棟，劉海梅

（1.魯東大學(xué)食品工程學(xué)院，山東 煙臺 264025；2.濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 煙臺 264003）

海參皂苷Echinoside A通過uPA信號通路抑制高轉(zhuǎn)移95D細胞轉(zhuǎn)移

趙 芹1，林 棟2，劉海梅1

（1.魯東大學(xué)食品工程學(xué)院，山東 煙臺 264025；2.濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 煙臺 264003）

研究海參皂苷Echinoside A對高轉(zhuǎn)移人肺巨細胞癌95D細胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響及其分子機制。采用3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽法檢測Echinoside A對95D細胞生長的影響；采用Transwell實驗、黏附實驗評價Echinoside A抗95D細胞轉(zhuǎn)移活性；采用雞胚尿囊膜（chicken chorioallantoic membrane，CAM）實驗評價Echinoside A抗血管新生活性；采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)和蛋白質(zhì)印跡法檢測95D細胞轉(zhuǎn)移相關(guān)基因和蛋白的表達。結(jié)果表明，Echinoside A能顯著降低95D細胞增殖（P＜0.01）、侵襲（P＜0.01）、遷移（P＜0.01）以及黏附能力（P＜0.01）；還能顯著抑制CAM上的血管新生。Echinoside A能顯著降低尿激酶型纖溶酶原激活劑（urokinase plasminogen activator，uPA）、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）-2、MMP-9 mRNA的表達，顯著上調(diào)金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMP）-1、TIMP-2 mRNA的表達，同時在基因和蛋白水平顯著下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子的表達。提示Echinoside A可通過調(diào)控uPA信號通路，保護細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而抑制95D細胞轉(zhuǎn)移。

海參皂苷；95D細胞；腫瘤；轉(zhuǎn)移；血管新生；信號通路

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最主要的生物學(xué)特征，是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)以及患者臨床死亡的主要原因。腫瘤轉(zhuǎn)移過程主要包括細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）和基底膜（basement membrane，BM）的降解，局部浸潤的產(chǎn)生，腫瘤細胞與血管內(nèi)皮細胞的黏附，通過血管和淋巴管轉(zhuǎn)移到遠端器官，然后形成新的轉(zhuǎn)移灶。當(dāng)腫瘤惡性增殖超過2 mm3之后，其生長則依賴于腫瘤組織中的血管新生[1]。新生血管的形成能向腫瘤組織及時輸送營養(yǎng)及排出廢物，加速其自身的分裂與增殖，同時也為腫瘤細胞向周圍組織進一步轉(zhuǎn)移提供了通路[2]。目前，針對腫瘤轉(zhuǎn)移過程中抗癌細胞遷移、黏附、抗ECM和BM降解和抗腫瘤血管生成等仍是抑制腫瘤轉(zhuǎn)移研究的關(guān)鍵內(nèi)容。

海參皂苷是海參特有的一類三萜皂苷，也是海參中重要的生物活性成分之一。大量研究發(fā)現(xiàn)，其具有抑菌[3]、調(diào)節(jié)膽固醇代謝[4]、降血壓[5]、改善高尿酸血癥[6]和促進造血[7]等生理活性，其顯著的抗腫瘤活性更是引起廣泛的關(guān)注[8-9]。革皮氏海參（Pearsonothuria graeffei）食用價值低，但是皂苷含量高達3.514%。Echinoside A是革皮氏海參皂苷的主要成分，約占總量的65%左右，已被證實具有顯著的體內(nèi)體外抑制腫瘤生長的活性[10]。前期研究發(fā)現(xiàn)革皮氏海參皂苷ds-Echinoside A具有顯著的抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性，可通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）信號通路，下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）-9和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growthfactor，VEGF）的表達，從而抑制肝癌細胞HepG2轉(zhuǎn)移[11]，但目前對Echinoside A抗腫瘤轉(zhuǎn)移的活性及作用機理尚缺乏系統(tǒng)的研究。本實驗選用高轉(zhuǎn)移細胞株95D為研究對象，深入研究Echinoside A對95D細胞遷移、黏附、侵襲和血管新生各環(huán)節(jié)的影響和作用機理，為挖掘海參皂苷的藥理功效，提高低值海參的附加值提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海參皂苷單體Echinoside A，以革皮氏海參為原料，采用高速逆流色譜法獲得，純度為95.5%，其分子式為C54H87O26SNa，相對分子質(zhì)量為1 206，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。

