謝美娟 鄧權(quán)衡 鄧紅輝 盧紹月 楊學(xué)習(xí) 馬強(qiáng)★

·論著·

應(yīng)用下一代測(cè)序技術(shù)對(duì)α地中海貧血進(jìn)行胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)

謝美娟1鄧權(quán)衡1鄧紅輝1盧紹月1楊學(xué)習(xí)2馬強(qiáng)2★

目的探討下一代測(cè)序（nextgeneration sequencing，NGS）技術(shù)在α地中海貧血胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用。方法選取2對(duì)α地中海貧血??SEA缺失型攜帶者夫婦體外受精胚胎活檢后的6個(gè)胚胎樣本應(yīng)用全基因組擴(kuò)增（whole genome amplification，WGA）技術(shù)、下一代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)，同時(shí)采用跨越斷裂點(diǎn)熒光PCR（gap?PCR）進(jìn)行平行對(duì)照檢測(cè)。結(jié)果2個(gè)家系6個(gè)胚胎樣本的胚胎植入前遺傳學(xué)診斷（preimplantation genetic diagnosis，PGD）結(jié)果分別為??SEA/ αα母源攜帶、??SEA/??SEA、??SEA/αα母源攜帶、??SEA/??SEA、??SEA/αα母源攜帶和??SEA/??SEA；胚胎植入前遺傳學(xué)篩查（preimplantation genetic screening，PGS）結(jié)果分別為45，XX，?5、46，XX、46，XY、47，XY，+1、46，XX和46，XY，+1，?2；Family 1 gap?PCR檢測(cè)結(jié)果為父母均為SEA雜合子；E1為正常、E2為SEA純合子、E3為正常；Family 2檢測(cè)結(jié)果分別為：父母均為SEA雜合子；E4為SEA純合子、E5為正常、E6為SEA純合子。結(jié)論結(jié)果顯示利用NGS不僅可以檢測(cè)出23對(duì)染色體的核型，同時(shí)解決了單細(xì)胞擴(kuò)增等位基因脫扣（allele drop?out，ADO）造成的假陽(yáng)性和假陰性的風(fēng)險(xiǎn)，更具有市場(chǎng)潛力及應(yīng)用前景。

下一代測(cè)序；α地中海貧血；胚胎植入前遺傳學(xué)診斷；跨越斷裂點(diǎn)熒光PCR

α?地中海貧血，是一組因α?珠蛋白鏈合成減少或不能合成、α?鏈/非α?鏈比例失衡為特征的遺傳溶血性血紅蛋白病。我國(guó)南方為α?地中海貧血的高發(fā)區(qū)，其攜帶率也高達(dá)8.53％［1］；其中以東南亞（??SEA）缺失型最為常見(jiàn)，其發(fā)生率為72.87％～82.87％［2］。α?地中海貧血與出生缺陷有密切關(guān)系，也給社會(huì)和家庭帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)，而目前，α?地中海貧血還沒(méi)有有效的根治方法，主要以預(yù)防為主。因此，采用植入前期胚胎篩查來(lái)阻斷患兒的出生極為重要。

胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)主要包括胚胎植入前遺傳學(xué)診斷（preimplantation genetic diagnosis，PGD）和胚胎植入前遺傳學(xué)篩查（preimplantation genetic screening，PGS）2方面。PGD是在胚胎著床之前即對(duì)配子或胚胎進(jìn)行遺傳物質(zhì)分析，選擇沒(méi)有遺傳物質(zhì)異常的胚胎移植，可以有效地阻斷患兒的出生；PGS是選擇染色體整倍體的胚胎進(jìn)行移植，進(jìn)而提高體外受精?胚胎移植（in vitro fer?tilization?embryo transfer，IVF?ET）技術(shù)的成功率。

隨著我國(guó)全面二孩政策的放開(kāi)，高齡產(chǎn)婦數(shù)量猛增，再加上不孕不育率逐年上升，提高妊娠率和妊娠質(zhì)量已經(jīng)成為亟待解決的問(wèn)題。目前，以PGD/PGS為代表的第三代試管嬰兒正是解決這些問(wèn)題的關(guān)鍵技術(shù)［3?4］。此外，NGS具有高通量、自動(dòng)化、低成本的特征，自2008年以來(lái)，全基因組測(cè)序費(fèi)用呈指數(shù)級(jí)下降，使得NGS在PGD/PGS臨床上的應(yīng)用得到迅速推廣。本研究采用NGS對(duì)α?地中海貧血進(jìn)行胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)，探討NGS應(yīng)用于PGD/PGS臨床檢測(cè)的可行性。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

