雷歡，魏宇清，方祥，廖振林，王麗，鐘青萍

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州，510642)

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副溶血弧菌生物膜的形成及殼聚糖的抑制作用

雷歡，魏宇清，方祥，廖振林，王麗，鐘青萍*

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州，510642)

考察了不同來源的副溶血弧菌生物膜的形成能力，分析了不同培養(yǎng)條件對副溶血弧菌生物膜形成的影響，并進(jìn)一步研究了殼聚糖對生物膜形成的抑制作用。采用結(jié)晶紫法測定生物膜形成量，XTT法檢測生物膜的代謝活性，苯酚-硫酸法測定生物膜的胞外多糖，分析不同濃度殼聚糖對副溶血弧菌生物膜的抑制效果。結(jié)果表明，不同菌株生物膜形成條件不同，成膜能力不同，在蟹殼上更易形成生物膜。殼聚糖表現(xiàn)出了較好的抑制副溶血弧菌生物膜形成的能力，最低抑菌濃度下對生物膜形成的抑制率可達(dá)70.98%，胞外多糖的減少率為78.04%，代謝活性抑制率為46.83%。

副溶血弧菌；生物膜；殼聚糖；抑制

副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)是一種重要的食源性致病菌，常見于海產(chǎn)品中，食用未煮熟海鮮等食品可導(dǎo)致細(xì)菌感染，乃至食物中毒。生物膜是微生物細(xì)胞及其產(chǎn)生的細(xì)胞外大分子多聚物所形成的一種特殊細(xì)菌群落，它也是細(xì)菌抵抗不利環(huán)境、產(chǎn)生耐藥性并導(dǎo)致持續(xù)感染的重要方式。在食品的加工設(shè)備中，細(xì)菌容易粘附在不銹鋼、玻璃、橡膠等材料表面形成生物膜，增強(qiáng)其耐藥性，從而難以被消毒劑、抗生素、防腐劑等清除[1]。目前對銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌和變異鏈球菌等致病菌的生物膜研究較多[2-3]，但有關(guān)副溶血弧菌生物膜形成及對不良環(huán)境抗性的報(bào)道較少。

近年來防腐劑在生物膜的控制方面的研究逐漸興起，尋求天然、高效、安全的防腐劑成為研究的重點(diǎn)[4]。殼聚糖具有廣譜抗菌性、無毒性、良好的生物降解性和生物相溶性的特點(diǎn)，常用于果蔬保鮮、抑菌等方面，其對生物膜的抑制作用的研究報(bào)道相對較少，CARLSON[5]等研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過殼聚糖涂膜后的介質(zhì)表面對細(xì)菌和真菌生物膜的形成具有抑制作用；MU[6]等研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖結(jié)合抗生素對李斯特菌被膜的抑制和清除作用顯著。

細(xì)菌形成生物膜受多種因素的影響，如材料表面、溫度、營養(yǎng)條件、pH值和同生菌等[4, 7- 8]。因此本文首先以副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株及24株分離株為研究對象，采用結(jié)晶紫染色法對其生物膜的形成能力進(jìn)行分析，并選取成膜能力較強(qiáng)的菌株進(jìn)一步研究，考察時(shí)間、溫度、pH值、鹽濃度、材料等因素對生物膜形成的影響。在此基礎(chǔ)上研究殼聚糖對副溶血弧菌生物膜的抑制作用，測定了不同濃度的殼聚糖對生物膜形成的抑制率、代謝活性抑制率和胞外多糖減少率，為副溶血弧菌生物膜的有效控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC17802購于廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心，標(biāo)準(zhǔn)菌株J5421由中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所贈(zèng)送；實(shí)驗(yàn)室從海產(chǎn)品中分離并經(jīng)過生理生化鑒定和測序鑒定的菌株24株(表1),均保藏在-80 ℃條件下。

表1 實(shí)驗(yàn)所用菌株

1.2 主要試劑和儀器

殼聚糖(青島潛光生物工程有限公司)，Pronase E(SIGMA公司)，TCA(天津市福晨化學(xué)試劑廠)，XTT(SIGMA公司)，96孔板(上海圣納堡生物科技開發(fā)有限公司)，Multiskan FC 酶標(biāo)儀(Thermo 公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌懸液的制備

將菌種活化后，從斜面培養(yǎng)基上挑取適量菌體，轉(zhuǎn)接入3% TSB培養(yǎng)基中，在37 ℃下恒溫150 r/min振蕩培養(yǎng)12～16 h后，于4 ℃下，4 000 r/min離心10 min收集菌體，用無菌生理鹽水將菌濃度調(diào)整到108CFU/mL左右待用。