人肺巨細胞癌95D、人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC） 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心；RPMI-1640培養(yǎng)基、F-12K培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal calf serum ，F(xiàn)BS）、新生牛血清 美國Gibco公司；3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT） 美國Amresco公司；Matrigel基質(zhì)膠 美國BD公司；Trizol試劑美國Invitrogen公司；DNA Marker DL2000、Taq DNA聚合酶 大連TaKaRa生物工程有限公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶 美國Promega公司；引物和隨機引物 上海生工生物技術(shù)有限公司；GAPDH多克隆抗體、VEGF抗體、二抗 美國Santa Cruz公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

圖1 Echinoside A的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structure of Echinoside A

1.2 儀器與設(shè)備

Transwell小室 美國Corning公司；CKX41型倒置顯微鏡 日本Olympus公司；BJ5060UV型CO2培養(yǎng)箱德國Heraeus公司；680型酶標儀 美國Bio-Rad公司；TC-96 Life Pro基因擴增儀 杭州博日科技有限公司；JS-780全自動凝膠成像分析儀 上海培清科技有限公司；DYCP-40C型轉(zhuǎn)膜電泳儀、WD-9405A型脫色搖床北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

95D細胞培養(yǎng)于含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中；HUVEC細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的F-12K培養(yǎng)基中，其中均含2%青/鏈霉素。2 種細胞均置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞長成單層融合狀態(tài)后，以0.25%胰蛋白酶消化傳代。選擇對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3.2 MTT法檢測Echinoside A對95D細胞增殖活性的影響

95D細胞以6×104個/mL的濃度接種于96 孔板內(nèi)，每孔100 μL。24 h后吸棄培養(yǎng)基，分別加入200 μL含不同濃度Echinoside A（0.00、0.42、0.83、1.24、1.66 μmol/L）的完全培養(yǎng)基，每組4 個復(fù)孔，分別培養(yǎng)6、12、24 h。采用MTT法測定OD570nm值，擬合曲線求出半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.3.3 Transwell小室法檢測Echinoside A對95D細胞侵襲和遷移的影響

95D細胞以無血清RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度至5×105個/mL。侵襲實驗加入經(jīng)500 μg/mL Matrigel包被Transwell小室上室中，模擬基底膜；遷移實驗加入未經(jīng)包被的Transwell小室上室中，每孔100 μL。各組分別加入150 μL含不同濃度Echinoside A無血清培養(yǎng)基，使Echinoside A終濃度分別為0.00、0.20、0.40 μmol/L。下室加入750 μL含20% FBS的完全培養(yǎng)基，于37 ℃孵育24 h后，取出Transwell小室，用棉簽擦去上層膜面上的細胞，穿過基底膜的細胞黏附于膜下層，用2.5%戊二醛固定30 min后，以0.1%結(jié)晶紫染色15 min。每孔隨機取5 個視野，計數(shù)視野的細胞數(shù)，求平均值，按公式（1）計算侵襲率或遷移率。

1.3.4 黏附實驗檢測Echinoside A對95D細胞黏附能力的影響

1.3.4.1 同基質(zhì)間黏附的影響

95D細胞以1.5×104個/mL的濃度接種于24 孔板，每孔1 mL，貼壁24 h。吸棄培養(yǎng)基，加入含不同濃度Echinoside A（0.00、0.20、0.40 μmol/L）的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h和24 h后收集細胞。以無血清培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為2×105個/mL，加入經(jīng)50 μg/mL Matrigel包被的96 孔板中，每孔100 μL，每組4 個復(fù)孔。置于培養(yǎng)箱孵育90 min后，用PBS緩沖液洗去未黏著的細胞。采用MTT法測定光密度值OD570nm，按公式（2）計算腫瘤細胞與基質(zhì)間黏附率。

