劉夢潔,陳守文,魏雪團(tuán),2,*
(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430070;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北 武漢 430070)
納豆激酶高產(chǎn)菌的快速篩選及其發(fā)酵納豆特性
劉夢潔1,陳守文1,魏雪團(tuán)1,2,*
(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430070;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北 武漢 430070)
通過纖溶活性篩選法和納豆激酶基因篩選法,快速、準(zhǔn)確篩選到一株納豆激酶高產(chǎn)菌株MJ-1,經(jīng)16S rRNA基因序列分析,該菌株被鑒定為枯草芽孢桿菌。以黃豆為原料進(jìn)行固體發(fā)酵制備納豆食品,考察了納豆食品的納豆激酶活力、抗凝活性和抗氧化活性。在初始含水量60%、發(fā)酵溫度37℃的條件下,納豆激酶發(fā)酵活力在20 h達(dá)到最大值(90.18 FU/g,以干質(zhì)量計(jì)),達(dá)到了商業(yè)化納豆的酶活力水平??鼓钚苑治鲲@示該菌株可合成抗凝成分,賦予納豆食品抗凝活性,在提取物質(zhì)量濃度為3 mg/mL時(shí),抗凝效率達(dá)91%。同時(shí),與未發(fā)酵黃豆相比,發(fā)酵過程顯著提高了其抗氧化活性。
納豆激酶;枯草芽孢桿菌;基因篩選法;抗凝活性;抗氧化活性
納豆食品是大豆經(jīng)枯草芽孢桿菌納豆亞種(Bacillus subtilis natto)發(fā)酵而成的傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品,是我國豆豉流傳到日本,經(jīng)改造而成的純種發(fā)酵產(chǎn)品[1-2]。納豆富含蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、維生素和大豆異黃酮等各類成分,賦予其良好的營養(yǎng)性和功能性[3-5]。其中,納豆激酶可高效溶解血栓,作為納豆標(biāo)志性成分備受關(guān)注,基于納豆激酶的保健品和食品已成為我國近年來的研究熱點(diǎn)[6-7]。
相比納豆類保健品,納豆食品價(jià)格低廉,具有更廣泛的潛在消費(fèi)者。然而,目前商業(yè)化的納豆食品中納豆激酶活力一般為20~40 FU/g[8],納豆激酶活力普遍較低,且臭味嚴(yán)重[9],制約納豆食品在我國的進(jìn)一步推廣。2015年,Lee等[10]對比分析了4 株枯草芽孢桿菌的納豆發(fā)酵效果,其中,納豆激酶產(chǎn)量最高的菌株為B. subtilis 14715,其納豆激酶產(chǎn)量達(dá)48 FU/g。納豆激酶產(chǎn)生菌決定納豆品質(zhì),快速準(zhǔn)確篩選納豆激酶高產(chǎn)菌株至關(guān)重要。
目前常采用的篩選方法為:先通過纖溶活性篩選法獲得纖溶酶產(chǎn)生菌,再通過16S rRNA技術(shù)鑒定枯草芽孢桿菌[11-12]。然而,解淀粉芽孢桿菌可產(chǎn)生纖溶酶[13-16],同時(shí)其16S rRNA基因序列同枯草芽孢桿菌相似性達(dá)97%以上,采用目前的方法常誤篩到解淀粉芽孢桿菌。對比分析纖溶酶基因序列,納豆激酶基因序列具有高度的特異性[13,17-18],同解淀粉芽孢桿菌纖溶酶基因序列相似性僅為80%左右。因此,將纖溶活性篩選法和納豆激酶基因鑒定相結(jié)合,可快速、準(zhǔn)確篩選到納豆激酶產(chǎn)生菌,本研究擬將活性篩選法同納豆激酶基因鑒定法相結(jié)合,以期快速篩選到納豆激酶高產(chǎn)菌株。
1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基
菌株篩選材料:豆豉、豆醬,購于武漢各大農(nóng)貿(mào)市場及超市。
DNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker 寶生物工程(大連)有限公司;凝血酶、纖維蛋白原 美國S i g m a-A l d r i c h公司;1,1-二苯基-2-苦基肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH) 上海源葉生物科技有限公司;蛋白胨、酵母抽提物 英國Oxoid公司;其他試劑 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
液體及固體LB培養(yǎng)基;奶粉固體培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10、酵母浸粉5、氯化鈉10、脫脂奶粉10、瓊脂粉15。
