郭文靖 朱安娜 吳英松

·綜述·

非小細胞肺癌組織中ALK、ROS1、RET融合基因檢測方法的比較

郭文靖1朱安娜1吳英松2★

非小細胞肺癌在惡性腫瘤中的發(fā)病率和死亡率中高居榜首，是中國首要的一個公共衛(wèi)生問題。近年出現(xiàn)的分子靶向藥能顯著改善非小細胞肺癌患者的生存質量，因此對患者突變基因的準確檢測顯得尤為重要。目前臨床上檢測非小細胞肺癌患者ALK、ROS1、RET融合基因的主要方法有熒光原位雜交、免疫組織化學、逆轉錄聚合酶鏈反應以及新興起的下一代測序，但這4種方法優(yōu)缺點各異。本文通過比較這幾種常見的檢測方法，為融合基因檢測方法的選擇提供參考。

非小細胞肺癌；ALK/ROS1/RET融合基因；熒光原位雜交；下一代測序

肺癌是當今社會對人群健康和生命威脅最常見的惡性腫瘤之一［1］，分別占男女性惡性腫瘤中的第一位和第二位［2］。在中國，肺癌發(fā)病率和死亡率遠高于西方國家，且處于持續(xù)上升狀態(tài)。統(tǒng)計顯示2015年新增肺癌患者達22萬，死亡人數(shù)高達15萬［2］。肺癌根據(jù)免疫組化主要分為2大類：非小細胞肺癌（non?small cell lung cancer，NSCLC）和小細胞肺癌，其中NSCLC約占85％［3?4］。近幾年，肺癌患者中除了存在常見的腫瘤驅動突變基因EGFR、KRAS、BRAF外，還檢測到存在間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）［5］、c?ros原癌基因1酪氨酸激酶（c?ros oncogene 1 receptor tyrosine kinase，ROS1）、RET原癌基因（RET proto?onco?gene，RET）基因融合的情況。

目前，主要的治療方式為手術、化療、放療。但是隨著對腫瘤發(fā)病機制和分子生物學的不斷深入研究，針對常見肺癌融合基因的靶向藥以特異性高，不良反應輕而逐漸進入人們視野。存在ALK、ROS1融合基因的肺癌患者在臨床中使用克唑替尼（crizotinib）的療效顯著［6?8］。此外，以小分子酪氨酸激酶抑制劑為代表的靶向藥已逐步應用于臨床試驗，其中卡博替尼（cabozantinib）治療存在RET融合陽性的NSCLC的實驗（NCT01639508）已經進入臨床試驗Ⅱ期［9］，靶向藥的出現(xiàn)推動了NSCLC治療的發(fā)展。因此，對肺癌患者融合基因的檢測，提高患者的生存率具有十分重要的意義。目前臨床上檢測非小細胞肺癌患者ALK、ROS1、RET融合基因的主要方法有熒光原位雜交、免疫組織化學、逆轉錄聚合酶鏈反應以及新興起的下一代測序，但這4種方法優(yōu)缺點各異。本文通過比較這幾種常見的檢測方法，為融合基因檢測方法的選擇提供參考。

1 ALK、ROS1、RET基因融合及臨床表現(xiàn)特征

ALK是一種跨膜受體的酪氨酸激酶，屬于胰島素受體家族。ALK主要與棘皮動物微管相關蛋白（echinoderm m icrotubule associated protein?like 4，EML4）發(fā)生融合，EML4結構中的N末端堿基區(qū)與腫瘤的形成有關。EML4?ALK融合是因為2號染色體短臂發(fā)生倒位，導致EML4的N?末端融合到胞內ALK激酶區(qū)域［10］。融合后的EML4啟動子可以驅動EML4?ALK轉錄活化表達融合蛋白，ALK活化會導致細胞惡性轉化。已發(fā)現(xiàn)的融合方式有10多種，其中以V1（EML4的13外顯子斷裂）和V3變體（EML4的6外顯子斷裂）最常見［11］，常見融合類型見表1。ALK陽性NSCLC是肺癌的一個特定分子亞型，常見于腺癌中，約占全部NSCLC的5％［12］，多見于年輕、不吸煙或少量吸煙的患者［13］。臨床上多用特異性激酶抑制劑治療EML4?ALK融合患者，能顯著延長生存期，中國國家食品藥品監(jiān)督管理總局（China Food and Drug Adm inis?tration，CFDA）已批準克唑替尼用于治療ALK融合基因陽性患者。