1.3.4.2 同HUVEC細胞間黏附的影響

HUVEC細胞以2×105個/mL接種于96 孔板中，每孔100 μL，貼壁24 h。吸棄培養(yǎng)基，PBS洗滌2 次后加入2×105個/mL的95D細胞，每孔100 μL。95D細胞預(yù)先經(jīng)不同濃度Echinoside A（0.00、0.20、0.40 μmol/L）預(yù)處理12、24 h。置于培養(yǎng)箱孵育90 min后，用磷酸鹽緩沖液洗去未黏著的細胞。采用MTT法測定OD570nm值，按公式（2）計算黏附率。

1.3.5 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）法檢測Echinoside A對95D細胞轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達的影響

95D細胞轉(zhuǎn)移相關(guān)基因：編碼MMP-2、MMP-9、金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMP）-1、TIMP-2、尿激酶型纖溶酶原激活劑（urokinase plasminogen activato，uPA）和VEGF的基因的表達采用RT-PCR法檢測。95D細胞以每孔5×105個/孔接種于6 孔板中，每孔2 mL，貼壁24 h。吸棄培養(yǎng)基，加入含不同濃度Echinoside A（0.00、0.20、0.40 μmol/L）的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集細胞，加入Trizol提取總RNA，進行PCR反應(yīng)，檢測各組細胞轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達。引物序列、退火溫度、循環(huán)數(shù)和產(chǎn)物大小見表1。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸45 s；最后72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物電泳后，凝膠成像系統(tǒng)拍照，以目的基因與β-actin擴增條帶的灰度比值代表基因相對表達水平。

表1 引物序列、退火溫度、循環(huán)數(shù)和產(chǎn)物長度Table 1 Primer sequences, annealing temperatures, cycles and length of products

1.3.6 雞胚尿囊膜（chicken chorioallantoic membrane，CAM）法檢測Echinoside A對血管生成的影響

參照文獻[12]方法，挑選新鮮種蛋，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵化。于第9天在無菌條件下暴露出CAM。取直徑1 cm的圓濾紙片置于CAM上，然后加入20 μL不同濃度的Echinoside A（0.00、11.32、22.64 μmol/L）。繼續(xù)孵育24 h后，以2.5%戊二醛固定尿囊膜，剪下加樣區(qū)尿囊膜，于解剖鏡下觀察并拍照。

1.3.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測Echinoside A對95D細胞VEGF蛋白表達的影響

細胞處理方法同1.3.5節(jié)，收集細胞，參照文獻[10]制備蛋白、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，用脫脂奶粉封閉。分別加入兔抗人GAPDH多克隆抗體（體積比1∶1 000稀釋）和VEGF（1∶200稀釋），于4 ℃孵育過夜。以TBST洗滌3 次后加入山羊抗兔二抗（體積比1∶2 000稀釋），室溫孵育1 h。采用化學(xué)發(fā)光試劑顯影曝光后采集圖像，測定條帶的灰度值，以VEGF與GADPH灰度比值代表VEGF蛋白的相對表達量。實驗重復(fù)3 次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，同時進行最小顯著性差異分析和Student-Newman-Keuls組間比較，以P＜0.05為差異顯著。實驗結(jié)果用±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 Echinoside A對95D細胞增殖活性的影響

圖2 Echinoside A對95D細胞增殖活性的影響Fig. 2 Effect of Echinoside A on the proliferation activity of 95D cells