QIAamp?DNA M iniand QIAamp DNA Blood M ini Kits、The REPLI?g Single Cell Kit購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；Ion AmpliseqTMlibrary kit 2.0、Ion PGM?Template OT2 200 Kit、Ion PGM?Sequenc?ing 200 Kit v2、Ion Personal Genome Machine?（PGM?）、Qubit?2.0均購(gòu)自美國(guó)Life Technology公司；α?地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒（gap?PCR法）購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司；Nuclease?FreeWater購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司；無(wú)水乙醇（分析純）購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 研究對(duì)象

2個(gè)家系雙方均為α?地中海貧血??SEA缺失型雜合子夫婦經(jīng)體外受精胚胎活檢后共6個(gè)胚胎囊胚期滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞以及夫妻雙方外周血。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 全基因組擴(kuò)增、基因組DNA提取

使用The REPLI?g Single Cell Kit對(duì)6個(gè)胚胎囊胚期滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞進(jìn)行全基因組擴(kuò)增；采用QIAamp?DNA M ini and QIAamp DNA Blood M ini Kits對(duì)2對(duì)夫婦的全血樣本進(jìn)行基因組DNA提??；具體操作步驟參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。

1.3.2 下一代測(cè)序

根據(jù)測(cè)序需要，使用Ion AmpliseqTMlibrary kit 2.0將擴(kuò)增好的DNA構(gòu)建成文庫(kù)DNA。PCR特異性擴(kuò)增目的片段，在DNA片段兩端加上通用測(cè)序接頭，PCR擴(kuò)增文庫(kù)DNA，磁珠純化去除雜質(zhì)；建庫(kù)后使用Qubit?2.0測(cè)定文庫(kù)DNA的濃度；根據(jù)每個(gè)樣本測(cè)序數(shù)據(jù)需求量和測(cè)序深度確定文庫(kù)的混樣個(gè)數(shù)為10個(gè)進(jìn)行模板制備，使用Ion PGM?Template OT2 200 Kit制備測(cè)序模板；然后進(jìn)行陽(yáng)性模板的富集即去除雜質(zhì)及擴(kuò)增失敗的測(cè)序模板；最后使用Ion PGM?Sequencing 200 Kit v2在PGM?上進(jìn)行測(cè)序。

1.3.3 下一代測(cè)序數(shù)據(jù)分析

將上機(jī)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)利用Tor?rent_Server_5.0_VM軟件去除接頭序列，通過(guò)Tor?rent Mapping A lignment Program（TMAP）軟件比對(duì)到人類(lèi)基因組參考序列hg19上，通過(guò)sam tools統(tǒng)計(jì)覆蓋倍數(shù)，通過(guò)GATK calling SNP基因型分析，最后結(jié)合家系的SNP連鎖分析，構(gòu)建單體型。

1.3.4 gap?PCR

將2對(duì)夫妻雙方外周血提取的基因組DNA以及6個(gè)胚胎全基因組擴(kuò)增后的基因組DNA采用α?地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒進(jìn)行g(shù)ap?PCR檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)操作、結(jié)果判讀參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。

2 結(jié)果

表1 6個(gè)胚胎下一代測(cè)序結(jié)果匯總表Table 1 Results of 6 embryos detected by NGS

表2 Fam ily 1 PGD結(jié)果Table 2 PGD results of fam ily 1

2.1 下一代測(cè)序結(jié)果

本次研究收集2對(duì)地中海貧血攜帶者夫婦體外受精胚胎活檢的6個(gè)囊胚期滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞以及2對(duì)夫妻雙方外周血基因組樣本進(jìn)行下一代測(cè)序。下一代測(cè)序檢測(cè)結(jié)果匯總表見(jiàn)表1。

將夫妻雙方外周血測(cè)序數(shù)據(jù)及其各自的胚胎測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行家系的SNP連鎖分析，構(gòu)建單體型，進(jìn)行結(jié)果的判斷，6例胚胎樣本中，PGD結(jié)果分別為E1：??SEA/αα母源攜帶；E2：??SEA/??SEA；E3：??SEA/αα母源攜帶；E4：??SEA/??SEA；E5：??SEA/αα母源攜帶；E6：??SEA/??SEA，詳見(jiàn)表2、表3。