1.3.2 結(jié)晶紫染色法測定生物膜形成量

將制備好的菌懸液與TSB培養(yǎng)基按1∶3的比例加入96孔板中，每孔200 μL，于一定溫度下培養(yǎng)一定時(shí)間后，取出孔板，棄去浮游菌，用250 μL無菌生理鹽水清洗2次，然后60 ℃干燥固定30 min，每孔加入0.1%的結(jié)晶紫溶液200 μL，染色5 min，用250 μL無菌生理鹽水清洗3次，干燥，再加入33%的冰乙酸200 μL，放置10 min，在酶標(biāo)儀595 nm處測OD值[9]。

1.3.3 不同材料上生物膜的形成

在離心管中加入TSB培養(yǎng)基10 mL，分別放入已滅菌的不銹鋼片、玻璃片、魚鱗和蟹殼，1%添加量加入菌懸液，培養(yǎng)48 h，取出不銹鋼片等材料，用PBS溶液清洗3次，60 ℃干燥30 min；用0.1%結(jié)晶紫染液浸泡染色5 min，PBS沖去多余染色液，晾干；再加入33%冰醋酸溶液溶解結(jié)晶紫，測定OD值，同時(shí)設(shè)空白對照。

1.3.4 殼聚糖最小抑菌濃度(MIC)的測定

采用96孔板微量稀釋法測定最小抑菌濃度。將殼聚糖以培養(yǎng)基二倍稀釋成6個(gè)梯度，再加入一定量的菌液，設(shè)置未加殼聚糖的對照組，于28 ℃下培養(yǎng)24 h，肉眼觀察清亮的孔中殼聚糖的濃度即為MIC，再通過測定OD值進(jìn)一步判斷。

1.3.5 殼聚糖對生物膜形成的抑制作用

取一定量的菌懸液加入96孔板中，加入含殼聚糖終濃度分別為MIC、1/2 MIC、1/8 MIC的TSB培養(yǎng)基，對照組只加入TSB培養(yǎng)基，28 ℃條件下培養(yǎng)48 h，結(jié)晶紫染色法測定生物膜OD值，計(jì)算抑制率。

(1)

1.3.6 生物膜代謝活性測定

將XTT用PBS配制成1 g/mL的溶液，儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱中。甲萘醌在用之前溶解在丙酮中，使其終濃度為1 mmol/L，每次實(shí)驗(yàn)所用XTT與甲萘醌比例為12.5∶1。副溶血弧菌培養(yǎng)48 h后形成生物膜，移除浮游菌，用100 μL無菌PBS緩沖液沖洗3次，加入13.5 μL的XTT與甲萘醌混合液，輕輕振動(dòng)孔板，然后放置在黑暗處37 ℃溫育2～3 h，另設(shè)對照組，在450 nm處測定吸光值[10]。

1.3.7 胞外多糖含量測定

將培養(yǎng)后的副溶血弧菌4 000 r/min離心10 min，收集菌體重懸于10 mL的滅菌生理鹽水中，煮沸10 min，室溫冷卻20 min。再加入50 μL的Pronase E，37 ℃孵育2 h，加入200 μL的質(zhì)量濃度為10%的TCA溶液，冰水放置30 min，10 000 r/min離心30 min。收集上清液，加入等體積的乙醇溶液，-20 ℃放置1 h，15 000 r/min離心20 min，除去上清液，沉淀物用95%的苯酚和5 mL濃硫酸，沸水浴10 min，反應(yīng)液呈紅色，設(shè)置對照組，在450 nm下測定吸光值。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值，結(jié)果用Graphpad prism 6.0作圖，數(shù)據(jù)用SPSS 20進(jìn)行分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株的生物膜形成能力

采用結(jié)晶紫染色法考察了副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株及24株分離株的生物膜形成能力，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出1號、14號、15號、21號、22號、24號菌株成膜能力較強(qiáng)，而其他菌株的成膜能力相差不大。21號和22號菌株成膜量明顯高于其他菌株，具有顯著性差異。因此，選取21號和22號菌株作為后續(xù)研究對象，與ATCC17802菌株和J5421菌株進(jìn)行比較。

圖1 不同菌株形成生物膜的能力Fig.1 Biofilm formation of different strains 注：*表示每個(gè)菌株生物膜的OD值與空白相比顯著(P<0.05)。

2.2 不同條件對副溶血弧菌生物膜形成的影響

2.2.1 不同培養(yǎng)時(shí)間對生物膜形成的影響

由圖2可知，培養(yǎng)不同時(shí)間的4株副溶血弧菌成膜趨勢相同，培養(yǎng)2 d時(shí)OD值最大，形成生物膜量最多，2 d 后生物膜形成量逐漸減少。因此后續(xù)研究中的培養(yǎng)時(shí)間為48 h。