由圖2可知，Echinoside A作用于95D細胞以后，顯著抑制了細胞的增殖，且呈現(xiàn)顯著的時間-效應(yīng)和劑量-效應(yīng)關(guān)系。其中在12 h和24 h，Echinoside A對95D細胞的IC50值分別為1.29 μmol/L和1.05 μmol/L。尹一恒[13]研究了棕環(huán)海參（Holothuria fuscocinerea Jaeger）皂苷fuscocineroside A對人源性膠質(zhì)母細胞瘤細胞U251增殖活性的影響。結(jié)果顯示，fuscocineroside A作用U251細胞48 h的IC50值為7.80 μmol/L。張佳佳等[14]研究了黃疣海參皂苷的體外抗腫瘤活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hillaside A和hillaside B兩種皂苷單體對受試的10 株腫瘤細胞均顯示很強的細胞毒活性，IC50值為0.15～3.20 mg/L。由此可見，Echinoside A對腫瘤細胞的IC50值均遠小于其他海參皂苷，其抑制腫瘤增殖的活性效果顯著。

2.2 Echinoside A對95D細胞侵襲能力的影響

圖3 Echinoside A對95D細胞侵襲率的影響Fig. 3 Effect of Echinoside A on the invasion rate of 95D cells

圖4 Echinoside A對95D細胞侵襲率的量化圖Fig. 4 Quantitative analysis of the invasion rate of Echinoside A on 95D cells

Matrigel可在Transwell小室膜上重組，形成與天然ECM類似的結(jié)構(gòu)[15]。腫瘤細胞對ECM的降解為其突破BM并進一步遷移和浸潤基質(zhì)的創(chuàng)造了必要條件。本實驗以細胞穿過重組ECM的數(shù)目表示其惡性侵襲能力，結(jié)果見圖3。經(jīng)20%胎牛血清誘導(dǎo)，95D細胞可顯著降解Matrigel，大量細胞穿過重組基底膜，24 h后Transwell小室底部幾乎被細胞鋪滿。經(jīng)Echinoside A處理后，穿越重組基底膜到達Transwell小室底部的細胞數(shù)目顯著減少，經(jīng)量化分析后（圖4），低、高劑量組95D細胞侵襲率分別下降了53.5%和65.8%（P＜0.01），表明Echinoside A可顯著降低95D細胞的侵襲能力。

2.3 Echinoside A對95D細胞遷移能力的影響

圖5 Echinoside A對95D細胞遷移率的影響Fig. 5 Effect of Echinoside A on the migration rate of 95D cells

圖6 Echinoside A對95D細胞遷移率的量化圖Fig. 6 Quantitative analysis of the migration rate of Echinoside A on 95D cells

遷移運動是惡性腫瘤最基本的生物學(xué)特征，且與腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能呈正相關(guān)。由圖5可知，經(jīng)Echinoside A作用后，95D細胞的穿過Transwell小室膜的細胞數(shù)目顯著減少，即樣品組95D細胞遷移能力顯著降低。同對照組相比，Echinoside A低、高劑量組遷移率分別降低了30.3%和49.3%（P＜0.01），呈現(xiàn)顯著的劑量依賴效應(yīng)（圖6），表明Echinoside A可顯著降低腫瘤細胞的遷移能力。

2.4 Echinoside A對95D細胞黏附能力的影響

圖7 Echinoside A對95D細胞同Matrigel（a）和HUVEC（b）黏附率的影響Fig. 7 Effect of Echinoside A on the adhesion rate of 95D cells

腫瘤細胞的黏附作用既包括與基質(zhì)間黏附，也包括與血管內(nèi)皮細胞之間的黏附，在腫瘤細胞從原發(fā)灶脫落，與血管和淋巴管基底膜黏附，侵襲到遠處器官中都起著極為重要的作用。首先檢測了Echinoside A對95D細胞同基質(zhì)的黏附能力。由圖7a可知，經(jīng)Echinoside A處理后，各劑量組細胞同基質(zhì)的黏附率均顯著降低，且呈現(xiàn)明顯的時間-效應(yīng)和劑量-效應(yīng)關(guān)系。其中，作用24 h后，Echinoside A低、高劑量組95D細胞同基質(zhì)的黏附率分別下降了36.23%和44.26%（P＜0.01）。同時檢測Echinoside A對95D細胞和血管內(nèi)皮細胞間的黏附能力發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，Echinoside A也顯著抑制了95D細胞同HUVEC細胞間的黏附率，且呈現(xiàn)顯著的時間-效應(yīng)和劑量-效應(yīng)關(guān)系（圖7b）。其中，作用24 h后，Echinoside A低、高劑量組95D細胞同HUVEC的黏附率分別下降了15.18%和23.58%（P＜0.01）。綜上可見，Echinoside A可同時抑制高轉(zhuǎn)移腫瘤細胞同基質(zhì)和血管內(nèi)皮細胞的黏附。

