李 謠，陳金龍，王麗穎，張月巧，吳素蕊，明 建,3,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650223；3.西南大學 國家食品科學與工程實驗教學中心，重慶 400715）

羊肚菌多糖抑制人乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖和誘導細胞凋亡研究

李 謠1，陳金龍1，王麗穎1，張月巧1，吳素蕊2，明 建1,3,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650223；3.西南大學 國家食品科學與工程實驗教學中心，重慶 400715）

以黑脈羊肚菌多糖為原料，研究羊肚菌多糖對人乳腺癌細胞MDA-MB-231（以下簡稱MDA）增殖和凋亡的影響。結果表明：在無細胞毒性范圍內(nèi)，羊肚菌多糖能顯著抑制人乳腺癌細胞MDA的增殖，半數(shù)有效濃度（median effective concentration，EC50）值為0.096 mg/mL，同時人乳腺癌細胞MDA表現(xiàn)出多種細胞凋亡的形態(tài)學變化。免疫印跡檢測實驗結果顯示，羊肚菌多糖能抑制B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）蛋白表達，促進Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）表達，同時增加Bax/Bcl-2蛋白表達比值，并呈現(xiàn)出劑量依賴效應。說明羊肚菌多糖能抑制人乳腺癌細胞MDA增殖，促進細胞凋亡。

羊肚菌；多糖；人乳腺癌細胞MDA-MB-231；細胞增殖；細胞凋亡

羊肚菌（Morchella esculenta (L.) Pers.，MEP）是一種藥食兩用的真菌，因其菌蓋表面凹凸不平、狀如羊肚而得名，常見的羊肚菌有尖頂羊肚菌、黑脈羊肚菌、褐赭色羊肚菌、粗腿羊肚菌、寬圓羊肚菌。羊肚菌不僅味道鮮美，而且營養(yǎng)豐富，含有多種生物活性物質，如多糖、蛋白質、礦物質、膳食纖維、維生素等，具有調節(jié)機體免疫力、抗菌、抗疲勞、保肝、抗腫瘤等多種功效[1-4]。羊肚菌多糖是羊肚菌的主要活性物質，F(xiàn)u Lihong等[5]研究發(fā)現(xiàn)羊肚菌胞外多糖具有較強的清除羥自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基的活性，還能顯著抑制D-氨基半乳糖小鼠模型肝臟和血清中丙二醛的形成，提高抗氧化酶的活性。馬利等[6]研究發(fā)現(xiàn)尖頂羊肚菌胞外多糖提取物具有促進皮膚成纖維細胞細胞增殖、膠原蛋白合成，具有延緩細胞衰老的作用。明建等[7]研究發(fā)現(xiàn)羊肚菌多糖對于大鼠腸道內(nèi)乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、戊酸、己酸的產(chǎn)生代謝有較大影響。Hu Meili等[8]研究發(fā)現(xiàn)羊肚菌發(fā)酵液多糖能誘導HepG2細胞凋亡。

本課題組前期研究制備得到黑脈羊肚菌多糖（polysaccharides from Morchella angusticeps Peck，PMEP）并進行了結構鑒定，PMEP是一種由阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，以α-1,4-葡萄糖、α-1,2-甘露糖、α-1,6-半乳糖和α-1,5-阿拉伯糖殘基連接，并有α-1,2,6-甘露糖、α-1,4,6-葡萄糖和β-1,2,6半乳糖的高度分支結構的一種雜多糖[9]。本研究以人乳腺癌細胞MDA-MB-231（以下簡稱為MDA）為模型，研究了PMEP對MDA細胞增殖和凋亡的影響，旨在為PMEP功能食品或藥品的開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PMEP由西南大學食品科學學院食品營養(yǎng)實驗室制備[9]。