圖2 不同培養(yǎng)時(shí)間下4株菌株生物膜的形成Fig.2 Biofilm formation of strains at different culture times注：圖中有相同字母代表無顯著性差異(P>0.05)，不同字母代表有顯著性差異(P<0.05)。

2.2.2 不同培養(yǎng)溫度對生物膜形成的影響

考察了4株菌在22、28、37 ℃下的成膜能力，由圖3可以看出，4株菌在此3個(gè)溫度下成膜趨勢基本相同，28 ℃下形成生物膜量最大。

圖3 不同培養(yǎng)溫度對生物膜形成影響Fig.3 The effect of temperature on biofilm formation

2.2.3 不同pH對生物膜形成的影響

不同的pH對副溶血弧菌生物膜的影響如圖4所示，ATCC17802和J5421菌株在pH為7～8時(shí)生物膜形成量較多，且在pH7時(shí)生物膜形成量最大，但在pH低于6和高于9時(shí)，不利于生物膜形成。對于21號和22號菌株，pH為5～9時(shí)有利于生物膜形成，數(shù)據(jù)分析表明在這一區(qū)間內(nèi)無顯著性差異。在pH低于5和高于9時(shí)不利于生物膜生成。

圖4 不同pH對生物膜形成能力影響Fig.4 The effect of pH on biofilm formation 注：圖中有相同字母代表無顯著性差異(P>0.05)，不同字母代表有顯著性差異(P<0.05)。

2.2.4 不同NaCl濃度對生物膜形成的影響

不同NaCl濃度對4株副溶血弧菌生物膜形成的影響如圖5所示，NaCl濃度為3%～3.5%時(shí)最有利于ATCC17802和J5421菌株形成生物膜，且在3%時(shí)生物膜形成量最大。NaCl濃度為3.5%～4.0%時(shí)最有利于22號菌株成膜，在3.5%濃度下形成生物膜量最多。說明高鹽濃度下有利于這3株菌形成生物膜。但21號菌株較為特別，NaCl濃度為0.5%～4%時(shí)皆有較強(qiáng)的成膜能力，且低鹽濃度下更易形成生物膜，NaCl濃度為0.5%時(shí)生物膜量最大。

圖5 不同NaCl濃度對生物膜形成能力影響Fig.5 The effects of NaCl concentrations on biofilm formation注：圖中有相同字母代表無顯著性差異(P>0.05)，不同字母代表有顯著性差異(P<0.05)。

2.2.5 不同黏附材料對生物膜形成的影響

本研究考察了不銹鋼片、玻璃片、魚鱗和蟹殼等材料上副溶血弧菌形成生物膜能力的差異，從圖6中可以看出副溶血弧菌在蟹殼上形成的生物膜量最大，而其他3種材料上的生物膜量相差不大，在玻片和不銹鋼片上黏附能力較低。

圖6 不同黏附材料上生物膜的形成量Fig.6 Biofilm formation on different adhesive materials 注：圖中有相同字母代表無顯著性差異(P>0.05)，不同字母代表有顯著性差異(P<0.05)。

2.3 殼聚糖對副溶血弧菌生物膜形成的抑制作用

2.3.1 殼聚糖對副溶血弧菌的最小抑菌濃度(MIC)

設(shè)置6個(gè)梯度的殼聚糖濃度，培養(yǎng)過夜后，肉眼觀察96孔板中清亮的孔中殼聚糖的濃度即為MIC，再通過測定OD值進(jìn)一步判斷其對4株菌的MIC。由圖7可知?dú)ぞ厶菍?株菌的MIC皆為1.25 mg/mL。

圖7 殼聚糖對4株菌的最小抑菌濃度Fig.7 Minimum inhibitory concentration of chitosan on fourstrains 注：*表示與空白相比顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。

2.3.2 不同濃度殼聚糖抑制副溶血弧菌生物膜形成

以標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC17802為研究對象，考察了不同濃度殼聚糖對副溶血弧菌生物膜的抑制作用。表2結(jié)果所示，隨著殼聚糖濃度的升高，抑制率明顯增大。殼聚糖濃度為MIC時(shí)對生物膜形成的抑制率為70.98%，對代謝活性的抑制率為46.83%，胞外多糖的減少率為78.04%。表明殼聚糖對副溶血弧菌生物膜的形成具有較好的抑制作用。

表2 不同濃度殼聚糖對副溶血弧菌生物膜的影響

注：圖中有相同字母代表無顯著性差異(P>0.05)，不同字母代表有顯著性差異(P<0.05)。

3 結(jié)論

不同時(shí)間、溫度、pH、鹽濃度對副溶血弧菌生物膜形成有較大的影響，且不同菌株成膜能力不同。副溶血弧菌在蟹殼上更容易形成生物膜。經(jīng)過MIC濃度的殼聚糖處理的副溶血弧菌，生物膜形成量大大減少，代謝活性顯著降低，胞外多糖含量明顯減少，表明殼聚糖可以有效地抑制副溶血弧菌生物膜的形成。