ROS1是一種原癌基因，位于6號染色體上，屬于胰島素受體家族的一種跨膜酪氨酸激酶，其細胞外區(qū)域由6個重復序列組成，與纖維連接蛋白具有高度同源性，而纖維連接蛋白在細胞黏附中伴有重要作用。在NSCLC中ROS1基因與SLC34A2、CD74發(fā)生融合占了50％［14］，主要是由于6號染色體易位造成的，常見融合見表2。ROS1基因發(fā)生重排時丟失細胞外區(qū)域，保留跨膜和細胞內酪氨酸激酶區(qū)域，主要發(fā)生在ROS1基因的32～36外顯子。ROS1融合基因在NSCLC中發(fā)生率約為1％～2％［15］，和ALK相似，常見于年輕、不吸煙或少量吸煙的腺癌患者中［16］。

RET是一種酪氨酸激酶受體，由半胱氨酸組成的細胞外區(qū)、跨膜區(qū)、催化酪氨酸激酶作用的細胞內區(qū)組成，位于10號染色體，DNA全長為60 kb，含有21個外顯子，RET參與細胞增殖、神經傳導、細胞遷移和細胞分化。由于10號染色體發(fā)生臂間倒位［17］，導致和KIF5B發(fā)生基因融合，常見與RET融合基因見表3。KIF5B?RET融合蛋白包含馬達結構域和KIF5B的卷曲螺旋結構域，通過卷曲螺旋結構域的二聚化作用，該融合蛋白的RET酪氨酸激酶活性可異?；罨?，從而促進肺癌的發(fā)生。KIF5B?RET融合基因在NSCLC中發(fā)生率約為1％～2％［17］，同樣常見于不吸煙的肺腺癌患者中［18］。臨床上常用小分子酪氨酸激酶抑制劑進行治療，有臨床報告顯示肺癌中攜帶RET融合的患者使用卡博替尼、vandetanib（凡德他尼）有一定療效。

2 檢測ALK、ROS1、RET基因融合的方法及比較

針對ALK、ROS1、RET基因融合的患者，臨床常用的檢測方法有熒光原位雜交（fuorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）、免疫組織化學（immuno?histochem istry，IHC）、逆轉錄聚合酶鏈反應（re?verse transcription?polymerase chain reaction，RT?PCR）以及新興起的下一代測序（next?generation sequencing，NGS）。

2.1 熒光原位雜交（FISH）

FISH的基本原理是將DNA（或RNA）探針用特殊的核苷酸分子標記，然后將探針按照堿基互補原則特異性結合待檢測的單鏈核苷酸，從而使探針雜交到染色體或DNA纖維切片上，再用與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體與探針分子特異性結合來檢測DNA序列在染色體或DNA纖維切片上的定性、定位、相對定量分析。針對檢測基因是否融合，可以通過在斷裂位置兩端設置不同顏色的

探針，在發(fā)生斷裂融合的細胞中，2種顏色的探針相互分離，而在沒有發(fā)生斷裂融合的細胞則表現(xiàn)為2種顏色相互重疊或靠近。

表1 常見與ALK融合的基因及外顯子位置Table 1 Common genes fusew ith ALK and the location of the exons

表2 常見與ROS1融合的基因及外顯子位置Table 2 Common genes fusew ith ROS1 and the location of the exons

表3 常見與RET融合的基因及外顯子位置Table 3 Common genes fusew ith RET and the location of the exons

