王耕，張薇，陳安東，王振超

（北京晟泰勃科技有限公司，北京100097）

肉類(lèi)食品的動(dòng)物物種基因鑒別及等溫?cái)U(kuò)增熒光（IAFT）快速檢測(cè)技術(shù)的建立

王耕，張薇，陳安東，王振超

（北京晟泰勃科技有限公司，北京100097）

食品安全是國(guó)家公共安全的重要組成部分，直接影響人類(lèi)健康、公共衛(wèi)生和社會(huì)穩(wěn)定。隨著全球性食品安全事件的持續(xù)發(fā)生，食品安全問(wèn)題日益嚴(yán)峻。因此，建立快速、有效、精確的肉類(lèi)制品物種鑒定技術(shù)和快速檢測(cè)方法已成為一項(xiàng)重大課題?；诖耍鶕?jù)分子生物學(xué)基因擴(kuò)增技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)，集成核酸等溫?cái)U(kuò)增核心技術(shù)，以等溫?cái)U(kuò)增熒光快速檢測(cè)技術(shù)為基礎(chǔ)，收集不同的動(dòng)物物種樣品進(jìn)行基因序列分析，確定靶基因序列，針對(duì)目的片段設(shè)計(jì)特異引物，組合新型DN A聚合酶，在特定溫度條件下復(fù)制和擴(kuò)增，并與傳統(tǒng)PCR技術(shù)比較，篩選、優(yōu)化、建立了靈敏度更高、擴(kuò)增速度更快、特異性更強(qiáng)的肉類(lèi)食品的動(dòng)物物種基因鑒別SGI（Species gene identification）的等溫?cái)U(kuò)增熒光（Isotherm al Am plification Fluorescent Technology，IAFT）快速檢測(cè)技術(shù)，并取得階段性成果，為食品安全的質(zhì)控和監(jiān)管提供必要的技術(shù)支撐，作為肉類(lèi)食品及其制品的現(xiàn)場(chǎng)快速物種特異鑒定的檢測(cè)手段。

肉類(lèi)食品；等溫?cái)U(kuò)增熒光技術(shù)；成分鑒定

隨著歐洲“馬肉風(fēng)波”“蘇丹紅事件”“禽流感”“三鹿奶粉事件”等惡性食品安全事件的發(fā)生，食品安全監(jiān)管的執(zhí)行需要科學(xué)高效的檢測(cè)手段作為依據(jù)。因此，建立一套準(zhǔn)確、有效、現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用的快速檢測(cè)方法和體系，對(duì)維護(hù)人類(lèi)健康和食品安全意義重大。

近年來(lái)，在動(dòng)物肉類(lèi)及其制品貿(mào)易中，不斷出現(xiàn)以次充好、以假亂真的現(xiàn)象，不良商家用低價(jià)值的雞、鴨、老鼠、狐貍?cè)獾燃尤肓又莆秳┟俺渑Ｑ蛉庵\取暴利，嚴(yán)重影響廣大消費(fèi)者的健康和權(quán)益。在國(guó)際市場(chǎng)上，相繼出現(xiàn)以馬肉和驢肉冒充牛肉進(jìn)行銷(xiāo)售的惡劣行為，食品安全問(wèn)題日益嚴(yán)峻[1]。因此，快速、有效、準(zhǔn)確地對(duì)畜禽肉類(lèi)制品進(jìn)行種屬鑒定和快速檢測(cè)方法的建立是一項(xiàng)重要的研究課題。