青霉素、鏈霉素、慶大霉素、蛋白酶抑制劑、非離子型表面活性劑（Igepal） 美國Sigma公司；Hank平衡鹽溶液（Hank balanced salt solution，HBSS）、William’s Medium E（WME）培養(yǎng)基、表皮生長因子、肝素、胰島素、氫化可的松 美國Gibco生物科技公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 美國Atlanta生物科技公司；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒 美國Serologicals公司；蛋白含量檢測試劑盒、二抗（鼠抗單克隆抗體） 美國Sigma-Aldrich公司；一抗（抗B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體、抗Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體） 美國Santa Cruz公司；魯米諾化學發(fā)光試劑盒、脫脂奶粉美國Cell Signaling Technology公司；乳腺癌細胞MDAMB-231 美國模式培養(yǎng)物集存庫；二甲苯（分析純，下同）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）美國Fisher公司。

1.2 儀器與設備

5180 R型冷凍離心機 德國Eppendorf公司；DM IRB型倒置顯微鏡 德國Leica儀器有限公司；HERA cell 240型CO2培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；T75細胞培養(yǎng)瓶、96 孔黑色底部透明微孔板、96孔白色底部透明微孔板美國Corning公司；Falcon 8孔細胞培養(yǎng)板 美國BD公司；F5Multi模式酶標儀 美國Molecular Devices公司。

1.3 方法

1.3.1 MDA細胞培養(yǎng)[10-11]

MDA細胞在含10% FBS的生長培養(yǎng)基CM（WME、2 mmol/L谷氨酸鹽、10 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸（2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid，HEPES）、5 μg/mL胰島素、0.05 μg/mL氫化可的松、50 Units/mL青霉素、50 μg/mL鏈霉素、100 μg/mL慶大霉素）上，37 ℃、體積分數(shù)5% CO2條件下培養(yǎng)，用于實驗的細胞為第12～35代。

1.3.2 MDA細胞毒性測定[10-11]

取對數(shù)生長期的MDA細胞接于96 孔白板，使每孔細胞數(shù)約為4×104個，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后，移去殘余培養(yǎng)基，PBS清洗1 次。其中，樣品組孔中加入不同質量濃度（0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24、0.28、0.32、0.36、0.40 mg/mL）的100 μL含PMEP的培養(yǎng)基（每個質量濃度梯度做3 個平行孔），對照組孔中加入100 μL的培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后開始測板。移去96 孔板內(nèi)殘余培養(yǎng)基，用PBS清洗1 次，加50 μL/孔亞甲基藍溶液（98% HBSS、0.67%戊二醛、0.6%亞甲基藍）染色，于37 ℃條件下培養(yǎng)1 h，然后移去染色液，并用去離子水清洗該96 孔板至清洗液無色，吸去板中多余水分并風干2～3 min，加100 μL/孔洗脫液（49% PBS、50%乙醇、1%醋酸），然后漩渦振蕩20 min，使孔內(nèi)已染色的細胞形成均勻的細胞懸浮液。最后，于570 nm波長處讀取各孔中染色細胞懸浮液的吸光度。減少的吸光度按公式（1）計算，當減少的吸光度≥10%時，即認為樣品具有細胞毒性。

1.3.3 MDA細胞抗增殖活性的測定[10-11]

取對數(shù)生長期的MDA細胞接于96 孔板，使每孔細胞數(shù)約為2.5×104個，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)8 h后，移去殘余培養(yǎng)基，PBS清洗1 次。其中，樣品組孔中加入不同質量濃度（0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24、0.28、0.32、0.36、0.40 mg/mL）的100 μL含PMEP的培養(yǎng)基（每個質量濃度梯度做3 個平行孔），對照組孔中加入100 μL的培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)72 h后開始測板，測板操作同上述細胞毒性實驗。細胞增殖抑制率按公式（2）計算，同時細胞增殖抑制效果也用半數(shù)有效濃度（median effective concentration，EC50）表示，EC50表示50%最大效應時的濃度。