表3 Fam ily 2 PGD結(jié)果Table 3 PGD resultsof family 2

表4 2種檢測(cè)方法結(jié)果比對(duì)Table 4 The comparison results of PGD and gap?PCR

為提高IVF?ET的成功率，再將6個(gè)胚胎進(jìn)行PGS檢測(cè)，PGS檢測(cè)結(jié)果分別為E1：45，XX，?5；E2：46，XX；E3：46，XY；E4：47，XY，+1；E5：46，XX；E6：46，XY，+1，?2。詳見(jiàn)圖1、圖2。

2.2 gap?PCR檢測(cè)結(jié)果

為了驗(yàn)證本次檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，將2個(gè)家系樣本同時(shí)進(jìn)行g(shù)ap?PCR的檢測(cè)，F(xiàn)am ily 1檢測(cè)結(jié)果分別為：父母均為SEA雜合子；E1為正常、E2為 SEA純合子、E3為正常；凝膠電泳圖結(jié)果見(jiàn)圖3；Fam ily 2檢測(cè)結(jié)果分別為：父母均為SEA雜合子；E4為SEA純合子、E5為正常、E6為SEA純合子；凝膠電泳圖結(jié)果見(jiàn)圖4。

2.3 2種檢測(cè)方法結(jié)果比對(duì)

將2種檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，詳見(jiàn)表4。結(jié)果顯示對(duì)于SEA純合缺失樣本2種方法檢測(cè)結(jié)果一致，而經(jīng)過(guò)WGA的PCR產(chǎn)物對(duì)SEA攜帶者則檢測(cè)結(jié)果為正常。

3 討論

目前α?地中海貧血SEA缺失型的檢測(cè)，文獻(xiàn)報(bào)道的PCR技術(shù)已比較成熟［5?6］。但PCR技術(shù)在PGD中仍然面臨著一些問(wèn)題，如擴(kuò)增偏倚和ADO等。ADO即一個(gè)細(xì)胞內(nèi)來(lái)自雙親的2個(gè)等位基因只有一個(gè)擴(kuò)增到可供檢測(cè)的水平的現(xiàn)象，是影響PGD準(zhǔn)確性的主要因素之一。ADO的發(fā)生率為5％～20％［7?8］。其危害在于可導(dǎo)致雜合子胚胎的誤診，是PCR技術(shù)進(jìn)行顯性遺傳病PGD可靠診斷的最大障礙。

本次實(shí)驗(yàn)中共檢測(cè)2個(gè)家系4個(gè)外周血樣本及6例胚胎樣本。PGD結(jié)果分別為E1：??SEA/αα母源攜帶；E2：??SEA/??SEA；E3：??SEA/αα母源攜帶；E4：??SEA/??SEA；E5：??SEA/αα母源攜帶；E6：??SEA/??SEA；此外，在輔助生殖領(lǐng)域，染色體非整倍體也被認(rèn)為是胚胎植入反復(fù)失敗的重要原因之一［9?10］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，約50％經(jīng)IVF的胚胎存在染色體異常，約70％的IVF失敗由染色體異常導(dǎo)致［11?12］，因此為提高IVF?ET的成功率，將6個(gè)胚胎進(jìn)行PGS檢測(cè)，PGS檢測(cè)結(jié)果分別為E1：45，XX，?5；E2：46，XX；E3：46，XY；E4：47，XY，+1；E5：46，XX；E6：46，XY，+1，?2；最后為了驗(yàn)證本次檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，將2個(gè)家系樣本同時(shí)進(jìn)行g(shù)ap?PCR的檢測(cè)。對(duì)比兩者結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)于SEA純合缺失樣本2種方法檢測(cè)結(jié)果一致，而經(jīng)過(guò)WGA的PCR產(chǎn)物對(duì)SEA攜帶者則檢測(cè)結(jié)果為正常，與PGD檢測(cè)結(jié)果不一致；這可能是由于在PCR過(guò)程中ADO所導(dǎo)致的［13］，而本研究采用WGA結(jié)合NGS，通過(guò)單體型的構(gòu)建可以推斷出該胚胎2條DNA鏈的來(lái)源從而最終確定其是否攜帶致病基因；同時(shí)，通過(guò)低通量的全基因組測(cè)序來(lái)進(jìn)行染色體核型的判斷，從而選擇核型正常且沒(méi)有致病基因的胚胎進(jìn)行植入，進(jìn)而提高體外受精的妊娠率、阻斷了地中海貧血患兒的出生。本研究結(jié)合WGA與NGS技術(shù)解決了樣本微量的問(wèn)題以及ADO造成的假陽(yáng)性和假陰性的風(fēng)險(xiǎn)；而且還可以準(zhǔn)確判斷染色體非整倍體，更是解決了一些特殊基因不能直接診斷的局限性、樣本污染等問(wèn)題。

