劉夢潔，陳守文，魏雪團,2,*

（1.華中農業(yè)大學 農業(yè)微生物學國家重點實驗室，湖北 武漢 430070；2.華中農業(yè)大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070）

納豆激酶高產菌的快速篩選及其發(fā)酵納豆特性

劉夢潔1，陳守文1，魏雪團1,2,*

（1.華中農業(yè)大學 農業(yè)微生物學國家重點實驗室，湖北 武漢 430070；2.華中農業(yè)大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070）

通過纖溶活性篩選法和納豆激酶基因篩選法，快速、準確篩選到一株納豆激酶高產菌株MJ-1，經16S rRNA基因序列分析，該菌株被鑒定為枯草芽孢桿菌。以黃豆為原料進行固體發(fā)酵制備納豆食品，考察了納豆食品的納豆激酶活力、抗凝活性和抗氧化活性。在初始含水量60%、發(fā)酵溫度37℃的條件下，納豆激酶發(fā)酵活力在20 h達到最大值（90.18 FU/g，以干質量計），達到了商業(yè)化納豆的酶活力水平?？鼓钚苑治鲲@示該菌株可合成抗凝成分，賦予納豆食品抗凝活性，在提取物質量濃度為3 mg/mL時，抗凝效率達91%。同時，與未發(fā)酵黃豆相比，發(fā)酵過程顯著提高了其抗氧化活性。

納豆激酶；枯草芽孢桿菌；基因篩選法；抗凝活性；抗氧化活性

納豆食品是大豆經枯草芽孢桿菌納豆亞種（Bacillus subtilis natto）發(fā)酵而成的傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品，是我國豆豉流傳到日本，經改造而成的純種發(fā)酵產品[1-2]。納豆富含蛋白質、多肽、氨基酸、維生素和大豆異黃酮等各類成分，賦予其良好的營養(yǎng)性和功能性[3-5]。其中，納豆激酶可高效溶解血栓，作為納豆標志性成分備受關注，基于納豆激酶的保健品和食品已成為我國近年來的研究熱點[6-7]。

相比納豆類保健品，納豆食品價格低廉，具有更廣泛的潛在消費者。然而，目前商業(yè)化的納豆食品中納豆激酶活力一般為20～40 FU/g[8]，納豆激酶活力普遍較低，且臭味嚴重[9]，制約納豆食品在我國的進一步推廣。2015年，Lee等[10]對比分析了4 株枯草芽孢桿菌的納豆發(fā)酵效果，其中，納豆激酶產量最高的菌株為B. subtilis 14715，其納豆激酶產量達48 FU/g。納豆激酶產生菌決定納豆品質，快速準確篩選納豆激酶高產菌株至關重要。

目前常采用的篩選方法為：先通過纖溶活性篩選法獲得纖溶酶產生菌，再通過16S rRNA技術鑒定枯草芽孢桿菌[11-12]。然而，解淀粉芽孢桿菌可產生纖溶酶[13-16]，同時其16S rRNA基因序列同枯草芽孢桿菌相似性達97%以上，采用目前的方法常誤篩到解淀粉芽孢桿菌。對比分析纖溶酶基因序列，納豆激酶基因序列具有高度的特異性[13,17-18]，同解淀粉芽孢桿菌纖溶酶基因序列相似性僅為80%左右。因此，將纖溶活性篩選法和納豆激酶基因鑒定相結合，可快速、準確篩選到納豆激酶產生菌，本研究擬將活性篩選法同納豆激酶基因鑒定法相結合，以期快速篩選到納豆激酶高產菌株。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

菌株篩選材料：豆豉、豆醬，購于武漢各大農貿市場及超市。

DNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker 寶生物工程（大連）有限公司；凝血酶、纖維蛋白原 美國S i g m a-A l d r i c h公司；1,1-二苯基-2-苦基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 上海源葉生物科技有限公司；蛋白胨、酵母抽提物 英國Oxoid公司；其他試劑 國藥集團化學試劑有限公司。

液體及固體LB培養(yǎng)基；奶粉固體培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10、酵母浸粉5、氯化鈉10、脫脂奶粉10、瓊脂粉15。

1.2 儀器與設備

CR21G高速冷凍離心機 日本日立公司；電熱恒溫隔水式培養(yǎng)箱 黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司；HQL300B柜式恒溫冷凍搖床 武漢中科科儀技術發(fā)展有限責任公司；722型可見分光光度計 上海奧譜勒儀器有限公司；SW-CJ-2F潔凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；電熱恒溫水浴鍋 上海醫(yī)用恒溫設備廠；高壓蒸汽滅菌鍋 山東新華醫(yī)療器械股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 納豆芽孢桿菌篩選