1.3.4 TUNEL細胞凋亡檢測[12]

將MDA細胞接于Falcon 8孔細胞培養(yǎng)載玻片上，使每孔細胞數(shù)約為3×105個，37 ℃條件下培養(yǎng)，待細胞長至60%～70%融合時，更換無血清培養(yǎng)，37 ℃條件下培養(yǎng)2 h，再用含PMEP的無血清培養(yǎng)基37 ℃條件下培養(yǎng)4 h，PBS漂洗后，用1%多聚甲醛-PBS溶液固定細胞20 min，再用預冷乙醇-乙酸混合液（2∶1，V/V）于-20 ℃條件下固定5 min，3% H2O2-PBS溶液室溫條件下滅活15 min，抑制內(nèi)源性過氧化物酶。然后加入脫氧核苷酸末端轉移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）工作液（對照組不加TdT酶）使細胞DNA片段與過氧化物酶標記的抗地高辛抗體結合，加入二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）工作液室溫條件下染色，再用甲基綠復染劑室溫下襯染，以進一步區(qū)分凋亡細胞與正常細胞，最后用二甲苯脫水，封片，干燥后，在倒置顯微鏡下觀察并記錄實驗結果。每個樣品隨機計數(shù)4 個視野，按式（4）計算細胞凋亡率。計算時，將顯微鏡視野中細胞總數(shù)控制在100 個左右。

1.3.5 免疫印跡檢測Bax、Bcl-2蛋白表達[13-14]

將MDA細胞接于6 孔培養(yǎng)板中，使每孔細胞數(shù)約為5×105個，加入不同質量濃度（0、0.08、0.16、0.32 mg/mL）PMEP溶液培養(yǎng)24 h，結束后除去生長培養(yǎng)基，用預冷PBS清洗2 次后將細胞從培養(yǎng)板中刮下。加入細胞裂解液（50 mmol/L pH 7.4三羥甲基氨基甲烷（Tris）、1% Igepal、150 mmol/L氯化鈉、1 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA））和蛋白酶抑制劑（1 g/mL抑肽酶、1 g/mL亮胎酶肽、1 g/mL胃蛋白酶抑制劑、1 mmol/L原釩酸鈉）4 ℃條件下孵育30 min，每5 min振蕩一次，使其充分裂解，促進蛋白質的提取。然后4 ℃、12 000×g離心5 min，每組細胞取等量蛋白裂解液經(jīng)過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離后轉移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，PVDF膜在5%脫脂奶粉-TBST封閉液中室溫封閉2 h后，與一抗（抗Bcl-2抗體、抗Bax抗體）4 ℃恒溫搖床振蕩孵育過夜，洗滌后加入二抗室溫條件下振蕩孵育2 h，采用Lumin GLO發(fā)光試劑盒熒光顯色。用ImageJ2x軟件對蛋白條帶進行掃描和定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Sigmaplot 12.5軟件進行統(tǒng)計分析，實驗結果用表示，采用方差分析（analysis of variance，ANOVA）進行Duncan’s多重比較分析。

2 結果與分析

2.1 PMEP對MDA細胞增殖和細胞毒性的影響

圖1 PMEP對MDA細胞增殖和細胞毒性的影響Fig. 1 Effect of PMEP on the proliferation and cytotoxicity of MDA-MB-231 human breast cancer cells

由圖1可知，當PMEP質量濃度＞0.382 mg/mL時顯示細胞毒性，此時對MDA細胞增殖的抑制率幾乎達到100%。且不同質量濃度的PMEP（0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24、0.28、0.32、0.36、0.40 mg/mL）對MDA細胞增殖有明顯的抑制作用，呈現(xiàn)出劑量依賴效應。與對照組相比，當PMEP質量濃度為0.04 mg/mL時，對MDA細胞增殖抑制率約為10%；當PMEP質量濃度為0.12 mg/mL時，對MDA細胞增殖抑制率約為70%，PMEP抑制MDA細胞增殖的EC50為0.096 mg/mL，其抗增殖活性高于許多食用菌提取物，如金針菇（EC50值為0.15 mg/mL）、雞腿菇（EC50值為0.45 mg/mL）、鬼傘菌（EC50值為0.12 mg/mL）[15]、靈芝（EC50值＞0.125 mg/mL）[16]、云芝（EC50值＞1.0 mg/mL）[17]、鼎湖鱗傘多糖菌絲多糖提取物（EC50值為0.116 mg/mL）[18]，低于黃枝瑚菌（EC50值為0.067 mg/mL）[19]。

圖2 PMEP對MDA細胞形態(tài)的影響Fig. 2 Effect of PMEP on the morphology of MDA-MB-231 human breast cancer cells