4 討論

溫度、時(shí)間、鹽濃度等條件影響生物膜的形成。副溶血弧菌屬嗜鹽菌，在3%鹽含量時(shí)生長旺盛。Na+能夠驅(qū)動(dòng)海洋細(xì)菌鞭毛的運(yùn)動(dòng)，而鞭毛的運(yùn)動(dòng)能夠促進(jìn)生物膜的形成[11]。副溶血弧菌在較高鹽濃度下易形成生物膜，但不同菌株形成最多生物膜所需的鹽濃度不同，成膜情況表現(xiàn)出菌株的差異性。副溶血弧菌在48 h時(shí)生物膜形成量最大，之后有所減少，這一變化主要是因?yàn)樯锬ぴ谛纬蛇^程中遵循從初始粘附到成熟，再到脫落這一規(guī)律性[12]。本研究中副溶血弧菌在28 ℃時(shí)形成生物膜量大于22 ℃、37 ℃下的成膜量，而且在蟹殼和魚鱗上更易形成生物膜。HAN等[8]研究表明較高溫度(15～37 ℃)培養(yǎng)比低溫(4～10 ℃)培養(yǎng)更有利于副溶血弧菌生物膜形成；在蟹的表面形成的生物膜量大于在蝦的表面，這與我們的研究結(jié)果一致。生物膜的形成和成熟與材料表面的粗糙度有關(guān)[13]；材料的疏水性亦有影響，HYDE等[14]研究發(fā)現(xiàn)疏水性界面上細(xì)胞黏附及生物膜成熟速度較慢。

細(xì)菌在形成生物膜的過程中會(huì)產(chǎn)生大量的胞外聚合物，其中胞外多糖對生物膜的形成影響較大，能夠增強(qiáng)細(xì)菌對外界刺激、抗生素類藥物的抵抗力。有研究表明，胞外多糖是帶負(fù)電荷的，會(huì)吸收多肽鏈中帶正電荷的氨基側(cè)鏈，形成一道屏障，從而妨礙親水性的抗生素滲透入菌體產(chǎn)生殺菌作用，使抗生素的殺菌能力顯著降低[15]。本研究表明殼聚糖對副溶血弧菌生物膜有較強(qiáng)的抑制作用，最低抑菌濃度(MIC)和1/2 MIC下胞外多糖的減少率分別為78.04%和76.31%，生物膜形成抑制率分別為70.98%和68.37%。帶正電荷的殼聚糖和帶負(fù)電荷的細(xì)菌細(xì)胞膜相互作用，使細(xì)胞膜通透性破壞，造成細(xì)胞成分的泄漏；而且小分子的殼聚糖可滲透進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與帶陰離子的生物大分子發(fā)生作用，破壞細(xì)胞的正常代謝活動(dòng)，從而抑制細(xì)菌的生長[16]。本研究的結(jié)果表明殼聚糖可以有效控制副溶血弧菌生物膜的形成，為消除其殘留、保障食品安全提供理論依據(jù)。

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Biofilm formation of Vibrio parahaemolyticus and the inhibition effects of chitosan

LEI Huan, WEI Yu-qing, FANG Xiang, LIAO Zhen-lin, WANG Li, ZHONG Qing-ping*

(College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642，China)

Vibrioparahaemolyticusis one kind of important foodborne pathogen. In this paper, the abilities of biofilm formation of different strains ofV.parahaemolyticuswere determined, and the effects of culture conditions on biofilm formation were analyzed. Furthermore, inhibition effects of chitosan on biofilm formation ofV.parahaemolyticuswere also investigated. We used the crystal violet straining method to measure the amount of biofilm formation. XTT reduction assay and phenol-sulfuric acid method were used to detect the changes of metabolic activities and extracellular polysaccharide of biofilm, respectively. The results showed that the biofilm formation was different between strains ofV.parahaemolyticusunder different conditions. The biofilm would form easily on crab shell. Chitosan exhibited antibiofilm activity onV.parahaemolyticus. Under the MIC of chitosan, the amounts of biofilm and extracellular polysaccharide were decreased 70.98% and 78.04%, respectively, and the metabolic activity was reduced 46.83%.

Vibrioparahaemolyticus; biofilm; chitosan; inhibition

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201610005

碩士研究生(鐘青萍副教授為通訊作者,E-mail：zhongqp@scau.edu.cn)。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31271956)

2016-05-31，改回日期：2016-06-27