孫玉婷 范冬梅 葉倩平 楊琳艷 梁志坤 楊學習★

·論著·

采用Amplicon文庫構建法對地中海貧血的基因檢測

孫玉婷1范冬梅2葉倩平1楊琳艷1梁志坤1楊學習2★

目的進一步完善現有地中海貧血的檢測方法并且建立一種新的基于高通量測序的基因診斷方法，研究α/β地中海貧血基因的突變類型及分布情況。方法采用Amplicon文庫構建法，基于高通量測序平臺，對219例地中海貧血患者全血樣本進行上機測序與數據分析。結果在219例地中海貧血患者中，共計檢測出14種突變類型，包括CD122、CD125、CD142 3種非缺失型α?地貧突變及IVS?II?654、CD41?42、CD17等11種常見β?地貧突變型別。此外，通過生物信息學軟件作圖分析，篩查出??SEA、?α3.7、?α4.23種缺失型α?地貧。結論本研究進一步完善了基于高通量測序的基因診斷方法，建立了一套Amplicon文庫構建法，能準確、有效地用于診斷α/β地中海貧血基因的缺失與突變類型，對人群篩查，優(yōu)生優(yōu)育的遺傳咨詢，防止該病重癥患兒的出生等具有重要意義。

地中海貧血；基因檢測；Amplicon文庫構建；β?突變；α?缺失

地中海貧血（thalassem ia，簡稱“地貧”）是一種世界范圍內常見的單基因遺傳性血液疾病，由珠蛋白基因的缺失或突變所導致珠蛋白肽鏈合成障礙，造成血紅蛋白中的α?鏈珠蛋白與β?鏈珠蛋白合成比例失衡、紅細胞壽命減短的一種慢性進行性溶血性貧血［1］。

臨床上主要分為α?鏈珠蛋白地中海貧血及β?鏈珠蛋白地中海貧血2大類，其對應的基因分別位于16號染色體短臂（16p13.3）與11號染色體短臂（11p1.2）［2］。

在我國，長江以南的大部分省區(qū)均為地貧的高發(fā)區(qū)。人群中α?地貧及β?地貧基因攜帶率分別為2.64％，2％～3％［3?4］。其中α?地貧以廣西、廣東、江西、四川等地區(qū)多見，發(fā)病率分別高達14.95％、4.11％、2.60％、1.92％［3］。β?地貧以廣西地區(qū)為常見，發(fā)病率達至6.43％［5］，而個別地區(qū)如香港、云南也有高達6％［4］。

由于地貧仍缺乏有效治療方法，通過人群篩查實施產前診斷以阻止重癥患兒出生及進行新生兒篩查以早期診斷、早期治療是目前最有效的預防措施?，F階段血液學表型分析是地貧基因攜帶者篩查的指標，主要包括紅細胞指標［如紅細胞（red blood cell，RBC）計數、血紅蛋白（hemoglobin，HGB）、紅細胞比容（hematocrit，HCT）、紅細胞平均體積（mean corpuscular volume，MCV）和平均紅細胞血紅蛋白含量（mean corpuscular hemoglobin con?centration，MCH）等］的測定和血紅蛋白分析（包括異常血紅蛋白檢測、HbA2和HbF定量測定），但此方法存在其他不能排除的原因，如缺鐵性貧血（小細胞低色素癥）和某些異常Hb（HbA2升高），也不能發(fā)現靜止型地中海貧血（如?α3.7/、?α4.2/和αWSα/雜合子等），故地貧基因攜帶者的確診仍有賴于基于DNA分析的基因分型。PCR技術是目前用于分子診斷的基礎方法，但此技術操作繁瑣、過程耗時，對操作者技術水平要求高，難以進行大批樣本的篩查。本研究建立了一套Amplicon文庫構建法，通過高通量測序平臺對地貧基因進行篩查與診斷，旨在為地貧的快速診斷提供一種具有參考價值的，靈敏、簡便的基因檢測方法。

1 材料與方法

1.1 研究對象

2014年7月至2015年7月收集來自福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院及中山大學附屬第一醫(yī)院體檢、產檢及就診的地貧篩查病例，對確診的共計219例地貧患者外周全血樣本進行本研究方法的基因檢測。其中女性125名，男性94名，年齡在0～86歲，平均年齡為26歲。

1.2 儀器與試劑

干式恒溫器（杭州奧盛儀器有限公司）；Veri?ti?96?Well Thermal Cycler（Life Technologies公司，美國）；Qubit?3.0熒光計（Life Technologies公司，美國）；DA8600測序儀（中山大學達安基因股份有限公司）；DNA提取試劑盒：DNeasy Blood ＆amp;Tissue Kit（50）（Qiagen公司，德國）；文庫構建試劑盒：Ion Plus Fragment Library Kit與接頭試劑盒：Ion Plus Fragment Library Adapters（Life Tech?nologies公司，美國）；PCR試劑：Hi?Fi Hotstart Ready M ix（KAPA BIOSYSTEMS公司，美國）；E?Gel預制瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)：E?Gel iBase and E?Gel Safe Imager Combo Kit（Invitrogen公司，美國）。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取