取各類發(fā)酵豆制品1 g于9 mL無菌水中，37 ℃，180 r/min處理5 min，取上清液涂布到奶粉固體培養(yǎng)基平皿，37 ℃培養(yǎng)24 h，將水解圈較大的單菌落轉移至液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min培養(yǎng)12 h作為種子液。取1 mL種子液移接至25 g蒸煮黃豆中，37 ℃固體發(fā)酵48 h，每隔12 h攪拌一次，通過纖維蛋白溶解法檢測發(fā)酵產物的纖溶酶活力。選取酶活力較高的菌株進行納豆激酶基因檢測：通過細菌基因組抽提試劑盒抽提待測菌株的總DNA，以aprNF（5’-CCGTGAGAAGCAAAAA ATTGTGGATCA-3’）和aprNR（5’-ATTTATTGTGCAG CTGCTTGTACGTTG-3’）為引物，經預變性（94 ℃，5 min）、變性（94 ℃，30 s）、退火（52 ℃，30 s）、延伸（72 ℃，1 min），30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）產物最終保藏于4 ℃。PCR產物測序由北京擎科新業(yè)生物技術有限公司完成，通過BLAST程序進行序列相似性分析。

1.3.2 菌種鑒定

通過1 6 S r R N A基因序列分析法進一步進行菌種鑒定[19]。16S rRNA基因擴增引物為：27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）。PCR程序為：預變性（94 ℃，5 min）；變性（94 ℃，30 s）；退火（52 ℃，30 s）；延伸（72 ℃，1 min），28個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保藏。PCR產物測序由北京擎科新業(yè)生物技術有限公司完成，序列相似性分析通過BLAST程序完成的，系統(tǒng)進化樹通過MEGA 5.0軟件進行構建。

1.3.3 納豆食品發(fā)酵

將甘油管保藏的菌株MJ-1的菌液劃線于固體LB培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h；挑取單菌落接種至液體LB培養(yǎng)基，37 ℃，180 r/min培養(yǎng)12 h即為發(fā)酵種子液。取1 mL種子液移接至25 g蒸煮并滅菌后的黃豆中，37 ℃固體發(fā)酵48 h，每隔12 h攪拌一次。

1.3.4 生物量分析

在固體發(fā)酵期間，每隔4 h取發(fā)酵樣品，稀釋涂布固體LB培養(yǎng)基平板，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h，統(tǒng)計單菌落個數，計算生物量。

1.3.5 納豆激酶活力分析

以1∶5（m/V）的比例向發(fā)酵黃豆中添加蒸餾水，200 r/min處理1 h抽提納豆激酶，10 000 r/min離心20 min，上清液作為待測樣品用于納豆激酶活力分析：依次向試管中加入1.4 mL Tris-HCl（50 mmol/L，pH 7.8）緩沖液、0.4 mL 7.2 mg/mL纖維蛋白原溶液，37 ℃溫浴5 min，再加入0.1 mL凝血酶溶液（20 U/mL），37 ℃溫浴10 min形成人工血栓，加入0.1 mL的待測樣品，37 ℃溫浴60 min，然后加入2 mL 0.2 mol/L三氯乙酸溶液靜止20 min終止反應，10 000 r/min 離心10 min，取上清液于275 nm波長處測定吸光度，每分鐘275 nm處吸光度增加0.01所需要的酶量定義為1個單位的纖維蛋白降解酶活力（FU）[20]。

1.3.6 抗凝活性分析

將發(fā)酵黃豆充分破碎，以1∶10（m/V）的比例加入蒸餾水，180 r/min振蕩提取12 h，提取液經12 000 r/min離心10 min，上清液經冷凍干燥得固體粉末，通過0.05 mol/L Tris-HCl（pH 7.2）緩沖液溶解，用于抗凝活性分析：將1.0 mL待測樣品和1.5 mL 0.1%纖維蛋白原溶液加入比色皿中混合均勻，加入0.1 mL 20 U/mL凝血酶溶液，37 ℃溫浴20 min，檢測405 nm波長處的吸光度為樣品吸光度，以1 mL 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液作為對照?？鼓钚裕鼓剩┌凑展剑?）[13]計算。