由圖2可知，對照組中MDA細胞生長良好，相鄰細胞連接緊密。隨著PMEP質量濃度的增加，MDA細胞數(shù)量明顯減少，細胞密度降低，培養(yǎng)基上層有明顯的死細胞漂浮，且呈現(xiàn)出劑量依賴效應，充分說明PMEP能顯著抑制MDA細胞生長，表現(xiàn)出良好的抗增殖活性。

2.2 PMEP誘導MDA細胞凋亡的影響

圖3 PMEP對MDA細胞凋亡的影響Fig. 3 Effect of PMEP on the apoptosis of MDA-MB-231 human breast cancer cells

由圖3A可知，對照組中，MDA細胞染色均一、細胞結構清晰且細胞排列緊密。經(jīng)過不同質量濃度PMEP處理后，MDA細胞形態(tài)變得不規(guī)則，且細胞輪廓模糊、細胞體萎縮、細胞間隙增大、染色質凝聚、細胞核破裂、細胞膜出現(xiàn)空泡，表現(xiàn)出多種細胞凋亡的形態(tài)學變化。由圖3B可知，在對照組中，凋亡細胞占MDA細胞總數(shù)2%，隨著PMEP質量濃度增加，凋亡細胞數(shù)量呈顯著上升趨勢，當多糖質量濃度為0.32 mg/mL時，細胞凋亡率達到18%，是MDA細胞對照組的9 倍。所以，PMEP能誘導乳腺癌細胞MDA發(fā)生凋亡。

2.3 PMEP對MDA細胞蛋白Bcl-2、Bax表達的影響

圖4 PMEP對MDA細胞的Bcl-2（A）和Bax（B）蛋白表達的影響Fig. 4 Effects of PMEP on the expression of Bcl-2 (A) and Bax (B) in MDA-MB-231 human breast cancer cells

細胞凋亡的發(fā)生受到細胞內(nèi)凋亡調節(jié)蛋白的調控，Bcl-2家族蛋白是一類典型的凋亡調節(jié)蛋白，其中包括抑制細胞凋亡蛋白Bcl-2和促進細胞凋亡蛋白Bax。由圖4A可知，當PMEP質量濃度高于0.08 mg/mL時，P M E P處理能顯著降低B c l-2蛋白表達（P＜0.05），當PMEP質量濃度為0.08、0.16、0.32 mg/mL時，Bcl-2蛋白表達分別下降7.75%、35.07%、60.38%。由圖4B可知，PMEP能顯著增加Bax蛋白表達（P＜0.05），當PMEP質量濃度為0.08、0.16、0.32 mg/mL時，Bax蛋白表達分別增加49.20%、79.86%、108.28%。由圖4C可知，PMEP處理后，Bax/Bcl-2蛋白表達比值顯著增加（P＜0.05），當PMEP質量濃度為0.08、0.16、0.32 mg/mL時，Bax/Bcl-2蛋白表達比值分別增加0.61、1.77、4.25 倍。所以，PMEP能抑制Bcl-2蛋白表達、促進Bax蛋白表達，同時增加Bax/Bcl-2蛋白表達比值，且呈現(xiàn)出明顯劑量依賴效應，對MDA細胞的凋亡有一定促進作用。Chow等[20]研究發(fā)現(xiàn)云芝糖肽能誘導MDA細胞凋亡，抑制細胞增殖，其作用機制可能與p21蛋白表達上調和細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）表達下調有關。Jiang Xue等[14]研究了2α-羥基熊果酸抑制MDA細胞增殖的作用機制，其對Bcl-2、Bax蛋白表達的影響與本研究一致，除此之外，還觀察到腫瘤壞死因子受體相關因子2、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、Cyclin D1蛋白表達下調，p-ASK1、p-p38、p-p53、p-21蛋白表達上調，并顯著上調Bax/Bcl-2比例和活化型半胱天冬酶-3（cleaved caspase-3）蛋白表達，結果表明，2α-羥基熊果酸通過調節(jié)p38/分裂原激活蛋白激（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號轉導通路抑制MDA細胞增殖，誘導細胞凋亡?，F(xiàn)有研究表明，Bax蛋白和Bcl-2蛋白除了通過形成同源或異源二聚體來調節(jié)細胞凋亡外，還能與其他蛋白作用參與細胞凋亡[21-23]。PMEP抑制MDA細胞增殖的作用機制尚不明確，后期應對p38/MAPK信號傳導通路上相關蛋白（如PCNA、Cyclin D1、CDK4、p-ASK1、p-p38、p-p53、p21、TRAF2等）進行研究。