NGS當(dāng)前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷，同時(shí)也在PGD/PGS領(lǐng)域中應(yīng)用。國(guó)內(nèi)外均可見(jiàn)到NGS應(yīng)用于PGD/PGS的報(bào)道。早期有報(bào)道稱(chēng)PGS不能顯著提高植入率和活產(chǎn)率，這可能與早期的PGS技術(shù)主要是針對(duì)部分染色體異常進(jìn)行檢測(cè)有關(guān)。Kung等［14］采用活檢的滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞、卵裂球及已知的細(xì)胞系比較了NGS和微陣列比較基因組雜交（array?comparative genom ic hybridiza?tion，aCGH），結(jié)果顯示，NGS的敏感度和特異度均為100％。而早期PGD主要應(yīng)用熒光原位雜交（fluoresence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）和PCR等技術(shù)，存在一定的局限性，Moutou等［15］報(bào)道了PCR?PGD的誤診率為0.15％，而FISH?PGD誤診率為0.06％。目前尚未見(jiàn)NGS進(jìn)行PGD的誤診率的相關(guān)報(bào)道。PGD/PGS還存在另外一個(gè)重要方面的爭(zhēng)議是其子代的安全性問(wèn)題，但目前尚缺乏大樣本、前瞻性隨機(jī)對(duì)照研究。無(wú)創(chuàng)胚胎染色體篩查（non?invasive chromosome screening，NICS）應(yīng)運(yùn)而生，該

新技術(shù)利用了游離在培養(yǎng)液中極微量的DNA，通過(guò)目前單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)胚胎染色體的全面篩查，把從胚胎上提取細(xì)胞的活檢形式改革成從培養(yǎng)液中提取DNA的檢測(cè)形式，保護(hù)了胚胎樣本的完整性和安全性，但該技術(shù)目前尚不成熟，還存在著WGA擴(kuò)增效率低下、培養(yǎng)液污染等問(wèn)題，要真正普遍應(yīng)用于臨床還有待進(jìn)一步的探索。綜合各方面因素本研究建立了基于NGS的PGD/ PGS技術(shù)，它可以獲得基因組的全部信息，通過(guò)不同的檢測(cè)和分析策略，完全有可能實(shí)現(xiàn)對(duì)植入前胚胎從染色體異常檢測(cè)，到發(fā)現(xiàn)單基因突變甚至是新發(fā)突變等各個(gè)層面信息，同時(shí)該技術(shù)也可延伸到其他方面的臨床應(yīng)用，如無(wú)創(chuàng)單基因病產(chǎn)前診斷、HLA配型、染色體易位正常和攜帶者的區(qū)分以及親子鑒定等，更具有市場(chǎng)潛力及應(yīng)用前景。

［1］Xu XM，Zhou YQ，Luo GX，et al.The prevalence and spectrum of alpha and beta thalassaem ia in Guang?dong Province：implications for the future health bur?den and population screening［J］.J Clin Pathol，2004，57（5）：517-522.

［2］Xu YW，Zeng YH，Deng J，et al.Preimplantation ge?netic diagnosis for alpha?thalassaem ia in China［J］.J AssistReprod Genet，2009，26（7）：399-403.

［3］Xu Y，Chen S，Yin X，et al.Embryo genome profil?ing by single?cell sequencing for preimplantation genet?ic diagnosis in a beta?thalassemia family［J］.Clin Chem，2015，61（4）：617-626.

［4］Natesan SA，Bladon AJ，Coskun S，et al.Genome?w ide karyomapping accurately identifies the inheri?tance of single?gene defects in human preimplantation embryos in vitro［J］.Genet Med，2014，16（11）：838-845.

［5］Ko TM，Tseng LH，Hsieh FJ，et al.Carrier detection and prenatal diagnosis of alpha?thalassem ia of South?east Asian deletion by polymerase chain reaction［J］. Hum Genet，1992，88（3）：245-248.

［6］Chang JG，Lee LS，Lin CP，et al.Rapid diagnosis of alpha?thalassem ia?1 of southeast Asia type and hydrops fetalis by polymerase chain reaction［J］.Blood，1991，78（3）：853-854.