突發(fā)性食品安全事件，不僅需要準(zhǔn)確有效的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段，更需要建立和完善現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方法，以便在第一時(shí)間和事件現(xiàn)場(chǎng)完成快速檢測(cè)，有效控制危害影響。目前，針對(duì)肉類(lèi)食品動(dòng)物物種基因鑒定的常規(guī)方法主要有常規(guī)PCR[2-4]和定量PCR技術(shù)[5-9]、ELISA技術(shù)[10]、近紅外光譜檢測(cè)[11]和色譜分析、等電聚焦、免疫擴(kuò)散、DNA雜交[12]等。其中，核酸檢測(cè)和抗原抗體檢測(cè)方法靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性較高；理化檢測(cè)法基于化學(xué)指標(biāo)檢測(cè)是一種間接檢測(cè)法，具有一定局限性，需依賴(lài)配套設(shè)備在實(shí)驗(yàn)室操作，流程復(fù)雜，工作量大，對(duì)樣本要求高。通過(guò)本研究建立現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方法和體系，為食品安全的質(zhì)控和監(jiān)管提供必要的技術(shù)支撐和科學(xué)的執(zhí)法依據(jù)有實(shí)用意義。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為超市隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)的豬、牛、羊、雞和鴨肉和常規(guī)加工牛、羊、豬、鴨肉罐頭、雞肉火腿腸畜禽制品，以上述收集的動(dòng)物物種樣品進(jìn)行基因序列分析，確定靶基因序列，作為引物設(shè)計(jì)的依據(jù)。

1.2試驗(yàn)試劑

IAFT反應(yīng)試劑IMM購(gòu)自英國(guó)Optigene公司；核酸快速提取試劑Fast Extraction kit來(lái)自北京晟泰勃科技有限公司；Buffer；Genesig Meat Speciation Kit；去離子無(wú)菌水。

1.3試驗(yàn)儀器

現(xiàn)場(chǎng)核酸快速抽提系統(tǒng)用于現(xiàn)場(chǎng)抽提、制備、混勻，STP Suitsys100；實(shí)時(shí)等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng)Genie；梯度PCR儀，DNA-T Tercyc；常規(guī)采樣、加樣工具。

1.4引物設(shè)計(jì)與合成

以收集不同的動(dòng)物物種樣品基因序列分析結(jié)果，經(jīng)對(duì)各物種核酸序列分析和比對(duì)，選擇各自保守區(qū)的特異性片段，設(shè)計(jì)、優(yōu)化并合成引物，稀釋備用。所設(shè)計(jì)引物為檢測(cè)豬、牛、羊、雞和鴨的引物組，每組包括FIP、BIP、F3、B3。

1.5樣本核酸提取

取樣100mg，破碎，據(jù)核酸快速提取試劑Fast Extraction kit要求抽提取上清備用。

1.6反應(yīng)體系配置

IMM 15μL；引物FIP（40pmol/μL）、BIP（40pmol/ μL）、F3 Primer（5pmol/μL）、B3 Primer（5pmol/ μL），各1μL；樣品4μL。

1.7程序設(shè)定

GenieⅡ程序設(shè)定：61℃，30min。

1.8特異性試驗(yàn)

每次加入5組引物，分批次加入生豬、牛、羊、雞和鴨肉驗(yàn)證引物特異性。

1.9靈敏度試驗(yàn)

在牛肉中摻入豬肉，使豬肉含量分別為10%、1%、0.1%、0.01%和0.001%，各取100mg提取DNA，檢測(cè)豬肉成分。

1.10實(shí)際樣本檢測(cè)

豬、牛、羊、鴨肉罐頭和雞肉火腿腸加工制品，提取DNA后檢測(cè)，與PCR方法對(duì)比。

2　結(jié)果與分析

2.1特異性試驗(yàn)結(jié)果

按1.6中方法在8聯(lián)管中1～5號(hào)孔分別加入豬、牛、羊、雞和鴨肉引物和IMM（見(jiàn)表1），取豬肉據(jù)1.5提取DNA，取上清4μL加入1～5孔，按1.7設(shè)置程序，擴(kuò)增，結(jié)果顯示除1孔有擴(kuò)增以外其他孔均無(wú)擴(kuò)增和特異性溶解溫度，同法驗(yàn)證牛、雞、鴨、羊肉引物和反應(yīng)體系特異性。

表1　各孔對(duì)應(yīng)引物組

圖1　特異性實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增曲線

圖2　各引物對(duì)豬肉特異性實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增曲線

表2　特異性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

圖1和圖2中，加入生豬肉樣本后，只有豬引物對(duì)應(yīng)的1孔出現(xiàn)特異性擴(kuò)增，其余孔均無(wú)擴(kuò)增。表2為試驗(yàn)結(jié)果，擴(kuò)增時(shí)間9min，溶解溫度為89.3℃。同法分別加入牛、羊、雞、鴨肉樣本，除對(duì)應(yīng)孔有擴(kuò)增外，其余孔均無(wú)擴(kuò)增，判定為陰性，驗(yàn)證了各引物組的高度特異性。