按照DNA提取試劑盒說明書要求提取基因組DNA，得到的DNA溶液要求OD260/280為1.6～1.8之間。DNA溶液可置于（?20±5）℃保存。

1.3.2 文庫構建和定量

采用文庫構建試劑盒進行文庫構建。關鍵步驟包括對提取的DNA分別進行α/β?地貧PCR，將PCR產物混合后加入打斷試劑置于37℃孵育，再加入stop buffer終止反應，接著加入切口修復酶對DNA片段進行末端修復。使用接頭試劑盒，加入P1接頭與特異性接頭進行連接反應，然后用DNA純化磁珠進行純化。

采用E?Gel預制瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)選擇性回收330 bp大小的目的片段，然后用PCR試劑進行擴增，最后用DNA純化磁珠對產物進行純化得到可用于測序的文庫DNA。

使用Qubit?3.0熒光計進行文庫定量。文庫根據Qubit濃度等量混合，再用Qubit?3.0熒光計進行定量，根據以下公式把混合文庫稀釋到100 pM：稀釋倍數=（文庫濃度×107）／（660×330）。

1.3.3 模板制備

乳液PCR將文庫DNA包被在一個油滴分子里面進行擴增，擴增前一個油滴分子含有一個

DNA分子，擴增結束后油滴分子破裂，油滴里面的ISP磁珠便攜帶有成千上萬個文庫DNA。

1.3.4 上機測序

通過乳液PCR擴增的文庫模板，經過富集回收，上樣至高通量測序芯片。芯片微孔中固定的DNA鏈每延伸一個堿基，就會釋放一個質子，導致局部pH變化，離子傳感器檢測pH變化，并將化學信號轉換成數字信號，從而可以實時判讀堿基，最終獲得每個DNA片段的堿基序列。

1.3.5 基因型檢測

選擇Coverage Analysis和VariantCaller插件，選擇參考序列hg19和目標區(qū)域chr16：215000?236000與chr11：5246400?5248600作為參考分析該區(qū)域的覆蓋度和測序深度及突變情況。Cover?age Analysis插件運行結束后會出現一個覆蓋率（On Target Rare）和測序深度（Sequencing Depth）的文件，樣品覆蓋率在95％以上，DNA測序深度在500*以上認為測序結果可信；Variant Caller插件運行結束，每個樣品都生成一個即.xls格式的位點突變信息表格，下載下來，看是否檢測出hotspot位點，記錄每個樣品的突變情況。對于有突變的樣本，可根據表格中的突變頻率（Fre?quency）判斷為純合突變還是雜合突變，Frequen?cy值在40％～60％即為雜合突變，90％～100％則是純合突變。

運用生物信息學軟件分析針對chr16：215000?236000區(qū)域每個位點覆蓋度情況，作圖分析缺失型α?地貧的型別。若在chr16：221913?221936和chr16：223631?223612范圍內有檢測峰，且其他位置沒有檢測峰，則是α?地貧正常；若在chr16：219303?219327和chr16：225173?225148范圍內有檢測峰，且其他位置沒有檢測峰，則是4.2純合缺失型；若在chr16：221913?221936和chr16：227726?227702范圍內有檢測峰，且其他位置沒有檢測峰，則是3.7純合缺失型；若在chr16：235908?235888和chr16：215284?215308范圍內有檢測峰，且其他位置沒有檢測峰，則是Sea純合缺失型。若除了缺失型對應位置有檢測峰，在chr16：221913?221936和chr16：223631?223612范圍內也有檢測峰，則是雜合缺失型。

將上述1.3.1中對219例地貧患者外周全血樣本提取所得的DNA另外進行一代測序（金標準測序），以進一步驗證本實驗結果的準確性。

2 結果

表1 219例α/β?地貧基因突變類型和構成比Table 1 Mutation typesofα/β?thalassem ia gene and composition ratio in 219 cases

2.1 α/β?地貧基因的檢測結果

219例地貧患者全血樣本中，共檢出14種突變基因類型，包括CD122、CD125及CD142 3種α?地貧突變，11種β?地貧突變，分別為IVS?II?654、CD41?42、CD17、?28、CD27/28、CD71?72、CD14?15、CD26、Initiation codon、IVS?I?1、CD43。其中，突變類型為IVS?II?654雜合共檢出39例，比例最高，占17.81％，其次為CD41?42雜合、CD122雜合、CD17雜合、CD142雜合，所占比例依次為10.50％、8.68％、5.94％、5.48％，具體信息見表1。運用生物信息學軟件分析，共檢出5種缺失型α?地貧。其

