楊 旭 劉美嬌 林 深 徐 丹 董襄朝
(南開大學(xué)化學(xué)學(xué)院, 天津 300071)
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限進(jìn)材料固相萃取-高效液相色譜在線聯(lián)用檢測牛奶中四環(huán)素類抗生素殘留
楊 旭 劉美嬌 林 深 徐 丹 董襄朝*
(南開大學(xué)化學(xué)學(xué)院, 天津 300071)
建立了一種限進(jìn)材料固相萃取-高效液相色譜在線聯(lián)用檢測牛奶中四環(huán)素類抗生素殘留的分析方法。利用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法制備的限進(jìn)型聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)鍵合硅膠作為同時富集四環(huán)素類小分子和排阻蛋白大分子的固相萃取材料。經(jīng)過限進(jìn)萃取柱的凈化和富集后,牛奶樣品中的四環(huán)素類抗生素(土霉素、四環(huán)素和金霉素)被反沖進(jìn)反相C18分析柱進(jìn)行色譜分離和測定。牛血清蛋白在限進(jìn)萃取柱上的洗脫率為96.0%,說明制備的限進(jìn)材料具有很好的排阻大分子蛋白的效果。3種四環(huán)素類抗生素在牛奶樣品中的加標(biāo)回收率為88.3%~101.5%,RSD<8.0%;方法檢出限為50~80 μg/L,線性范圍為0.05~2.0 μg/mL。結(jié)果表明,本方法簡單高效,準(zhǔn)確度好,檢出限達(dá)到了規(guī)定要求,可以作為檢測牛奶樣品中四環(huán)素類抗生素殘留的方法。
限進(jìn)型聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)鍵合硅膠; 固相萃取-高效液相色譜在線聯(lián)用; 四環(huán)素類抗生素; 牛奶
四環(huán)素類抗生素是養(yǎng)殖業(yè)中常用的獸藥和飼料添加劑,具有抑菌范圍廣、殺菌能力強、成本低廉等優(yōu)點,但是近年來抗生素的濫用逐漸導(dǎo)致動物源性食品中的藥物殘留超標(biāo)。長期食用含有四環(huán)素類抗生素的食品容易造成肝和腎臟的損傷,引發(fā)過敏和中毒反應(yīng),還會使牙齒變黃,嚴(yán)重影響到人類的身體健康[1,2]。為此國內(nèi)外嚴(yán)格制定了食品中四環(huán)素類抗生素的最高殘留限量(Maximum residue limits,MRL),中國要求水產(chǎn)品中土霉素、四環(huán)素和金霉素的MRL為100 μg/kg[3],美國規(guī)定在牛奶中的四環(huán)素類抗生素總量(包括土霉素、四環(huán)素和金霉素)的MRL為300 μg/kg[4];歐盟要求四環(huán)素類抗生素在動物肝臟、乳汁和雞蛋中的MRL分別為600,100和200 μg/kg[5]。
目前,檢測動物源性食品中四環(huán)素類抗生素痕量殘留的方法包括液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[6~8]、高效液相色譜法[9~11]、毛細(xì)管電泳法[12]、酶聯(lián)免疫法[13]等,其中高效液相色譜法(HPLC)由于具有分析速度快、分離效能高、適用范圍廣等特點而被廣范應(yīng)用,但是大部分方法都需要經(jīng)過沉淀蛋白以及離線固相提取過程,分析時間長,而且容易造成樣品損失。