2.2靈敏性試驗(yàn)結(jié)果

按1.5提取DNA，檢測(cè)豬肉成分，結(jié)果見(jiàn)圖3，隨著豬肉成份含量降低，擴(kuò)增時(shí)間相應(yīng)變長(zhǎng)，樣本含量和擴(kuò)增時(shí)間存在線性關(guān)系。且當(dāng)豬肉含量0.01%時(shí)，擴(kuò)增時(shí)間小于20min。驗(yàn)證IAFT法高擴(kuò)增效率。

圖3　靈敏性試驗(yàn)擴(kuò)增結(jié)果

2.3實(shí)際樣本鑒定結(jié)果

加工牛、羊、豬、鴨肉罐頭、雞肉火腿腸，按1.5提取DNA，每組樣本使用IAFT法和PCR法做平行對(duì)比，驗(yàn)證樣品中是否含豬、牛、羊、雞、鴨肉成分。

2.3.1肉類(lèi)食品動(dòng)物物種等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)技術(shù)建立

在牛肉罐頭中未檢出牛肉成分，僅有豬肉和雞肉（見(jiàn)圖4和表3）；羊、豬、鴨的罐頭中分別只檢出羊肉成分、豬肉成分、鴨肉成分（分別見(jiàn)圖5～7和表4～6）；檢測(cè)的雞肉火腿腸中，只檢出雞肉成分（見(jiàn)圖8和表7）。

圖4　牛肉罐頭檢測(cè)擴(kuò)增圖

表3　牛肉罐頭檢測(cè)結(jié)果

圖5　羊肉罐頭檢測(cè)擴(kuò)增圖

表4　羊肉罐頭檢測(cè)結(jié)果

圖6　豬肉罐頭檢測(cè)擴(kuò)增圖

表5　豬肉罐頭檢測(cè)結(jié)果

圖7　鴨肉罐頭檢測(cè)擴(kuò)增圖

表6　鴨肉罐頭檢測(cè)結(jié)果

圖8　雞肉火腿腸檢測(cè)擴(kuò)增圖

表7　雞肉火腿腸檢測(cè)結(jié)果

2.3.2梯度PCR電泳結(jié)果

圖9～13為PCR檢測(cè)加工牛、羊、豬、鴨肉罐頭、雞肉火腿腸電泳圖。表8數(shù)據(jù)驗(yàn)證了IAFT法和PCR法結(jié)果一致。

圖9　牛肉罐頭PCR檢測(cè)結(jié)果

圖10　羊肉罐頭檢測(cè)電泳圖

圖11　豬肉罐頭檢測(cè)電泳圖

圖12　鴨肉罐頭PCR檢測(cè)結(jié)果

圖13　鴨肉火腿腸PCR檢測(cè)結(jié)果

表8　PCR檢測(cè)結(jié)果

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)不同動(dòng)物物種基因分析、比對(duì)、篩選確定靶基因序列的基礎(chǔ)上，經(jīng)優(yōu)化樣品前處理、引物設(shè)計(jì)，確立實(shí)驗(yàn)程序和規(guī)范，完成特異性試驗(yàn)、敏感性試驗(yàn)、實(shí)際樣品鑒定并與相關(guān)常規(guī)方法比較，驗(yàn)證和建立了肉類(lèi)食品的動(dòng)物物種基因鑒別的快速檢測(cè)技術(shù)。

3　討論

近年來(lái)出現(xiàn)的各種核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[13，14]，對(duì)目的片段設(shè)計(jì)特異引物，使用新型DNA聚合酶在等溫條件下復(fù)制和擴(kuò)增，與傳統(tǒng)PCR技術(shù)比較，更加靈敏、快速、特異，有多種結(jié)果分析和判定方法，如濁度法、鈣黃綠素法、電泳法、實(shí)時(shí)熒光法。其中，濁度和鈣黃綠素法是基于副產(chǎn)物的間接判定方法，準(zhǔn)確性和特異性欠佳。電泳判定依賴(lài)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，易交叉污染，假陽(yáng)性率高。