1.2 儀器與設(shè)備
CR21G高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司;電熱恒溫隔水式培養(yǎng)箱 黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司;HQL300B柜式恒溫冷凍搖床 武漢中科科儀技術(shù)發(fā)展有限責(zé)任公司;722型可見分光光度計(jì) 上海奧譜勒儀器有限公司;SW-CJ-2F潔凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;電熱恒溫水浴鍋 上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠;高壓蒸汽滅菌鍋 山東新華醫(yī)療器械股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 納豆芽孢桿菌篩選
取各類發(fā)酵豆制品1 g于9 mL無菌水中,37 ℃,180 r/min處理5 min,取上清液涂布到奶粉固體培養(yǎng)基平皿,37 ℃培養(yǎng)24 h,將水解圈較大的單菌落轉(zhuǎn)移至液體LB培養(yǎng)基中,37 ℃,180 r/min培養(yǎng)12 h作為種子液。取1 mL種子液移接至25 g蒸煮黃豆中,37 ℃固體發(fā)酵48 h,每隔12 h攪拌一次,通過纖維蛋白溶解法檢測發(fā)酵產(chǎn)物的纖溶酶活力。選取酶活力較高的菌株進(jìn)行納豆激酶基因檢測:通過細(xì)菌基因組抽提試劑盒抽提待測菌株的總DNA,以aprNF(5’-CCGTGAGAAGCAAAAA ATTGTGGATCA-3’)和aprNR(5’-ATTTATTGTGCAG CTGCTTGTACGTTG-3’)為引物,經(jīng)預(yù)變性(94 ℃,5 min)、變性(94 ℃,30 s)、退火(52 ℃,30 s)、延伸(72 ℃,1 min),30 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)產(chǎn)物最終保藏于4 ℃。PCR產(chǎn)物測序由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成,通過BLAST程序進(jìn)行序列相似性分析。
1.3.2 菌種鑒定
通過1 6 S r R N A基因序列分析法進(jìn)一步進(jìn)行菌種鑒定[19]。16S rRNA基因擴(kuò)增引物為:27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。PCR程序?yàn)椋侯A(yù)變性(94 ℃,5 min);變性(94 ℃,30 s);退火(52 ℃,30 s);延伸(72 ℃,1 min),28個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min,4 ℃保藏。PCR產(chǎn)物測序由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成,序列相似性分析通過BLAST程序完成的,系統(tǒng)進(jìn)化樹通過MEGA 5.0軟件進(jìn)行構(gòu)建。
1.3.3 納豆食品發(fā)酵
將甘油管保藏的菌株MJ-1的菌液劃線于固體LB培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)24 h;挑取單菌落接種至液體LB培養(yǎng)基,37 ℃,180 r/min培養(yǎng)12 h即為發(fā)酵種子液。取1 mL種子液移接至25 g蒸煮并滅菌后的黃豆中,37 ℃固體發(fā)酵48 h,每隔12 h攪拌一次。
1.3.4 生物量分析
在固體發(fā)酵期間,每隔4 h取發(fā)酵樣品,稀釋涂布固體LB培養(yǎng)基平板,37 ℃靜置培養(yǎng)12 h,統(tǒng)計(jì)單菌落個(gè)數(shù),計(jì)算生物量。
1.3.5 納豆激酶活力分析
以1∶5(m/V)的比例向發(fā)酵黃豆中添加蒸餾水,200 r/min處理1 h抽提納豆激酶,10 000 r/min離心20 min,上清液作為待測樣品用于納豆激酶活力分析:依次向試管中加入1.4 mL Tris-HCl(50 mmol/L,pH 7.8)緩沖液、0.4 mL 7.2 mg/mL纖維蛋白原溶液,37 ℃溫浴5 min,再加入0.1 mL凝血酶溶液(20 U/mL),37 ℃溫浴10 min形成人工血栓,加入0.1 mL的待測樣品,37 ℃溫浴60 min,然后加入2 mL 0.2 mol/L三氯乙酸溶液靜止20 min終止反應(yīng),10 000 r/min 離心10 min,取上清液于275 nm波長處測定吸光度,每分鐘275 nm處吸光度增加0.01所需要的酶量定義為1個(gè)單位的纖維蛋白降解酶活力(FU)[20]。