對牛奶、體液等生物樣品進(jìn)行分析測定前,由于待測物質(zhì)在樣品中濃度低,且干擾物質(zhì)較多,會對檢測的準(zhǔn)確度和精密度產(chǎn)生影響,因此需要對樣品進(jìn)行預(yù)處理。固相萃取(Solid-phase extraction,SPE)是一種常用的樣品預(yù)處理方法[14,15],其與液液萃取法相比具有適用范圍廣、有機(jī)溶劑用量少、選擇性高和萃取材料可重復(fù)使用等優(yōu)勢。但傳統(tǒng)的固相萃取材料容易使蛋白變性沉淀或?qū)τ谏飿悠分械牡鞍踪|(zhì)等大分子形成不可逆吸附,造成填料的堵塞和萃取性能的降低。為了解決這個問題,研究者發(fā)展了限進(jìn)材料(Restricted access material,RAM),這種材料通過兩種類型的排阻作用去除生物大分子,一種是利用親水層造成阻隔作用的化學(xué)排阻,一種是依靠填料孔徑限制的物理排阻,大分子物質(zhì)可以在死體積或者接近死體積的情況下被洗脫排出,同時樣品中的小分子物質(zhì)能夠進(jìn)入填料內(nèi)層被富集和分離。限進(jìn)材料的這種特性使其能夠在處理復(fù)雜樣品時實現(xiàn)樣品的直接進(jìn)樣分析,如果作為固相提取材料與其他儀器聯(lián)用,可以簡化實驗操作,節(jié)省時間和人力,因此在樣品前處理領(lǐng)域備受關(guān)注[16~21]。本研究以原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法制備的限進(jìn)型聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)鍵合硅膠作為固相萃取柱填料,通過條件選擇,建立了固相萃取-高效液相色譜在線聯(lián)用檢測牛奶中四環(huán)素類抗生素的新方法。
2.1 儀器與試劑
高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司),包括LC-20AD高壓輸液泵,SPD-20A全波長紫外檢測器,7725i手動進(jìn)樣器,7060六通切換閥;XW-80A旋渦混合儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);LG16-C高速離心機(jī)(北京雷勃爾離心機(jī)有限公司);Luna C18(2)色譜柱(250 mm ×4.6 mm,美國Phenomenex公司)。
鹽酸四環(huán)素(標(biāo)準(zhǔn)品,97.5%)、鹽酸金霉素(標(biāo)準(zhǔn)品,97.5%)、土霉素(標(biāo)準(zhǔn)品,88.8%),均購自中國藥品生物制品檢定所;甲基丙烯酸縮水甘油酯(Glycidyl methacrylate, GMA)、二乙烯基苯(Divinylbenzene, DVB)、苯乙烯(Styrene, St)購自天津希恩思生化科技有限公司;乙腈(分析純,天津市康科德科技有限公司);牛血清蛋白(Bovine serum albumin, BSA,北京索萊寶科技有限公司);牛奶購自當(dāng)?shù)爻小?/p>
Na2EDTA-McIlvaine提取液制備:1.86 g Na2EDTA,7.5 g Na2HPO4·12H2O和6.5 g C6H8O7·H2O用水溶解后定容至500.0 mL,并用H3PO4調(diào)節(jié)至pH 2.9。
0.05 mol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液(pH 6.0)的配制:準(zhǔn)確量取0.2 mol/L Na2HPO4溶液78.9 mL、0.1 mol/L檸檬酸溶液46.1 mL,用水定容至500.0 mL后混合均勻。
2.2 實驗方法
2.2.1 限進(jìn)型聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)鍵合硅膠的制備 限進(jìn)材料的制備方法參考文獻(xiàn)[22],采用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(Atom transfer radical polymerization,ATRP)方法,利用“Grafting from”技術(shù)在硅膠表面接枝聚(苯乙烯-co-二乙烯苯);再利用聚合物表面的ATRP基團(tuán),接枝聚甲基丙烯酸縮水甘油酯,酸性條件下水解成聚(丙三醇單甲基丙烯酸酯)后形成親水性限進(jìn)層,即制得限進(jìn)型聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)包覆硅膠色譜填料(Restricted accessed poly(styrene-co-divinylbenzene) bonded silica, Sil-p(St/DVB)-RAM)。材料的疏水性因子(kEtBz/kMeBz)為1.5,牛血清蛋白的排阻率>96%,表征結(jié)果說明,材料具有很好的保留疏水性小分子和排阻蛋白分子的能力。