1.3.7 抗氧化活性測定

發(fā)酵黃豆和未發(fā)酵黃豆的抗氧化能力通過DPPH自由基清除活性來檢測[13]。將待測樣品充分破碎，以1∶10（m/V）的比例加入80%甲醇溶液，180 r/min振蕩提取12 h，提取液經12 000 r/min離心10 min，上清液經冷凍干燥得到水提物粉末，將粉末配制成不同質量濃度的待測樣品（0.5、1.5、2.5、3.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、45.0 mg/mL）。將0.5 mL待測樣品加入到2.5 mL 75 μmol/L DPPH-甲醇溶液中，室溫反應90 min，于波長517 nm處檢測吸光度，以等體積的甲醇作為對照?？寡趸钚裕―PPH自由基清除率）通過公式（2）[21]評價。

2 結果與分析

2.1 納豆激酶產生菌篩選

表1 MJ-1合成的纖溶酶基因序列同已報道纖溶酶基因序列相似性分析Table 1 Gene sequence similarity analysis of fibrinolytic enzyme from strain MJ-1 with the reported genes

經奶粉平板初篩，獲得24 株透明圈較大的菌株，進一步進行固體發(fā)酵，選取纖溶酶活力較高的7 株菌進行納豆激酶基因篩選鑒定。其中菌株MJ-1擴增出目的條帶，測序結果顯示該條帶長度為1 070 bp，同已報道的典型纖溶酶基因序列相似性，如表1所示，同典型的納豆激酶基因相似性達到99%[17]，同典型的解淀粉芽孢桿菌纖溶酶DFE、DJ-4相似性僅為80%[14-15]，說明該菌株合成的纖溶酶屬于納豆激酶。通過纖溶活性篩選和納豆激酶基因篩選鑒定，快速準確篩選到了納豆激酶生產菌株。

2.2 菌株鑒定

枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌的纖溶酶基因具有高度的差異性，通過纖溶酶基因分析基本可以準確地區(qū)分這兩種菌。為了進一步驗證鑒定結果，本研究進行了16S rRNA基因序列分析。菌株MJ-1的部分16S rRNA基因序列同Bacillus subtilis HYM11的16S rRNA（GenBank注冊號KT961123.1）相似性達98%。同時，系統(tǒng)進化樹顯示菌株MJ-1同B. subtilis的親緣關系最近（圖1），進一步證明菌株MJ-1屬于枯草芽孢桿菌。

圖1 基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)進化樹Fig. 1 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences

2.3 納豆激酶發(fā)酵過程曲線

圖2 納豆發(fā)酵中菌體生長和納豆激酶合成的過程曲線Fig. 2 Time courses of cell growth and nattokinase biosynthesis during natto fermentation

在初始含水量60%、發(fā)酵溫度37℃條件下，繪制了菌體生長和納豆激酶合成過程曲線（圖2）。隨著菌體生長，納豆激酶逐漸合成。20 h時，納豆激酶發(fā)酵活力達到最大值，為90.18 FU/g（以干質量計），此時生物量達3.02×108CFU/g。此后，隨著生物量的增加，納豆激酶活力逐漸降低，這可能是由于納豆激酶降解所致，由此可見，納豆激酶的合成與菌體的生長并不是完全耦合。目前，常見的商業(yè)化納豆產品中納豆激酶活力一般在20～40 FU/g[8]，本研究所制備納豆產品中納豆激酶活力顯著高于商業(yè)化納豆的活性水平，且發(fā)酵周期較短，具有良好的工業(yè)化應用前景。

2.4 抗凝活性分析

纖溶活性和抗凝活性是評價血栓預防和治療的2 個重要指標。凝血酶在纖維蛋白原形成纖維蛋白（血栓）中起關鍵作用，是纖維蛋白形成的限速酶[23]，本研究通過考察發(fā)酵提取物抑制纖維蛋白形成的能力來評價其抗凝活性。經檢測發(fā)現，未經發(fā)酵的黃豆提取物無抗凝活性，發(fā)酵黃豆提取物具有強烈的抗凝活性，在提取物質量濃度為3 mg/mL時，抗凝效率達91%（圖3）。同時，進行了LB培養(yǎng)基發(fā)酵并分析提取物的抗凝活性，發(fā)現經LB培養(yǎng)也可產生抗凝物質，且相同劑量的發(fā)酵黃豆提取物的抗凝活性明顯高于用LB培養(yǎng)提取物。研究結果表明抗凝物質是菌株自身合成的，以黃豆為底物做固體發(fā)酵產生的抗凝效果比單純用LB發(fā)酵產生的抗凝效果要好。先前報道發(fā)現部分芽孢桿菌可分泌抗凝活性物質[13,24]，本實驗所篩選菌株也具有這種特性，具有潛在的應用價值。