FISH是目前檢測肺癌融合基因的“金標準”，確定適合的抗體快速檢測ALK表達蛋白是否發(fā)生融合是初步篩查ALK重排的關鍵［19］。目前常見的商品化試劑盒有Cytocell的ROS1 Dual Color Break Apart Probe，德國ZytoVision的產品Zyto?Light?SPEC RET Dual Color Break Apart Probe。經CFDA批準的試劑盒有益善生物技術股份有限公司的ALK基因重排檢測試劑盒。雖然FISH專業(yè)性強，但在一次實驗中不能區(qū)分不同類型的融合配體，且無法檢測RNA編碼和內含子異常的情況。在結果方面需資深人員進行判斷，有不少患者用FISH檢測結果為陰性，但在藥物治療方面獲得良好的療效［20］。由于FISH是在細胞層面上進行病理學的分析，但晚期NSCLC患者只能提供極小塊的活檢組織，這導致難以保證有足夠細胞進行陽性結果的判讀。

2.2 免疫組織化學（IHC）

免疫組織化學根據(jù)抗體和抗原之間的結合具有高度的特異性特征，將已知抗體標上熒光素，以此作為探針檢查細胞或組織內的相應抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當抗原抗體復合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后會發(fā)出一定波長的熒光，從而可以確定組織中的抗原定位或定量。目前商品化的ALK IHC染色的抗體主要有D5F3、5A4［21］，常規(guī)的判斷方法如下：腫瘤細胞無任何染色，陰性；腫瘤細胞呈淺棕色，且沒有任何背景染色，弱陽性；腫瘤細胞呈棕色，陽性；腫瘤細胞呈深棕色，強

陽性［22］。經美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Adm inistration，F(xiàn)DA）批準上市的試劑盒VENTANA ALK（D5F3）CDx Assay采用了兔單克隆抗體檢測ALK基因融合。IHC簡便易行，價格比FISH便宜，操作方法成熟［23］，因而成為臨床診斷常用的篩查方法，推薦條件缺乏的實驗室可采用此方法進行小樣本活檢組織的檢測，但由于IHC陽性判讀標準不統(tǒng)一，不能敏感檢測出基因蛋白，此方法的準確性等因素仍在評價中［19］，所以對于陽性的樣本必須經過FISH、RT?PCR或NGS中的至少其中一種方法進行確認。

2.3 逆轉錄聚合酶鏈反應（RT?PCR）

逆轉錄聚合酶鏈反應是先將RNA反轉錄為cDNA，然后以cDNA為模板擴增合成目的片段，結合熒光標記的方法，在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法，即每循環(huán)一次收集一個數(shù)據(jù)，建立實時擴增曲線，得到Ct值，從而確定起始模板的拷貝數(shù)。CFDA已認證廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司的人類EML4?ALK融合基因檢測試劑盒，但此試劑盒用熒光PCR法只能檢測少數(shù)幾種已知與ALK融合的基因類型，這嚴重影響了RT?PCR法在臨床上檢測的應用。RT?PCR方法是比FISH、IHC更為敏感的一種檢測方法［24］，但此方法對組織RNA質量要求高，需要足夠大的引物組以涵蓋所潛在的所有融合基因，而且可能存在大量潛在的基因亞型無法檢測［25］。由于PCR可能導致非特異性擴增造成假陰性的結果，建議陽性樣本再通過直接測序法進行驗證［26］。

2.4 下一代測序（NGS）

NGS是一種能對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行大規(guī)模平行測序的技術。傳統(tǒng)獲取生物核苷酸序列的方法主要依靠直接測序法，即Sanger測序法，其利用雙脫氧核苷酸末端終止法的原理完成了對人類基因組序列的測定，但Sanger測序法無法檢測移位或基因拷貝數(shù)變化等基因突變類型，難以完成沒有明確致病基因位點及大樣本突變位點的篩查，且存在高成本的問題。隨著千元測序人類基因組的提出，催生了以高通量、信息量大、靈敏度高、低成本著稱的NGS技術［27］。