2.5 Echinoside A對95D細胞轉(zhuǎn)移相關(guān)基因mRNA表達的影響

圖8 Echinoside A對95D細胞轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達的影響Fig. 8 Effect of Echinoside A on the mRNA expression of metastasis-related genes in 95D cells

uPA屬于絲氨酸蛋白酶類，是人體纖溶系統(tǒng)的重要組成成員。uPA可激活纖溶酶原生成纖溶酶，促進細胞外基質(zhì)的降解，在癌細胞的遷移和浸潤性生長過程中起著關(guān)鍵性的作用[16-17]。大量研究表明，uPA廣泛存在于多種腫瘤組織中，且其表達水平均高于正常組織[18-19]。研究發(fā)現(xiàn)高轉(zhuǎn)移肺癌細胞株95D中uPA呈高表達，且其uPA表達水平與侵襲轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)[20]。由圖8a可知，同正常對照組相比，Echinoside A可顯著下調(diào)95D細胞uPA mRNA的表達，其中高劑量組表達量下降了47.1%（P＜0.01）。

經(jīng)uPA激活的纖溶酶除了直接降解ECM蛋白，還可以激活MMPs的前體，活化后MMPs可進一步水解ECM，從而幫助腫瘤細胞向周圍組織浸潤[21]。MMPs是一組鋅依賴性蛋白水解酶，可特異性降解ECM形成的物理屏障，重塑細胞間黏附力，參與腫瘤的免疫等過程，與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[22]。TIMPs是MMPs的特異性抑制劑，能特異性與MMPs 1∶1結(jié)合，封閉其催化活性。因此MMPs與TIMPs間的比例關(guān)系決定了MMPs在腫瘤轉(zhuǎn)移中所起的作用。其中，TIMP-2可特異性抑制MMP-2的活性，而TIMP-1則對MMP-9有較高的選擇抑制作用[23]。Zhao Qin等[11]研究發(fā)現(xiàn)海參皂苷Ds-echinoside A可顯著下調(diào)MMP-9的表達，同時提高TIMP-1的表達。與其報道類似，Echinoside A可顯著降低MMP-2和MMP-9的mRNA的表達（圖8b、c），同時顯著上調(diào)TIMP-2和TIMP-1的mRNA的表達（圖8d、e）。其中，與對照組細胞相比，Echinoside A高劑量組細胞MMP-2/TIMP-2和MMP-9/TIMP-1比值分別下降到29.7%（P＜0.05）和28.1%（P＜0.01）。

綜上可知，Echinoside A可通過抑制uPA活性，一方面抑制腫瘤細胞對ECM的降解，另一方面在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)MMP-2和MMP-9的mRNA的表達，上調(diào)TIMP-1和TIMP-2的mRNA的表達，進而抑制腫瘤細胞的浸潤與轉(zhuǎn)移。

2.6 Echinoside A對雞胚絨毛尿囊膜血管生長的影響

圖9 Echinoside A對CAM血管生長情況的影響（×10）Fig. 9 Effect of Echinoside A on the angiogenesis of CAM (×10)