1.3.6 抗凝活性分析
將發(fā)酵黃豆充分破碎,以1∶10(m/V)的比例加入蒸餾水,180 r/min振蕩提取12 h,提取液經(jīng)12 000 r/min離心10 min,上清液經(jīng)冷凍干燥得固體粉末,通過0.05 mol/L Tris-HCl(pH 7.2)緩沖液溶解,用于抗凝活性分析:將1.0 mL待測樣品和1.5 mL 0.1%纖維蛋白原溶液加入比色皿中混合均勻,加入0.1 mL 20 U/mL凝血酶溶液,37 ℃溫浴20 min,檢測405 nm波長處的吸光度為樣品吸光度,以1 mL 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液作為對照??鼓钚裕鼓剩┌凑展剑?)[13]計(jì)算。
1.3.7 抗氧化活性測定
發(fā)酵黃豆和未發(fā)酵黃豆的抗氧化能力通過DPPH自由基清除活性來檢測[13]。將待測樣品充分破碎,以1∶10(m/V)的比例加入80%甲醇溶液,180 r/min振蕩提取12 h,提取液經(jīng)12 000 r/min離心10 min,上清液經(jīng)冷凍干燥得到水提物粉末,將粉末配制成不同質(zhì)量濃度的待測樣品(0.5、1.5、2.5、3.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、45.0 mg/mL)。將0.5 mL待測樣品加入到2.5 mL 75 μmol/L DPPH-甲醇溶液中,室溫反應(yīng)90 min,于波長517 nm處檢測吸光度,以等體積的甲醇作為對照??寡趸钚裕―PPH自由基清除率)通過公式(2)[21]評價(jià)。
2.1 納豆激酶產(chǎn)生菌篩選
表1 MJ-1合成的纖溶酶基因序列同已報(bào)道纖溶酶基因序列相似性分析Table 1 Gene sequence similarity analysis of fibrinolytic enzyme from strain MJ-1 with the reported genes
經(jīng)奶粉平板初篩,獲得24 株透明圈較大的菌株,進(jìn)一步進(jìn)行固體發(fā)酵,選取纖溶酶活力較高的7 株菌進(jìn)行納豆激酶基因篩選鑒定。其中菌株MJ-1擴(kuò)增出目的條帶,測序結(jié)果顯示該條帶長度為1 070 bp,同已報(bào)道的典型纖溶酶基因序列相似性,如表1所示,同典型的納豆激酶基因相似性達(dá)到99%[17],同典型的解淀粉芽孢桿菌纖溶酶DFE、DJ-4相似性僅為80%[14-15],說明該菌株合成的纖溶酶屬于納豆激酶。通過纖溶活性篩選和納豆激酶基因篩選鑒定,快速準(zhǔn)確篩選到了納豆激酶生產(chǎn)菌株。
2.2 菌株鑒定
枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌的纖溶酶基因具有高度的差異性,通過纖溶酶基因分析基本可以準(zhǔn)確地區(qū)分這兩種菌。為了進(jìn)一步驗(yàn)證鑒定結(jié)果,本研究進(jìn)行了16S rRNA基因序列分析。菌株MJ-1的部分16S rRNA基因序列同Bacillus subtilis HYM11的16S rRNA(GenBank注冊號KT961123.1)相似性達(dá)98%。同時(shí),系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示菌株MJ-1同B. subtilis的親緣關(guān)系最近(圖1),進(jìn)一步證明菌株MJ-1屬于枯草芽孢桿菌。
圖1 基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 1 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences
2.3 納豆激酶發(fā)酵過程曲線
圖2 納豆發(fā)酵中菌體生長和納豆激酶合成的過程曲線Fig. 2 Time courses of cell growth and nattokinase biosynthesis during natto fermentation
在初始含水量60%、發(fā)酵溫度37℃條件下,繪制了菌體生長和納豆激酶合成過程曲線(圖2)。隨著菌體生長,納豆激酶逐漸合成。20 h時(shí),納豆激酶發(fā)酵活力達(dá)到最大值,為90.18 FU/g(以干質(zhì)量計(jì)),此時(shí)生物量達(dá)3.02×108CFU/g。此后,隨著生物量的增加,納豆激酶活力逐漸降低,這可能是由于納豆激酶降解所致,由此可見,納豆激酶的合成與菌體的生長并不是完全耦合。目前,常見的商業(yè)化納豆產(chǎn)品中納豆激酶活力一般在20~40 FU/g[8],本研究所制備納豆產(chǎn)品中納豆激酶活力顯著高于商業(yè)化納豆的活性水平,且發(fā)酵周期較短,具有良好的工業(yè)化應(yīng)用前景。