中，缺失類型為??SEA雜合所占比例最高，為22.83％，共檢出50例，?α3.7雜合缺失及??SEA/?α3.7復合缺失，分別檢出10例、6例，所占比例為4.57％、2.74％，具體信息見表2。另外，檢出12種復合型突變與缺失類型，具體信息見表3。經金標準測序驗證，219例地貧患者DNA樣本的檢測結果，其α/ β?地貧基因缺失或突變的型別與本研究所檢出各例患者的地貧基因突變類型一一對應，符合率達100％。

表2 219例α?地貧基因缺失類型和構成比Table 2 Deletion typesofα?thalassemia gene and composition ratio in 219 cases

表3 219例α/β?地貧基因復合型突變/缺失類型和構成比Table 3 Compoundmutation/deletion types ofα/β thalassemia gene and composition ratio in 219 casesz

2.2 α?地貧缺失類型的作圖分析

運用生物信息學軟件分析針對chr16：215000～236000區(qū)域每個位點的覆蓋度，并作圖分析缺失型α?地貧的型別，在219例地貧患者全血樣本中檢出5種缺失型α?地貧，依次包括3.7（純合/雜合）缺失、4.2雜合缺失、Sea（純合/雜合）缺失、3.7＆amp;Sea雜合缺失和4.2＆amp;Sea雜合缺失，具體峰圖見圖1～8。

3 討論

地貧是我國常見的一種遺傳性血紅蛋白疾病，由珠蛋白基因的缺失或突變引起珠蛋白肽鏈合成障礙所致。常見類型有α?地貧與β?地貧2種。

基因缺失是α?地貧最常見的突變類型。目前已鑒定的α?地貧缺失類型至少有36種，東南亞缺失型（??SEA）、右側缺失（?α3.7）和左側缺失（?α4.2）是我國最常見的3種缺失類型［6］，國內Barts水腫胎兒的基因型主要為（??SEA/??SEA）［7］。已發(fā)現非缺失型α?地貧基因點突變類型至少有68多種［8］。

β?地貧絕大多數由β?珠蛋白基因不同類型的點突變所致，少數是由基因缺失所引起［7］。目前，全世界已發(fā)現200多種β?珠蛋白基因的突變類型，在我國已報道有49種，其中南方地區(qū)報道的有47種［9?10］。β?地貧的基因突變有著明顯的地域性或群體特異性，在我國最常見的是CD41?42、CD17、?28、CD26、IVS?II?654和CD71?72（+A），此6種突變類型占全部突變類型的95％以上［11］。

本研究采用Amplicon文庫構建法，通過高通量測序技術對219例地貧患者進行基因檢測。共

檢出14種α/β?地貧突變基因類型，5種α?地貧缺失型基因類型，12種復合型α/β?地貧突變/缺失基因類型，且經金標準測序驗證，檢測結果均符合對應突變型別。其中，IVS?II?654雜合共檢出39例，所占比例為17.81％，其次為CD41?42雜合、CD122雜合、CD17雜合、CD142雜合，所占比例依次為10.50％、8.68％、5.94％、5.48％。與資料所顯示的華南地區(qū)以CD41?42最常見及廣東、福建、湖北、香港和臺灣等地以IVS?II?654、CD41?42最為多見符合［4］。

運用生物信息學軟件分析，檢測出??SEA雜合共50例（22.83％），?α3.7雜合10例（4.57％）及??SEA/?α3.7復合缺失6例（2.74％）。與文獻所報道的我國南方地區(qū)最常見的α?地貧基因型為??SEA，其次是?α3.7、?α4.2符合，其基因突變趨勢也相似［12］。