2.2.2 Sil-p(St/DVB)-RAM柱的液相色譜性能評價 將制備好的限進(jìn)材料Sil-p(St/DVB)-RAM 采用干法填充進(jìn)不銹鋼色譜柱(30 mm × 4.6 mm),填料質(zhì)量為0.34 g。色譜柱用水、乙腈和甲醇反復(fù)沖洗后,用流動相進(jìn)行平衡,待基線穩(wěn)定后進(jìn)樣測定。分別以水、磷酸鹽緩沖溶液、緩沖溶液/乙腈為流動相,以牛血清蛋白(BSA)的洗脫回收率為指標(biāo),測定不同流動相條件下Sil-p(St/DVB)-RAM柱對大分子蛋白質(zhì)的排阻能力;以磷酸鹽緩沖溶液/乙腈為流動相,測定限進(jìn)材料對小分子物質(zhì)的保留能力。
2.2.3 牛奶加標(biāo)樣品制備 10.0 mL牛奶樣品中加入土霉素、四環(huán)素、金霉素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液混勻,再加入10.0 mL Na2EDTA-McIlvaine提取液,旋渦混合2 min,隨后離心分離15 min,轉(zhuǎn)速5000 r/min。中層清液用0.45 μm濾膜過濾,得到牛奶加標(biāo)樣品;加標(biāo)濃度為0.04~2.0 μg/mL。未加標(biāo)的牛奶除不加入待測物質(zhì)外,其它處理方式與加標(biāo)樣相同。
2.2.4 限進(jìn)材料固相萃取-高效液相色譜在線聯(lián)用檢測牛奶中四環(huán)素類抗生素 牛奶樣品通過限進(jìn)固相萃取-HPLC在線聯(lián)用方法進(jìn)行檢測,柱切換方式如圖1所示。Sil-p(St/DVB)-RAM柱作為預(yù)處理柱用于排阻大分子蛋白質(zhì)、富集待測物質(zhì),Luna C18(2)色譜柱(250 mm×4.6 mm,Phenomenex,USA)作為分析柱進(jìn)行分離檢測,以六通切換閥進(jìn)行柱切換,切換閥通過島津色譜工作站(LabSolutions)進(jìn)行控制。樣品進(jìn)樣體積為1.0 mL,四環(huán)素類檢測波長355 nm。流動相A、流動相B均為0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.0),流動相C為乙腈。六通閥在位置A (實線位置)時,以流動相A平衡Sil-p(St/DVB)-RAM柱,流動相B/C(93∶7,V/V)平衡分析柱,流速均為1.0 mL/min,平衡時間10 min。樣品以1.0 mL/min的流速進(jìn)入Sil-p(St/DVB)-RAM柱;5 min后切換至位置B (虛線位置),以流動相B/C梯度將富集在限進(jìn)柱上的待測物質(zhì)反沖到分析柱上,進(jìn)入洗脫/分析過程。流動相B/C的梯度為0~20 min; 7%~47% C; 20~25 min,47% C。流速1.0 mL/min。分析過程結(jié)束后,切換六通閥至Position A,進(jìn)行下一次分析過程。
圖1 RAM-SPE-HPLC在線聯(lián)用法測定牛奶中四環(huán)素類抗生素的色譜柱切換示意圖Fig.1 Schematic diagram of on-line restricted access materil (RAM)-SPE-HPLC for determination of tetracyclines in milk samples六通閥實線位置: 在線固相提取過程; 六通閥虛線位置: 分析過程。Solid line position of six-part valve: on-line solid-phase extraction; Dotted line position of six-part valve: analytical process.