2.4 抗凝活性分析
纖溶活性和抗凝活性是評價(jià)血栓預(yù)防和治療的2 個(gè)重要指標(biāo)。凝血酶在纖維蛋白原形成纖維蛋白(血栓)中起關(guān)鍵作用,是纖維蛋白形成的限速酶[23],本研究通過考察發(fā)酵提取物抑制纖維蛋白形成的能力來評價(jià)其抗凝活性。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn),未經(jīng)發(fā)酵的黃豆提取物無抗凝活性,發(fā)酵黃豆提取物具有強(qiáng)烈的抗凝活性,在提取物質(zhì)量濃度為3 mg/mL時(shí),抗凝效率達(dá)91%(圖3)。同時(shí),進(jìn)行了LB培養(yǎng)基發(fā)酵并分析提取物的抗凝活性,發(fā)現(xiàn)經(jīng)LB培養(yǎng)也可產(chǎn)生抗凝物質(zhì),且相同劑量的發(fā)酵黃豆提取物的抗凝活性明顯高于用LB培養(yǎng)提取物。研究結(jié)果表明抗凝物質(zhì)是菌株自身合成的,以黃豆為底物做固體發(fā)酵產(chǎn)生的抗凝效果比單純用LB發(fā)酵產(chǎn)生的抗凝效果要好。先前報(bào)道發(fā)現(xiàn)部分芽孢桿菌可分泌抗凝活性物質(zhì)[13,24],本實(shí)驗(yàn)所篩選菌株也具有這種特性,具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
圖3 發(fā)酵提取物的抗凝活性分析Fig. 3 Anticoagulant activity of extracts from natto fermentation products
2.5 抗氧化活性分析
圖4 發(fā)酵前后黃豆提取物的DPPH自由基清除活性對比Fig. 4 DPPH radical-scavenging effect of extracts from non-fermented and fermented soybean at various concentrations
通過DPPH自由基清除活性對比分析了發(fā)酵黃豆和未發(fā)酵黃豆的抗氧化活性。如圖4所示,隨著2 種提取物質(zhì)量濃度的增加,抗氧化活性能力逐漸增強(qiáng),提取物在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。發(fā)酵黃豆提取物質(zhì)量濃度在25 mg/mL時(shí),其DPPH自由基清除率達(dá)到最大(95%),而未發(fā)酵黃豆的提取物在35 mg/mL的質(zhì)量濃度下才達(dá)到最高值85%。在同等提取物質(zhì)量濃度下,發(fā)酵黃豆的抗氧化活性明顯高于未發(fā)酵的黃豆。由此可見,通過菌株B. subtilis MJ-1發(fā)酵,顯著提高了黃豆的抗氧化活性,相似的結(jié)論也出現(xiàn)在先前報(bào)道的豆制品發(fā)酵過程中[13,21,25]。據(jù)報(bào)道,發(fā)酵過程提高了豆類的總酚和總黃酮類物質(zhì)的含量,進(jìn)而導(dǎo)致其抗氧化活性提高[13,21]。
本研究結(jié)合纖溶活性篩選法和納豆激酶基因篩選法,快速、準(zhǔn)確地篩到了一株高產(chǎn)納豆激酶的枯草芽孢桿菌MJ-1,避免了解淀粉芽孢桿菌的干擾。菌株MJ-1具有高效的納豆激酶合成能力,在黃豆基質(zhì)上納豆激酶活力達(dá)到商業(yè)化納豆產(chǎn)品的酶活力水平。同時(shí),該菌株可合成抗凝成分,使所制備納豆食品富含抗凝活性。另外,通過該菌株的發(fā)酵作用,納豆中抗氧化活性顯著高于未發(fā)酵的黃豆。本研究所制備納豆食品富含纖溶活性、抗凝活性和抗氧化活性,在心血管疾病的預(yù)防中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。
[1] XU Jianping, DU Ming, YANG Xiulin, et al. Thrmbolytic effects in vivo of nattokinase in a carrageenan-induced rat model of thrombosis[J]. Acta Haematologica, 2014, 132(2): 247-253. DOI:10.1159/000360360.
[2] MITSUI N, MURASAWA H, SEKIGUCHI J. Development of natto with germination-defective mutants of Bacillus subtilis (natto)[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2009, 82(4): 741-748. DOI:10.1007/s00253-009-1894-y.