3 結 論

本實驗以MDA細胞為模型，研究了PMEP的抗增殖活性和促細胞凋亡作用，初步探討了其作用機制。結果表明：1）PMEP對MDA細胞增殖有顯著的抑制作用，并呈現(xiàn)出劑量依賴效應，其EC50值為0.096 mg/mL，且經(jīng)過PMEP處理后，MDA細胞數(shù)量明顯減少，細胞密度降低，說明PMEP能顯著抑制MDA細胞的生長；2）經(jīng)過PMEP處理后，MDA細胞體萎縮、細胞間隙增大、染色質凝聚、細胞核破裂、細胞膜出現(xiàn)空泡，表現(xiàn)出多種細胞凋亡的形態(tài)學變化，同時隨著PMEP質量濃度增加，凋亡細胞數(shù)量呈顯著上升趨勢，說明PMEP能誘導MDA細胞發(fā)生凋亡；3）PMEP能抑制Bcl-2蛋白表達、促進Bax蛋白表達，同時增加Bax/Bcl-2蛋白表達比值，且呈現(xiàn)出明顯劑量依賴效應，說明PMEP對MDA細胞的凋亡有一定促進作用。

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Polysaccharides from Morchella angusticeps Peck Inhibit Cell Proliferation and Induce Apoptosis in MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells

LI Yao1, CHEN Jinlong1, WANG Liying1, ZHANG Yueqiao1, WU Surui2, MING Jian1,3,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Kunming Edible Fungi Institute, All China Federation of Supply and Marketing Cooporatives, Kunming 650223, China; 3. National Food Science and Engineering Experimental Teaching Center, Southwest University, Chongqing 400715, China)

The effects of polysaccharides from Morchella angusticeps Peck (PMEP) on the proliferation and apoptosis of MDA-MB-231 human breast cancer cells were investigated in this study. The results showed that PMEP could significantly inhibit the proliferation of MDA-MB-231 in the non-cytotoxic concentration range with a median effective concentration (EC50) of 0.096 mg/mL. MDA-MB-231 cells also showed a series of morphological changes associated with apoptosis. Western blotting assay showed that PMEP could inhibit the expression of B-cell lymphoma-2 (Bcl-2) protein, increase the expression of Bcl-2 associated X protein (Bax) and Bax/Bcl-2 ratio in a dose-dependent manner. In conclusion, PMEP could inhibit the proliferation and induce the apoptosis of MDA-MB-231 cells.

Morchella esculenta; polysaccharide; MDA-MB-231 human breast cancer cell; cell proliferation; cell apoptosis

10.7506/spkx1002-6630-201621036

S567.3

A

1002-6630（2016）21-0214-05

李謠, 陳金龍, 王麗穎, 等. 羊肚菌多糖抑制人乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖和誘導細胞凋亡研究[J]. 食品科學, 2016, 37(21): 214-218. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621036. http://www.spkx.net.cn

LI Yao, CHEN Jinlong, WANG Liying, et al. Polysaccharides from Morchella angusticeps Peck inhibit cell proliferation and induce apoptosis in MDA-MB-231 human breast cancer cells[J]. Food Science, 2016, 37(21): 214-218. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621036. http://www.spkx.net.cn

2016-05-11

國家自然科學基金面上項目（31271825）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2013BAD16B01）

李謠（1992—），女，碩士研究生，研究方向為食品化學與營養(yǎng)學。E-mail：liyao427@163.com

*通信作者：明建（1972—），男，教授，博士，研究方向為食品化學與營養(yǎng)學。E-mail：mingjian1972@163.com