本研究以等溫?cái)U(kuò)增熒光法（IAFT）為基礎(chǔ)建立了肉類(lèi)食品的動(dòng)物物種基因鑒定體系，與傳統(tǒng)PCR方法進(jìn)行對(duì)比，其結(jié)果符合率達(dá)到100%。實(shí)驗(yàn)和應(yīng)用證明，IAFT是一種快速準(zhǔn)確的核酸檢測(cè)技術(shù)，集成并融合了核酸等溫?cái)U(kuò)增和實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)[15]，通過(guò)對(duì)產(chǎn)物做溶解曲線分析，對(duì)核酸進(jìn)行快速定性或定量。所需設(shè)備簡(jiǎn)單、對(duì)樣本質(zhì)量要求較低、擴(kuò)增和結(jié)果檢測(cè)可同時(shí)完成，是樣品采集、快速制備、實(shí)時(shí)檢測(cè)、結(jié)果判定的現(xiàn)場(chǎng)核酸快速檢測(cè)配套技術(shù)體系，經(jīng)驗(yàn)證是一種準(zhǔn)確、可靠、先進(jìn)的分子生物學(xué)基因快速檢測(cè)技術(shù)。融合了定量PCR的實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù)和樣本快速制備和抽提技術(shù)，適合于物種基因檢測(cè)、食品衛(wèi)生安全、進(jìn)出境口岸檢疫、疫情快速防控等領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)室或現(xiàn)場(chǎng)核酸快速檢測(cè)。

4　結(jié)論

（1）集成核酸等溫?cái)U(kuò)增核心技術(shù)，以等溫?cái)U(kuò)增熒光快速檢測(cè)技術(shù)為基礎(chǔ)建立了肉類(lèi)食品的動(dòng)物基因鑒別及等溫?cái)U(kuò)增熒光（IAFT）快速檢測(cè)技術(shù)體系。

（2）經(jīng)分析不同物種基因，確立靶基因序列并完成了引物設(shè)計(jì)，證明以等溫?cái)U(kuò)增熒光技術(shù)進(jìn)行肉類(lèi)食品的動(dòng)物基因鑒別，對(duì)于生物物種鑒別具有廣闊的應(yīng)用前景。

（3）經(jīng)與傳統(tǒng)的基因擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行比較和評(píng)價(jià)，表明等溫?cái)U(kuò)增熒光快速檢測(cè)技術(shù)不僅可以替代常規(guī)PCR法，且更為特異、敏感、精確、快速和便捷，適合于任何條件下的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

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Identification of Animal Species in Meat Food and Establishment of Rapid Detection Technology for Isothermal Amplification of Fluorescence (IAFT)

Wang Geng,Zhang Wei,Chen An-dong,Wang Zhen-chao
(Beijing Suntrap Science & Technology Co. Ltd.,Beijing 100097)

Food safety is an important part of the national public security,which directly affects human health,public health and social stability. With the global food safety incidents continue to occur,the food safety problem is increasingly severe. Therefore,the establishment of rapid,effective and accurate meat products species identification technology and rapid detection method has become a major issue. Based on this,according to the development trend of molecular biology gene amplification technology,integrated nucleic acid isothermal amplification core technology,based on the isothermal amplification fluorescence rapid detection technology,different animal species samples were collected for gene sequence analysis,the target gene sequence was identified,specific primers were designed for the target fragment,and the new DNA polymerase was combined to replicate and amplify under specific temperature conditions,and compared with the traditional PCR technology,screening,optimization and establishment isothermal amplification fluorescent (Isothermal Amplification Fluorescent Technology,IAFT) rapid detection technology that an animal species gene identification technology of meat products with higher sensitivity,faster amplification and stronger specificity SGI,and achieved initial results,to provide necessary technical support for the quality control and supervision of food safety,as a means of detection field of meat and its products for rapid identification of specific species.

Meat food; Isothermal amplification fluorescence technique; Component identification

TS251.7

A

2096-0387（2016）05-0021-06

王耕(1986-),男,陜西西安人，本科,工程師,研究方向:食品安全快速檢。