[3] YOSHIKAWA Y, CHEN Pengyin, ZHANG Bo, et al. Evaluation of seed chemical quality traits and sensory properties of natto soybean[J]. Food Chemistry, 2014, 153: 186-192. DOI:10.1016/ j.foodchem.2013.12.027.
[4] KUBO Y, ROONEY A P, TSUKAKOSHI Y, et al. Phylogenetic analysis of Bacillus subtilis strains applicable to natto (fermented soybean) production[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2011, 77(18): 6463-6469. DOI:10.1128/AEM.00448-11.
[5] 彭亮, 覃光球. 納豆的特異性保健功效因子研究進(jìn)展[J].中國食物與營養(yǎng), 2013, 19(10): 65-69. DOI:10.3969/ j.issn.1006-9577.2013.10.017.
[6] MURAKAMI K, YAMANAKA N, OHNISHI K, et al. Inhibition of angiotensin I converting enzyme by subtilisin nat (nattokinase) in natto, a Japanese traditional fermented food[J]. Food & Function, 2012, 3(6): 674-678. DOI:10.1039/c2fo10245e.
[7] LIU Junguo, XING Jianmin, CHANG Tianshi, et al. Optimization of nutritional conditions for nattokinase production by Bacillus natto NLSSE using statistical experimental methods[J]. Process Biochemistry, 2005, 40(8): 2757-2762. DOI:10.1016/ j.procbio.2004.12.025.
[8] TAKOAKA S. Bacillus natto culture extract: 20060263865[P]. 2006-11-23.
[9] TAKEMURA H, ANDO N, TSUKAMOTO Y. Breeding of branched short-chain fatty acids non-producing natto bacteria and its application to production of natto with light smells[J]. Nippon Shokuhin Kagaku Kogaku Kaishi, 2000, 47(10): 773-779. DOI:10.3136/nskkk.47.773.
[10] LEE B H, LAI Y S, WU S C. Antioxidation, angiotensin converting enzyme inhibition activity, nattokinase, and antihypertension of Bacillus subtilis (natto)-fermented pigeon pea[J]. Journal of Food and Drug Analysis, 2015, 23(4): 750-757. DOI:10.1016/j.jfda.2015.06.008.
[11] KWON E Y, KIM K M, KIM M K, et al. Production of nattokinase by high cell density fed-batch culture of Bacillus subtilis[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering, 2011, 34(7): 789-793. DOI:10.1007/ s00449-011-0527-x.
[12] KU T W, TSAI R L, PAN T M. A simple and cost-saving approach to optimize the production of subtilisin NAT by submerged cultivation of Bacillus subtilis natto[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(1): 292-296. DOI:10.1021/jf8024198.
[13] WEI Xuetuan, LUO Mingfang, XU Lin, et al. Production of fibrinolytic enzyme from Bacillus amyloliquefaciens by fermentation of chickpeas, with the evaluation of the anticoagulant and antioxidant properties of chickpeas[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59(8): 3957-3963. DOI:10.1021/jf1049535.
[14] CHOI N S, CHANG K T, MAENG P J, et al. Cloning, expression, and fibrin (ogen)olytic properties of a subtilisin DJ-4 gene from Bacillus sp. DJ-4[J]. FEMS Microbiology Letters, 2004, 236: 325-331. DOI:10.1111/j.1574-6968.2004.tb09665.x.
[15] PENG Yong, YANG Xiaojuan, XIAO Lu, et al. Cloning and expression of a fibrinolytic enzyme (subtilisin DFE) gene from Bacillus amyloliquefaciens DC-4 in Bacillus subtilis[J]. Research in Microbiology, 2004, 155(3): 167-173. DOI:10.1016/ j.resmic.2003.10.004.
[16] KIM G M, LEE A R, LEE K W, et al. Characterization of a 27 kDa fibrinolytic enzyme from Bacillus amyloliquefaciens CH51 isolated from cheonggukjang[J]. Journal of Microbiology and Biotechnology, 2009, 19(9): 997-1004. DOI:10.4014/jmb.0811.600.
[17] NAKAMURA T, YAMAGATA Y, ICHISHIMA E. Nucleotide sequence of the subtilisin NAT gene, aprN, of Bacillus subtilis (natto)[J]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 1992, 56(11): 1869-1871. DOI:10.1271/bbb.56.1869.