3.1 Sil-p(St/DVB)-RAM柱的排阻能力評價
以BSA為樣品,分別以水、Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液(0.05 mol/L,pH 6.0)、 Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液(0.05 mol/L,pH 6.0)/乙腈(90∶10,V/V)為流動相,考察不同流動相條件下Sil-p(St/DVB)-RAM柱對大分子蛋白質(zhì)的排阻能力,BSA的洗脫回收率及排阻時間列于表1,結(jié)果表明,流動相中鹽溶液的存在有助于Sil-p(St/DVB)-RAM柱對BSA的排阻,而加入10%乙腈對蛋白的洗脫率影響不大。
表1 Sil-p(St/DVB)-RAM固相萃取柱排阻牛血清蛋白的流動相條件選擇a
Table 1 Selection of mobile phase for BSA exclusion from the restricted accessed poly(styrene-co-divinylbenzene)bonded silica (Sil-p(St/DVB))-RAM SPE column
流動相MobilephaseBSA回收率BSArecoverya(%)排阻時間Exclusiontimeb(min)水溶液Aqueoussolution88.24.4緩沖溶液Buffersolution96.04.0緩沖溶液/乙腈Buffersolution/acetonitrile96.74.1a進(jìn)樣體積1.0mL,流動相流速為1.0mL/min,檢測波長為280nm,緩沖溶液均為Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液(0.05mol/L,pH6.0)。b排阻時間為BSA洗脫后回到基線所用的時間。aTheinjectionvolumewas1.0mL.Theflowratewas1.0mL/minandthedetectionwavelengthofBSAwas280nm.Na2HPO4-citricacidbuffer(0.05mol/L,pH6.0)wasused.bExclusiontimewasthetimethatpeaktailofBSAreachedbaseline.
3.2 流動相條件對于Sil-p(St/DVB)-RAM柱的保留能力的影響
以四環(huán)素為樣品,考察了Sil-p(St/DVB)-RAM柱對四環(huán)素類小分子的保留能力與流動相條件的關(guān)系(圖2)。以 Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液(0.05 mol/L)/乙腈(50∶50,V/V)為流動相,考察了緩沖溶液pH值對四環(huán)素保留因子的影響(圖2A)。隨著緩沖溶液pH值升高,四環(huán)素在限進(jìn)柱上的保留先增強、后減弱,在pH 6.0時保留能力最強。由于強酸或強堿環(huán)境下,四環(huán)素結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性較差[23],同時為了保證限進(jìn)柱對四環(huán)素有較強的富集和凈化能力,后續(xù)實驗中選擇pH 6.0為緩沖溶液酸度。以磷酸鹽緩沖溶液(0.05 mol/L,pH 6.0)/乙腈為流動相,通過改變水相和有機(jī)相的比例發(fā)現(xiàn),限進(jìn)柱對四環(huán)素分子的保留能力隨著緩沖溶液比例的增加而升高,此現(xiàn)象符合反相色譜保留機(jī)理(圖2B)。圖2C顯示,以磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.0)/乙腈(50∶50,V/V)為流動相時,隨著緩沖溶液鹽濃度的升高,限進(jìn)柱對四環(huán)素的保留逐漸減弱,表明Sil-p(St/DVB)-RAM對四環(huán)素的吸附能力受到溶液中離子強度的影響。
圖2 流動相組成對四環(huán)素在Sil-p(St/DVB)-RAM柱上保留的影響Fig.2 Influence of mobile phase compositions on the retention of tetracycline on Sil-p(St/DVB)-RAM column(A)流動相為 Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液(0.05 mol/L)/乙腈(50∶50, V/V);(B)流動相為磷酸鹽緩沖溶液(0.05 mol/L,pH 6.0)/乙腈;(C)流動相為磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.0)/乙腈(50∶50, V/V);流動相流速1.0 mL/min;進(jìn)樣量20 μL;檢測波長355 nm。(A) Mobile phase: Na2HPO4-citric acid buffer (0.05 mol/L)/acetonitrile (50∶50, V/V); (B) mobile phase: Na2HPO4-citric acid buffer (0.05 mol/L, pH 6.0)/acetonitrile; (C) mobile phase: Na2HPO4-citric acid buffer (pH 6.0)/ acetonitrile (50∶50, V/V). The flow rate was 1.0 mL/min. The injection volume was 20 μL and the detection wavelength was 355 nm.