NGS各大平臺在通量、測序長度、覆蓋度、運行時間和測序原理上各異。目前有illum ina的So?lexa、ABI的Solid和Life Technologies的Ion Tor? rent平臺。NGS技術主要用于3大方面：針對疾病的靶向基因測序，全外顯子測序和全基因組測序［28］。NGS技術主要流程包括患者樣本的采集，DNA/RNA的提取，基于多重PCR方法的文庫構建，目的片段的擴增及富集，上機測序及數(shù)據(jù)分析。當FISH和IHC結果異常時，NGS更被傾向用于進行最終確認［29］。隨著認識到血液中存在循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA），通過NGS進行液體活檢［30］，無創(chuàng)篩查成為了熱門研究方向，此不僅有利于腫瘤的早期診斷，還可以動態(tài)觀察腫瘤的發(fā)生發(fā)展，及時調整治療方法。目前ThermoFisher的產品oncom ine fusion panel已獲得CE?IVD認證，同時已商品化的試劑盒有ArcherDx的fusionplexTMALK、RET、ROS1 V2 panel。這2款試劑盒都可同時檢測ALK、ROS1、RET 3個融合基因。NGS在檢測方面所需RNA量少至10 ng，在一次實驗中能靶向獲取目的片段進行全部融合基因的分析，且準確度高；在數(shù)據(jù)分析方面，NGS通量高，信息獲取量大，可以明確各融合基因的配體類型［31］，分析自動化，并可以通過優(yōu)化算法［32］，減少人為判斷錯誤的情況，但是腫瘤異質性的問題會影響結果的準確性。4種方法相比之下NGS更適合大規(guī)模普查NSCLC的融合基因。

3 展望

肺癌的發(fā)生發(fā)展涉及到基因、環(huán)境，是一個極其復雜的過程。所幸目前的小分子酪氨酸激酶抑制劑對有ALK、ROS1、RET融合基因的NSCLC患者存在較好的效果，但是為了更大程度延長患者生存期，分子靶向治療如何結合手術，化療，放療等治療方法是一個需要臨床試驗不斷驗證的過程。在常見驅動突變基因EGFR、KRAS、BRAF等野生型的非小細胞肺癌患者中，尋找一種高敏感、高特異性檢測ALK、ROS1、RET融合基因的方法顯得十分必要。NGS作為一種新興起的檢測技術，可同時對相應突變區(qū)域進行高深度測序，利用生物信息學最終確認融合變異類型并不斷發(fā)現(xiàn)新的融合分子類型，從而可以用于臨床在最佳治療時期選擇相應的分子靶向藥物，同時規(guī)避容易耐受的藥物，但相對傳統(tǒng)在原位進行檢測的方法，NGS仍需多中心、大規(guī)模的臨床驗證。若研究成果能用于臨床檢測，這對NSCLC患者的早期診斷、治療及預后具有極其重要的價值。

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Com parison of detection methods of ALK/ROS1/RET fusion gene in non?small cell lung cancer tissue

GUOWenjing1，ZHU Anna1，WU Yingsong2★
(1.Guangzhou Darui Biotechnology Co.,Ltd.,Guangzhou,Guangdong,China,510665;2.School of Labratory Medicine and Biotechnology,Southern MedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong,China,510515)

Themorbidity andmortality of non?small lung cancer is the top rate ofmalignant tumor. And it’s one of the important public health problems in China.In recent years,molecular targeted drugs can significantly improve the quality of life of patientsw ith non?small cell lung cancer.Therefore,it’s important to detect mutation accurately.Nowadays there are fluorescence in situ hybridization,immunohistochemistry, reverse transcription?polymerase chain reaction aswell as next?generation sequencing to detect non?small lung cancer.This article compares the commonmethodsused in clinical,in order to provide

for the choice of fusion gene detection.

Non?small cell lung cancer;ALK/ROS1/RET fusion gene;Fluorescence in situ hybridization;Nextgeneration sequencing

廣東省科技計劃項目應用型專項資金（2015B020233009）

1.廣州市達瑞生物技術股份有限公司，廣東，廣州510665 2.南方醫(yī)科大學檢驗與生物技術學院，廣東，廣州510515

★通訊作者：吳英松，E?mail：wg@smu.edu.cn