隨著分子生物學的日漸成熟及基因診斷的廣泛應用，當前對α?地貧缺失類型檢測的方法主要有：Southern雜交、實時熒光定量PCR結合溶解曲線分析（DC）和PCR體外基因擴增等［3，6，8，13］。用于β?地貧點突變基因診斷的技術主要有：PCR?反向斑點雜交法（PCR?flow though reverse dot blot，PCR?RDB）、限制性片段長度多態(tài)性分析（restric?tion fragment length polymorphism，RFLP）、高分辨溶解曲線分析系統(tǒng)、基因芯片法等［11，14?15］。目前臨床實驗室普遍采用跨越斷裂點聚合酶鏈反應（Gap?PCR）技術檢測α?地貧缺失類型。其基本原理是設計在α?鏈珠蛋白突變基因斷裂點兩側的引物在正常情況下由于擴增區(qū)域太長而無法擴增，而缺失型基因擴增區(qū)域因縮短而能擴增。該方法簡單實用［14］，能很好地區(qū)分正常、雜合子和純合子［6］，但由于α?鏈珠蛋白基因的高度同源和高G+C含量，使得目的產物難以擴增。另外，由于PCR技術本身的高敏感性，樣品容易受污染而得到假性結果［3］。非缺失型α?地貧突變和β?地貧點突變的常規(guī)檢測方法為PCR?反向斑點雜交法（PCR?RDB）技術。其基本條件是固定在膜上的多種特異性探針于同一條件下與PCR產物進行雜交。該方法可同時檢測幾種點突變，具有快速、簡便、靈敏度高和特異性強的特點，但操作繁瑣、難以進行大批量檢測［11］，且易受各種試驗因素、條件的影響，其穩(wěn)定性和重復性有待提高［14］。

本研究采用Amplicon文庫構建法，基于高通量測序平臺技術進行地貧基因診斷，相較于傳統(tǒng)常規(guī)運用的血液學表型分析，能有效避免后者所存在的漏診、誤診現象。對比于目前普遍使用的基因檢測方法（如Gap?PCR和PCR?RDB等），其共同點為同樣涉及一個分別針對α/β?鏈珠蛋白基因進行PCR體外擴增的過程，其最大的不同之處是關于α/β?地貧基因缺失及突變的檢測，前者能夠同時完成，且保證準確率，后者卻需分別進行，存在一定的局限性?，F將該方法的優(yōu)勢歸納如下：

同時針對α?地貧基因缺失類型與α/β?地貧基因突變類型進行檢測，操作簡便化，能較大程度地避免樣本污染，也不易受各試驗條件因素的影響；效率高，從試驗操作到結果分析的整個流程耗時短；適用于大批量的臨床樣本檢測，穩(wěn)定性高，重復性好，準確度強；所需樣本量少，且對人體造成危害的可能性極低；能一次性檢測多種突變位點及缺失類型，并可發(fā)現新的突變類型，具有較高的臨床與科研價值。由本次檢測結果可看出，此方法能迅速、有效、準確地檢測出常見的??SEA、?α3.7、?α4.23種缺失型及CD122、CD125、CD142 3種點突變類型和我國常見的多種β?地貧基因突變位點。

因此，本研究所建立的Amplicon文庫構建法，基于高通量測序平臺技術的基因檢測為地貧的診斷提供了快速可靠的參考依據，對指導優(yōu)生優(yōu)育，防止中、重型地貧患兒出生，提高人口素質等具有重要意義。

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Gene diagnostic of thalassem ia by the method of constructing am p licon libraries

SUN Yuting1,FAN Dongmei2,YEQianping1,YANG Linyan1,LIANG Zhikun1,YANG Xuexi2★
(1.Guangzhou DaruiBiotechnology Co.,Ltd.,Guangzhou,Guangdong,China,510665;2.Schoolof Laboratory Medicine and Biotechnology,Southren Medical University,Guangzhou,Guangdong,China,510515)

Objective To further improve the existing diagnosticmethods of thalassem ia,establish a new method for gene diagnosis base on next generation sequencing and research the mutation type and distribution of alpha/beta thalassem ia gene.Methods 219 cases of the whole blood samples w ith thalassem ia have been sequenced and analyzed using themethod of constructing amplicon libraries,which is based on next generation sequencing platform.Results There were total of 14 mutation types detected, including 3 non?deletion of CD122,CD125 and CD142 in alpha thalassem ia,11 kinds of common mutation of IVS?II?654,CD41?42,CD17 and other in beta thalassem ia in these 219 cases of the thalassem ia patients.In addition,through graphing analysis by Bioinformatics software,3 type of alpha deletion of??SEA,?α3.7and?α4.2have been screened out.Conclusion This study have further improved the gene diagnosticmethod base on next generation sequencing technology and set up amethod of constructing amplicon libraries that can be used for diagnosing the deletion andmutation types of alpha/beta thalassemia gene accurately and effectively.It has a great significance in population screening,genetic counseling of prenatal and postnatal care,disease preventing for newborn w ith severemediterranean anemia,etc.

Thalassemia;Genetic diagnostic;Constructing amplicon libraries;Betamutation;A lpha deletion

廣東省科技計劃項目（503169728081）；廣州市科技計劃項目健康醫(yī)療協(xié)同創(chuàng)新重大專項（201508020259）

1.廣州市達瑞生物技術股份有限公司，廣東，廣州510665 2.南方醫(yī)科大學檢驗與生物技術學院，廣東，廣州510515

★通訊作者：楊學習，E?mail：yxxzb@sohu.com