3.3 Sil-p(St/DVB)-RAM固相萃取-HPLC在線聯(lián)用方法的建立
為實現(xiàn)大體積樣品的直接進(jìn)樣分析,上樣流動相的選用原則是,對雜質(zhì)的排出能力強及待測物質(zhì)在萃取柱上能夠有效且充分的富集;洗脫及分析流動相的選取原則是,既能夠保證待測物質(zhì)能夠從萃取柱上快速洗脫,又要保證待測物質(zhì)被反沖到分析柱時不會因流動相洗脫能力太強而未能與固定相發(fā)生充分相互作用。綜合考慮流動相選取原則及柱切換過程中上樣和洗脫流動相之間匹配性問題,根據(jù)3.2節(jié)的實驗結(jié)果,對色譜條件進(jìn)行優(yōu)化后,確定 Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液(pH 6.0,0.05 mol/L)為上樣流動相,緩沖溶液(pH 6.0,0.05 mol/L)/乙腈為洗脫和分析流動相,按照2.2.4節(jié)所述程序,建立限進(jìn)固相萃取-HPLC在線聯(lián)用檢測樣品中土霉素、四環(huán)素、金霉素的分析方法,得到的色譜圖見圖3。
圖3 限進(jìn)固相萃取-高效液相色譜在線聯(lián)用法測定四環(huán)素類抗生素的色譜圖Fig.3 Chromatograms of on-line RAM-SPE-HPLC method for determination of tetracyclines(a)土霉素、四環(huán)素、金霉素濃度均為0.40 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液;(b)加標(biāo)濃度為0.40 μg/mL的牛奶樣品;(c)未加標(biāo)四環(huán)素類抗生素的牛奶樣品。樣品進(jìn)樣量1.0 mL,檢測波長355 nm。1. 土霉素;2. 四環(huán)素;3. 金霉素。(a) Standard tetracyclines mixture solution; (b) spiked milk sample (0.40 μg/mL), (c) blank milk sample. The injection volume was 1.0 mL and the detection wavelength was 355 nm. 1. oxytetracycline; 2. tetracycline; 3. chlotetracycline.
3.4 Sil-p(St/DVB)-RAM固相萃取-HPLC在線聯(lián)用方法的色譜評價
在優(yōu)化的色譜條件下,以Sil-p(St/DVB)-RAM固相萃取-HPLC在線聯(lián)用方法分別測定在牛奶中加標(biāo)濃度為0.04, 0.08, 0.1, 0.25, 0.4, 1.0, 1.6和2.0 μg/mL的土霉素、四環(huán)素、金霉素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個樣品平行測定3次,以峰面積對濃度作圖,得到方法的線性方程;分別測定方法的定量限和檢出限,結(jié)果(表2)表明,在0.05~2.0 μg/mL范圍內(nèi),方法線性相關(guān)性良好,檢出限較低,滿足實際應(yīng)用的需要。日內(nèi)精密度和日間精密度見表3。
3.5 Sil-p(St/DVB)-RAM固相萃取-HPLC在線聯(lián)用方法測定加標(biāo)和空白牛奶樣品
為驗證方法的實用性,實驗中采用未檢出3種四環(huán)素類物質(zhì)的牛奶為空白基質(zhì),進(jìn)行加標(biāo)待測物質(zhì)的牛奶樣品分析,每個樣品平行測定5次。樣品中土霉素、四環(huán)素、金霉素的回收率和RSD見表4。
表2 限進(jìn)固相萃取-高效液相色譜在線聯(lián)用測定四環(huán)素方法的線性及檢出限(n=3)a
Table 2 Linearity and detection limits of on-line RAM-SPE-HPLC method for determination of tetracyclines(n=3)
分析物Analytes線性方程Linearequation線性相關(guān)系數(shù)CorrelationcoefficientR2檢出限LOD(μg/mL)定量限LOQ(μg/mL)土霉素OxytetracyclineY=9.84×105X-184680.99950.050.18四環(huán)素TetracyclineY=2.45×106X-1127890.99910.080.25金霉素ChlotetracyclineY=1.09×106X-22340.99930.060.21a線性關(guān)系測定的濃度范圍為0.05~2.0μg/mL。aThelinearitywasdeterminedinconcentrationrangeof0.05to2.0μg/mLforalltetracyclines.