[18] WEI Xuetuan, LUO Mingfang, XIE Yuchun, et al. Strain screening, fermentation, separation, and encapsulation for production of nattokinase functional food[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2012, 168: 1753-1764. DOI:10.1007/s12010-012-9894-2.
[19] WEI Xuetuan, DENG Xiaowu, CAI Dongbo, et al. Decreased tobacco-specific nitrosamines by microbial treatment with Bacillus amyloliquefaciens DA9 during the air-curing process of burley tobacco[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2014, 62(52): 12701-12706. DOI:10.1021/jf504084z.
[20] WEI Xuetuan, LUO Mingfang, LIU Huizhou. Preparation of the antithrombotic and antimicrobial coating through layer-by-layer selfassembly of nattokinase-nanosilver complex and polyethylenimine[J]. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2014, 116(1): 418-423. DOI:10.1016/j.colsurfb.2014.01.034.
[21] JUAN M Y, CHOU C C. Enhancement of antioxidant activity, total phenolic and flavonoid content of black soybeans by solid state fermentation with Bacillus subtilis BCRC 14715[J]. Food Microbiology, 2010, 27(5): 586-591. DOI:10.1016/j.fm.2009.11.002.
[22] AGREBI R, HADDAR A, HMIDET N, et al. BSF1 fibrinolytic enzyme from a marine bacterium Bacillus subtilis A26: purification, biochemical and molecular characterization[J]. Process Biochemistry, 2009, 44(11): 1252-1259. DOI:10.1016/j.procbio.2009.06.024.
[23] SCHERAGA H A. The thrombin-fibrinogen interaction[J]. Biophysical Chemistry, 2004, 112(2/3): 117-130. DOI:10.1111/j.1749-6632.1958. tb36865.x.
[24] OMURA K, HITOSUGI M, ZHU Xia, et al. A newly derived protein from Bacillus subtilis natto with both antithrombotic and fibrinolytic effects[J]. Journal of Pharmacological Sciences, 2005, 99(3): 247-251. DOI:10.1254/jphs.FP0050408.
[25] LEE I H, HUNG Y H, CHOU C C. Solid-state fermentation with fungi to enhance the antioxidative activity, total phenolic and anthocyanin contents of black bean[J]. International Journal of Food Microbiology, 2008, 121(2): 150-156. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2007.09.008.
Rapid Isolation of a Strain with High Nattokinase Activity and Characterization of As-Fermented Natto Food
LIU Mengjie1, CHEN Shouwen1, WEI Xuetuan1,2,*
(1. State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 2. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)
Using the screening method based on fibrinolytic activity and nattokinase gene, a strain named MJ-1 with nattokinase-producing capacity was obtained and identified as Bacillus subtilis by 16S rRNA gene sequence analysis. A natto functional food was prepared by fermentation of soybean with MJ-1, and its nattokinase activity, and anticoagulant and antioxidant activity were evaluated. Under the conditions of 60% initial moisture content and 37 ℃, the maximum nattokinase activity of 90.18 FU/g dry weight was obtained after 20 h fermentation, which reached the activity level of commercial natto. The strain MJ-1 could secret anticoagulant components, resulting in rich anticoagulant activity in natto foods, and the anticoagulant activity of natto water extract at 3 mg/mL reached 91%. Moreover, fermentation with MJ-1 improved the antioxidant activity of soybean significantly.
nattokinase; Bacillus subtilis; gene-based screening method; anticoagulant activity; antioxidant activity
10.7506/spkx1002-6630-201621023
Q815
A
1002-6630(2016)21-0131-05
劉夢潔, 陳守文, 魏雪團(tuán). 納豆激酶高產(chǎn)菌的快速篩選及其發(fā)酵納豆特性[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(21): 131-135.
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621023. http://www.spkx.net.cn
LIU Mengjie, CHEN Shouwen, WEI Xuetuan. Rapid isolation of a strain with high nattokinase activity and characterization of as-fermented natto food[J]. Food Science, 2016, 37(21): 131-135. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201621023. http://www.spkx.net.cn
2016-01-13
國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31501468);湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014CFB943)
劉夢潔(1990—),男,碩士研究生,研究方向?yàn)槭称肺⑸飳W(xué)。E-mail:940475942@qq.com
*通信作者:魏雪團(tuán)(1984—),男,副教授,博士,研究方向?yàn)槭称肺⑸飳W(xué)。E-mail:weixuetuan@mail.hzau.edu.cn