何勇,楊帆,夏潤,丁洪波,趙云
(1.四川大學(xué),四川成都610065;2.成都蓉生藥業(yè)有限責(zé)任公司,四川成都610041)
影響人血白蛋白Fv過濾時間的工藝研究
何勇1,2,楊帆2,夏潤2,丁洪波2,趙云1★
(1.四川大學(xué),四川成都610065;2.成都蓉生藥業(yè)有限責(zé)任公司,四川成都610041)
在利用壓濾技術(shù)分離Fv時,時常會出現(xiàn)過濾時間長,F(xiàn)v沉淀中液體含量高及沉淀凍存到溫時間長的情況。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),上述情況主要受Fv制作時緩沖液添加速度及過濾時壓濾機(jī)進(jìn)液壓強(qiáng)的影響。在其他工藝參數(shù)不變的情況下,改變緩沖液加液速度及進(jìn)液壓強(qiáng)。經(jīng)多批次生產(chǎn)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),在平均加液速度為36L/h及進(jìn)液壓強(qiáng)為160kPa時,能大幅縮短過濾時長,減少沉淀中液體含量,縮短沉淀凍存到溫時間。此工藝對縮短生產(chǎn)周期,降低能耗有重要意義。
人血白蛋白;Fv;加液速度;進(jìn)液壓強(qiáng);過濾時長
人血白蛋白是一種分子量小、表面積較大、具有高滲透壓的蛋白質(zhì),對治療失血性休克、嚴(yán)重?zé)齻⒛X水腫、肝腎疾病血癥有重要作用。人血白蛋白是血液制品的主要產(chǎn)品,也是血漿蛋白生產(chǎn)工藝主線的最終產(chǎn)物。目前人血白蛋白的分離及純化應(yīng)用最廣泛的是低溫乙醇法。多數(shù)血液制品生產(chǎn)企業(yè)采用改良的低溫乙醇工藝Cohn6/9法或N/K(Nitschmann-Kistlcr)法[1],利用壓濾技術(shù)將固液分離得到人血白蛋白。壓濾分離為深層過濾,即過濾介質(zhì)是具有一定厚度的濾板,其內(nèi)部為迂回曲折的結(jié)構(gòu),過濾中多使用助濾劑,其粒間隙也構(gòu)成了曲折的結(jié)構(gòu)[2,3]。過濾液通過濾板時,主要通過機(jī)械阻擋的方式捕捉固體成分。在實際生產(chǎn)中,利用壓濾技術(shù)對制作完成的Fv進(jìn)行過濾時,時常會出現(xiàn)過濾時間長,壓濾機(jī)過濾板壓高,吹干后濾餅中濾液多的情況,從而影響人血白蛋白中間體Fv沉淀的冷凍暫存及延長生產(chǎn)周期。通過研究發(fā)現(xiàn),影響過濾壓力和過濾時長的原因主要與Fv制作時緩沖液的加液速度和過濾時壓濾機(jī)的進(jìn)液壓有關(guān)。
1.1主要設(shè)備
壓濾機(jī)(FC.800.AC),購自EUROFILTEC公司;冰箱(MDF-U5412),購自SANYO公司;氣動隔膜泵(PX2),購自WILDEN公司;蠕動泵(L/S),購自MASTER FLEX公司。
1.2主要材料
50P濾板,美國PAll公司;助濾劑硅藻土,臨江益瑞石硅藻土有限公司;緩沖液,成都蓉生藥業(yè)有限責(zé)任公司;健康人血漿,成都蓉生藥業(yè)有限責(zé)任公司。
2.1制備人血白蛋白
制備人血白蛋白的低溫乙醇工藝如圖1。
圖1 白蛋白低溫乙醇工藝
2.2緩沖液加液速度的控制
用蠕動泵添加緩沖液至反應(yīng)罐中,由流量計讀取加液速度,通過控制蠕動泵的轉(zhuǎn)速控制加液速度[4]。
2.3過濾進(jìn)液壓強(qiáng)的控制
用氣動隔膜泵傳輸制品至壓濾機(jī),由進(jìn)液壓力表讀取進(jìn)液壓強(qiáng),氣動泵轉(zhuǎn)速越快,壓濾機(jī)進(jìn)液壓越高。通過調(diào)節(jié)氣動泵轉(zhuǎn)速控制進(jìn)液壓強(qiáng)[5]。
2.4過濾時間的檢測