圖3 發(fā)酵提取物的抗凝活性分析Fig. 3 Anticoagulant activity of extracts from natto fermentation products

2.5 抗氧化活性分析

圖4 發(fā)酵前后黃豆提取物的DPPH自由基清除活性對比Fig. 4 DPPH radical-scavenging effect of extracts from non-fermented and fermented soybean at various concentrations

通過DPPH自由基清除活性對比分析了發(fā)酵黃豆和未發(fā)酵黃豆的抗氧化活性。如圖4所示，隨著2 種提取物質量濃度的增加，抗氧化活性能力逐漸增強，提取物在一定質量濃度范圍內呈現一定的劑量-效應關系。發(fā)酵黃豆提取物質量濃度在25 mg/mL時，其DPPH自由基清除率達到最大（95%），而未發(fā)酵黃豆的提取物在35 mg/mL的質量濃度下才達到最高值85%。在同等提取物質量濃度下，發(fā)酵黃豆的抗氧化活性明顯高于未發(fā)酵的黃豆。由此可見，通過菌株B. subtilis MJ-1發(fā)酵，顯著提高了黃豆的抗氧化活性，相似的結論也出現在先前報道的豆制品發(fā)酵過程中[13,21,25]。據報道，發(fā)酵過程提高了豆類的總酚和總黃酮類物質的含量，進而導致其抗氧化活性提高[13,21]。

3 結 論

本研究結合纖溶活性篩選法和納豆激酶基因篩選法，快速、準確地篩到了一株高產納豆激酶的枯草芽孢桿菌MJ-1，避免了解淀粉芽孢桿菌的干擾。菌株MJ-1具有高效的納豆激酶合成能力，在黃豆基質上納豆激酶活力達到商業(yè)化納豆產品的酶活力水平。同時，該菌株可合成抗凝成分，使所制備納豆食品富含抗凝活性。另外，通過該菌株的發(fā)酵作用，納豆中抗氧化活性顯著高于未發(fā)酵的黃豆。本研究所制備納豆食品富含纖溶活性、抗凝活性和抗氧化活性，在心血管疾病的預防中具有潛在應用價值。

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Rapid Isolation of a Strain with High Nattokinase Activity and Characterization of As-Fermented Natto Food

LIU Mengjie1, CHEN Shouwen1, WEI Xuetuan1,2,*
(1. State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 2. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

Using the screening method based on fibrinolytic activity and nattokinase gene, a strain named MJ-1 with nattokinase-producing capacity was obtained and identified as Bacillus subtilis by 16S rRNA gene sequence analysis. A natto functional food was prepared by fermentation of soybean with MJ-1, and its nattokinase activity, and anticoagulant and antioxidant activity were evaluated. Under the conditions of 60% initial moisture content and 37 ℃, the maximum nattokinase activity of 90.18 FU/g dry weight was obtained after 20 h fermentation, which reached the activity level of commercial natto. The strain MJ-1 could secret anticoagulant components, resulting in rich anticoagulant activity in natto foods, and the anticoagulant activity of natto water extract at 3 mg/mL reached 91%. Moreover, fermentation with MJ-1 improved the antioxidant activity of soybean significantly.

nattokinase; Bacillus subtilis; gene-based screening method; anticoagulant activity; antioxidant activity

10.7506/spkx1002-6630-201621023

Q815

A

1002-6630（2016）21-0131-05

劉夢潔, 陳守文, 魏雪團. 納豆激酶高產菌的快速篩選及其發(fā)酵納豆特性[J]. 食品科學, 2016, 37(21): 131-135.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621023. http://www.spkx.net.cn

LIU Mengjie, CHEN Shouwen, WEI Xuetuan. Rapid isolation of a strain with high nattokinase activity and characterization of as-fermented natto food[J]. Food Science, 2016, 37(21): 131-135. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201621023. http://www.spkx.net.cn

2016-01-13

國家自然科學基金青年科學基金項目（31501468）；湖北省自然科學基金項目（2014CFB943）

劉夢潔（1990—），男，碩士研究生，研究方向為食品微生物學。E-mail：940475942@qq.com

*通信作者：魏雪團（1984—），男，副教授，博士，研究方向為食品微生物學。E-mail：weixuetuan@mail.hzau.edu.cn