雞胚絨毛尿囊膜實驗因其操作簡便、易于觀察等優(yōu)點，已成為研究血管生成的理想體內(nèi)模型。其中，在雞胚發(fā)育的5～10 d內(nèi)，尿囊膜新生毛細血管不斷出現(xiàn)，此階段是用來觀察血管形成的最佳時期。由圖9a可知，雞胚發(fā)育的第10天，正常對照組的CAM上的血管豐富，長勢旺盛，血管網(wǎng)絡(luò)分支多且清晰可見。經(jīng)Echinoside A處理后，毛細血管的數(shù)目較正常對照組顯著減少，顏色變淺，結(jié)構(gòu)模糊，且呈現(xiàn)顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系（圖9b、c），表明Echinoside A具有抑制血管新生的活性。

2.7 Echinoside A對95D細胞VEGF表達的影響

VEGF是公認的調(diào)節(jié)血管生成的最重要的細胞因子，它可以介導(dǎo)內(nèi)皮細胞芽生和遷移；還可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞分泌蛋白酶類降解ECM，促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移；誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞分化及促進血管網(wǎng)絡(luò)形成等[24]。分別采用RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測了Echinoside A對VEGF mRNA和蛋白表達的影響。由圖10a可知，不同劑量的Echinoside A均能顯著下調(diào)95D細胞VEGF mRNA的表達。與正常組細胞相比，低、高劑量組95D細胞VEGF mRNA的相對表達量平均下降了45.6%（P＜0.01）。同時，Echinoside A也可在蛋白水平顯著下調(diào)VEGF的表達，其中、高劑量組細胞VEGF的蛋白相對表達量比正常對照組降低了35.8%（P＜0.01），見圖10b。有研究發(fā)現(xiàn)，uPA與其受體結(jié)合后可激活纖溶酶，而纖溶酶可釋放或激活大量儲存于ECM的MMPs前體和VEGF，進而加速ECM和BM降解，促進血管內(nèi)皮細胞增殖及腫瘤新生血管形成[25]。另外，Bueno等[21]發(fā)現(xiàn)uPA還可直接激活MMPs和VEGF，從而引發(fā)纖溶機制的瀑布式級聯(lián)反應(yīng)、促進血管新生，從而直接參與腫瘤的轉(zhuǎn)移過程。以上結(jié)果提示，Echinoside A通過抑制uPA表達，進而在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平下調(diào)VEGF的表達，抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移和血管新生。

圖10 Echinoside A對95D細胞VEGF 基因（a）和VEGF蛋白（b）表達的影響Fig. 10 Effect of Echinoside A on VEGF gene and VEGF protein expression in 95D cells

3 結(jié) 論

本研究表明，Echinoside A可以顯著抑制高轉(zhuǎn)移95D細胞的增殖，且呈現(xiàn)顯著的時間-效應(yīng)和劑量-效應(yīng)關(guān)系。Echinoside A對95D細胞的IC50值在12 h和24 h分別為0.64 μmol/L和0.38 μmol/L，同其他研究對比發(fā)現(xiàn)，其IC50值遠小于棕環(huán)海參和黃疣海參皂苷，抑制腫瘤增殖的活性效果顯著。

本研究采用Transwell小室法、黏附實驗系統(tǒng)研究了Echinoside A對95D細胞侵襲、遷移、黏附的影響，結(jié)果顯示Echinoside A可顯著降低95D細胞侵襲、遷移以及同基質(zhì)和內(nèi)皮細胞的黏附能力。通過CAM實驗研究了Echinoside A對血管新生的影響，結(jié)果顯示經(jīng)Echinoside A處理后，毛細血管的密度顯著降低，VEGF基因和VEGF蛋白的表達均顯著降低。與本實驗報道類似，Ds-Echinoside A也可通過下調(diào)VEGF的表達從而抑制腫瘤血管新生[11]，提示海參皂苷抗血管新生的作用機制與其在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平下調(diào)腫瘤細胞VEGF的表達相關(guān)。