從Fv過濾開始計時,至濾液過濾完壓濾機(jī)吹干結(jié)束為過濾時間。記錄在不同的加液速度和過濾進(jìn)液壓下過濾所用的時間t(h)。
2.5沉淀凍存到溫時間檢測
在白蛋白生產(chǎn)過程中,常出現(xiàn)多批次的白蛋白中間體(Fv沉淀)用低溫冰箱暫存后再合并精制的情況。過濾所得到的Fv沉淀用醫(yī)用袋裝好后放入低溫冰箱,沉淀從-8℃凍存到-35℃所用時間即為沉淀凍存到溫時間。記錄不同的沉淀凍存到溫時間t(h)。
2.6沉淀中液體含量的測定
過濾所得Fv沉淀重量為M(g),沉淀溶解后用雙縮脲法測定蛋白濃度為C(g/L),溶解液體積V(L),由公式得出沉淀中液體含量(%)。
3.1加液速度的影響
在其他工藝參數(shù)一致情況下,固定進(jìn)液壓強(qiáng),以3個批次為同一組加液速度,統(tǒng)計在不同的加液速度下過濾時長,沉淀中液體含量及沉淀凍存到溫時間的情況,如圖2、3所示。
圖2 加液速度對過濾時長及沉淀中液體含量的影響
圖3 加液速度對沉淀凍存到溫時間的影響
由圖2、3得出,緩沖液的加液速度越快,制品過濾時間越短,沉淀中的液體含量低,沉淀凍存到溫時間越短。其主要原因是緩沖液加液速度越快,越有利于制品中的蛋白形成較大的聚集體,在過濾時越大的聚集體越容易被濾板及濾餅攔截,所以過濾速度越快,得到的沉淀中液體含量越少,沉淀凍存到溫時間越短。加液速度不能過快,由于緩沖液是由酸和乙醇混合而成,過快的加液速度會使添加的緩沖液不能及時的被分散導(dǎo)致局部蛋白變性。
3.2進(jìn)液壓強(qiáng)的影響
在其他工藝參數(shù)一致情況下,固定緩沖液加液速度,以3個批次為同一組過濾進(jìn)液壓強(qiáng),統(tǒng)計在不同進(jìn)液壓強(qiáng)下過濾時長,沉淀中液體含量及沉淀凍存到溫時間的情況,見圖4、5。
圖4 進(jìn)液壓強(qiáng)對過濾時長及沉淀中液體含量的影響
圖5 進(jìn)液壓強(qiáng)對沉淀凍存到溫的影響
由圖4、5得出,進(jìn)液壓強(qiáng)過低或過高都會增加過濾時間。這主要是由于進(jìn)液壓強(qiáng)由氣動隔膜泵控制,進(jìn)液壓強(qiáng)越低則氣動隔膜泵的轉(zhuǎn)速慢,相應(yīng)的過濾速度越慢;進(jìn)液壓越高則氣動泵的轉(zhuǎn)速越快,相應(yīng)的過濾速度越快。但50p濾板有其自身的過濾能力,過快的過濾速度會使制品堆積在濾板上,不利于疏松的濾餅形成,濾液不能順利穿過濾餅,使后期過濾難度增加,進(jìn)而延長過濾時間。所以應(yīng)選擇適中的進(jìn)液壓強(qiáng),即160Kpa的進(jìn)液壓強(qiáng)。
3.3過濾時間
在其他參數(shù)一致的情況下,選擇緩沖液加液速度為36L/h,過濾進(jìn)液壓強(qiáng)為160kPa,進(jìn)行5個批次的平行驗證,得到的結(jié)果如表1。
表1 過濾時間對沉淀中濾液含量和凍存到溫時間的影響
過濾平均時間t=2.34h,過濾時間的標(biāo)準(zhǔn)差σ=0.024;沉淀中液體平均含量1.16%,沉淀中濾液含量標(biāo)準(zhǔn)差σ=0.024;沉淀凍存到溫平均時間t=18.2h,沉淀凍存到溫時間標(biāo)準(zhǔn)差σ=0.200。
結(jié)果表明:在其他工藝參數(shù)一致的情況下,緩沖液加液速度越快,過濾時間越短;過低和過高的進(jìn)液壓強(qiáng)都會延長過濾時間,只有在適中的進(jìn)液壓強(qiáng)下,過濾時間才最短。添加緩沖液越快,越有利于形成大塊的聚合物;適中的進(jìn)液壓強(qiáng)有利于形成疏松的濾餅。制品中大塊聚合物和疏松的濾餅更有利于過濾,在吹干壓濾機(jī)時,液體更容易穿過濾餅,形成的沉淀液體含量低,從而縮短沉淀凍存到溫時間。實驗表明,在一定的緩沖液添加速度和進(jìn)液壓強(qiáng)下進(jìn)行的平行驗證,F(xiàn)v過濾時間短,F(xiàn)v沉淀液體含量低,F(xiàn)v沉淀凍存到溫時間短,且此工藝穩(wěn)定性高,重現(xiàn)性好。