［7］de Bourcy CF，de V lam inck I，Kanbar JN，et al.A quantitative comparison of single?cell whole genome amplification methods［J］.Plos One，2014，9（8）：e105585.

［8］Ning L，Li Z，Wang G，et al.Quantitative assessment of single?cellwhole genome amplificationmethods for detecting copy number variation using hippocampal neurons［J］.Scientific Reports，2015，5（1）：1.

［9］Handyside AH.24?chromosome copy number analy?sis：a comparison of available technologies［J］.Fertil Steril，2013，100（3）：595-602.

［10］Fiorentino F，Biricik A，Bono S，et al.Development and validation of a next?generation sequencing?based protocol for 24?chromosome aneuploidy screening of embryos［J］.Fertil Steril，2014，101（5）：1375-1382.

［11］Chung MK，Jeong HJ，Lee JH，et al.Comprehensive chromosome analysis of blastocysts before implanta?tion using array CGH［J］.Mol Cytogenet，2013，6（1）：22.

［12］SchoolcraftWB，Katz?Jaffe MG.Comprehensive chro?mosome screening of trophectoderm w ith vitrification facilitates elective single?embryo transfer for infertile women w ith advanced maternal age［J］.Fertil Steril，2013，100（3）：615-619.

［13］Yan L，Huang L，Xu L，et al.Live births after simul?taneous avoidance ofmonogenic diseases and chromo?some abnormality by next?generation sequencing w ith linkage analyses［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2015，112（52）：15964-15969.

［14］Kung A，Wells D，Munne S，et al.Comparison of next generation sequencing（NGS）and aCGH for PGS［J］.Human Reproduction，2014：17.

［15］Moutou C，Goossens V，Coonen E，et al.ESHRE PGD Consortium data collection XII：cycles from Jan?uary to December 2009 w ith pregnancy follow?up to October 2010［J］.Hum Reprod，2014，29（5）：880-903.

Successful preim p lantation genetic detection for alpha thalassaem ia by using next generation sequencing technology

XIEMeijuan1,DENG Quanheng1,DENG Honghui1,LU Shaoyue1,YANG Xuexi2,MA Qiang2★
(1.Guangzhou DaruiBiotechnology Co.,Ltd.,Guangzhou,Guangdong,China,510665;2.Schoolof Laboratory Medicine and Biotechnology,Southern Medical University,Guangzhou,Guangdong,China,510515)

Objective To explore the application of next generation sequencing(NGS)for alpha?thalassem ia in preimplantation genetic detection.Methods 2 couplesw ith alpha?thalassem ia Southeast Asia deletion(??SEA deletion)and their embryos cells obtained after embryonic biopsy were selected to test by whole genome amplification(WGA)and NGS.Gap?PCR was done to all samples as a series of parallel tests. Results The PGD resultswere??SEA/αα,??SEA/??SEA,??SEA/αα,??SEA/??SEA,??SEA/ααand??SEA/??SEA,respectively.And embryosw ith the abnormalαgenewere confirmed from thematernal side according to genealogicalanalysis.The PGS results of 6 embryos from 2 familieswere 45,XX,?5;46,XX;46,XY;47,XY, +1;46,XX and 46,XY+1?2.Both husbands and w ives of the 2 families gap?PCR resultswere heterozygotes w ith??SEA deletion.The results of gap?PCR were normal in embryos 1,3 and 5 while??SEA deletion were

Next generation sequencing;A lpha thalassaem ia;Preimplantation genetic diagnosis; Gap?PCR

廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目健康醫(yī)療協(xié)同創(chuàng)新重大專(zhuān)項(xiàng)（201400000004?4）；廣州市重大科技攻關(guān)項(xiàng)目子課題（2014Y2?00220）；廣州市科技計(jì)劃產(chǎn)學(xué)研協(xié)同創(chuàng)新重大專(zhuān)項(xiàng)（201604020104）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目公益研究與能力建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)（2015A030401040）

1.廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司，廣東，廣州510665 2.南方醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東，廣州510515

★通訊作者：馬強(qiáng)，E?mail：mqqqm2006@163.com

found in embryos 2,4 and 6 accordingly.Conclusion NGS not only can detect karyotype of 46 chromosomes but also avoid the risk of false positive and false negative caused by the allele drop?out(ADO) during the single cellamplification w ith a huge potentialmarketand w ide application prospect.