腫瘤細胞離開原發(fā)部位發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移，首先要誘導(dǎo)產(chǎn)生蛋白溶解酶降解ECM和BM，同時產(chǎn)生多種生長因子促進腫瘤微血管的生成。uPA是尿激型纖溶系統(tǒng)的重要成員，在95D細胞中高表達，并且參與細胞黏附、移動，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用?；罨膗PA與腫瘤表面的受體結(jié)合后，一方面可以直接激活纖溶酶，降解ECM和BM，同時促進儲存于ECM中的MMPs前體和VEGF釋放，加速ECM和BM的降解，促進腫瘤血管新生。另一方面uPA也可直接激活MMPs和VEGF，參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移的過程[26]。實驗結(jié)果顯示，Echinoside A可在轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)uPA的表達，還可同時下調(diào)MMP-2、MMP-9和上調(diào)TIMP-1、TIMP-2的mRNA的表達。進一步采用RT-PCR和western-blotting法研究發(fā)現(xiàn)Echinoside A可顯著下調(diào)VEGF的基因和蛋白的表達。以上結(jié)果提示Echinoside A抑制95D細胞轉(zhuǎn)移的機制可能是通過抑制uPA信號通路，進而減少MMPs和VEGF激活和表達，最終抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和血管新生。

綜上所述，Echinoside A具有顯著的抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移和血管新生的活性，這為海參皂苷的藥理活性研究提供了科學(xué)依據(jù)，也為低值海參的開發(fā)利用提供了新的思路。

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The Triterpene Glycoside Echinoside A Inhibits 95D Cell Metastasis via uPA Signaling Pathway

ZHAO Qin1, LIN Dong2, LIU Haimei1
(1. College of Food Engineering, Ludong University, Yantai 264025, China; 2. School of Pharmacy, Binzhou Medical University, Yantai 264003, China)

The effect and mechanism of Echinoside A, a triterpene glycoside derived from sea cucumber, on tumor metastasis in lung cancer 95D cell lines were evaluated. The 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide (MTT) assay was used to determine the anti-proliferation ability of Echinoside A on 95D cells which have high metastasis ability. Transwell assay and cell adhesion assay were used to determine the effect of Echinoside A on tumor metastasis capacity. Chicken chorioallantoic membrane (CAM) assay was used to determine its effect on tumor angiogenesis. Reverse transcription-polymerase chain reaction and western blotting analysis were used to determine the effect of Echinoside A on tumor metastasis-related gene and protein expression. The results show that Echinoside A could inhibit 95D cell proliferation (P ＜ 0.01), invasion (P ＜ 0.01), migration (P ＜ 0.01) and adhesion (P ＜ 0.01), and decrease angiogenesis in CAM. Echinoside A could also reduce the mRNA expression of urokinase plasminogen activator (uPA) and matrix metalloproteinases (MMP)-2/-9 and significantly promote the mRNA expression of matrix metalloproteinases (TIMP)-1/-2. It could also reduce the gene and protein expression of vascular endothelial growth factor. From these data, it is suggested that Echinoside A can prevent metastasis and angiogenesis through specific inhibition of uPA signaling pathway.

triterpene glycoside from sea cucumber; 95D cell; tumor; metastasis; angiogenesis; signaling pathway

10.7506/spkx1002-6630-201621041

R284；R965

A

1002-6630（2016）21-0241-07

趙芹, 林棟, 劉海梅. 海參皂苷Echinoside A通過uPA信號通路抑制高轉(zhuǎn)移95D細胞轉(zhuǎn)移[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(21): 241-247. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621041. http://www.spkx.net.cn

ZHAO Qin, LIN Dong, LIU Haimei. The triterpene glycoside Echinoside A inhibits 95D cell metastasis via uPA signaling pathway[J]. Food Science, 2016, 37(21): 241-247. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621041. http://www.spkx.net.cn

2016-06-23

山東省自然科學(xué)基金項目（ZR2015PC002；ZR2014BP016）；魯東大學(xué)人才引進基金項目（LY2012011）

趙芹（1983—），女，講師，博士，研究方向為海洋生物活性成分。E-mail：candyffff@163.com