[1]浦奕奕.低溫乙醇法在人血白蛋白工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].考試周刊,2008,2(3):236-237.
[2]譚邦青,曾學(xué)清.壓濾技術(shù)在低溫乙醇法制備人血白蛋白工藝中的應(yīng)用[J].中國生化藥物雜志,2001,22(3):93-94.
[3]劉欣宴.人血白蛋白連續(xù)流壓濾工藝研究[D].山東,山東大學(xué):26-30.
[4] Kobayashi K. Summary of recombinant human serum albumin development[J]. Biologicals,2006,34(1):55-59.
[5]楊曉波,王曉雷,王峰.人血白蛋白提取工藝的對比分析與改進(jìn)方案[J].生命科學(xué)儀器,2010,8(2):44-48.
Process Research on the Filtration Time of Fv in Human Albumin
He Yong1,2,Yang Fan2,Xia Run2,Ding Hong-Bo2,Zhao Yun1*
(1.Sichuan University,Sichuan Chengdu 610065; 2.Chengdu Rongsheng Pharmaceutical Co. Ltd.,Sichuan Chengdu 610041)
During filtering Fv with pressure filtration technique,if the filter time is too long,Fv precipitations with high liquid content and the precipitations freeze-stored to the specified temperature with a long time happen frequently .The study found that those were influenced by the speed of adding buffer in manufacturing Fv and the liquid inlet pressure. In the case of other parameters constant,the speed of adding buffer and the liquid inlet pressure were changed. The statistics with multi-batch of production showed that it could reduce the filtration time,the liquid content of precipitations and the time of precipitations freeze-stored to the specified temperature with the speed of adding buffer 36.0L/h and the liquid inlet pressure 160kPa. It has an important significance to reduce production time and energy consumption.
Human Albumin; Fv; Speed of Adding Buffer; Feed Pressure; Filtration Time
TQ464
A
2096-0387(2016)05-0033-03
何勇(1987-),男,四川成都人,碩士研究生,研究方向:分子生物學(xué)及其生物技術(shù)。
趙云(1965-),四川成都人,博士,研究方向:油科植物的遺傳育種,分子生物學(xué)及其生物技術(shù)。