表3 四環(huán)素類抗生素測定的日內(nèi)和日間精密度
Table 3 Intra-day and inter-day precision in tetracyclines determination
分析物Analyste日內(nèi)精密度Intra-dayprecision(μg/mL)日間精密度Inter-dayprecision(μg/mL)土霉素Oxytetracycline0.0150.270四環(huán)素Tetracycline0.0050.263分析物Analyste日內(nèi)精密度Intra-dayprecision(μg/mL)日間精密度Inter-dayprecision(μg/mL)金霉素Chlotetracycline0.0140.220
表4 加標(biāo)牛奶樣品測定的回收率和精密度 (n=5)
Table 4 Accuracy and precision of on-line RAM-SPE-HPLC method determined by tetracyclines spiked milk samples (n=5)
加標(biāo)濃度Spikedconcentration(μg/mL)土霉素Oxytetracycline回收率Recovery(%)RSD(%)四環(huán)素Tetracycline回收率Recovery(%)RSD(%)金霉素Chlotetracycline回收率Recovery(%)RSD(%)0.198.96.0101.52.992.58.00.2599.25.498.11.091.44.20.498.95.699.04.688.32.70.698.12.899.91.589.73.92.097.04.996.81.997.34.8
表5 不同牛奶空白樣品的檢測結(jié)果 (n=3)
Table 5 Results of tetracyclines determination in milk samples (n=3)
牛奶Milk濃度(μg/mL)和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(%)Concentrations(μg/mL)andRSD(%)土霉素Oxytetracycline四環(huán)素Tetracycline金霉素ChlotetracyclineAn.d.2.1(3.7)n.d.Bn.d.n.d.n.d.n.d.:未檢出(Notdetected)。
結(jié)果表明,本分析方法準(zhǔn)確度和精密度都較高,具有實際應(yīng)用價值。采用本方法分析了兩種從當(dāng)?shù)爻匈徺I的不同品牌的牛奶樣中四環(huán)素類化合物,分析結(jié)果見表5。
以Sil-p(St/DVB)-RAM為固相萃取材料,建立了限進(jìn)固相萃取-高效液相色譜在線聯(lián)用測定牛奶樣品中3種四環(huán)素類抗生素殘留的方法,獲得了較好的結(jié)果。實驗中Sil-p(St/DVB)-RAM柱對牛血清蛋白的排阻率為96.0%;土霉素、四環(huán)素和金霉素在優(yōu)化的色譜條件下能夠?qū)崿F(xiàn)有效分離,檢出限為50~80 μg/L,加標(biāo)回收率為88.3%~101.5%,RSD均低于8.0%;方法的線性范圍為50~2000 μg/L。實驗結(jié)果表明,建立的分析方法操作簡單,測定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠,具有很好的應(yīng)用價值。
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(Received 27 May 2015; accepted 13 September 2015)
Determination of Tetracycline Residues in Milk by On-line Coupling of Restricted Access Material Solid Phase Extraction with High Performance Liquid Chromatography
YANG Xu, LIU Mei-Jiao, LIN Shen, XU Dan, DONG Xiang-Chao*
(CollegeofChemistry,NankaiUniversity,Tianjin300071,China)
A new method has been developed for the determination of tetracycline residues in milk by on-line restricted access material solid phase extraction-HPLC analysis. Restricted accessed poly(styrene-co-divinylbenzene) bonded silica, synthesized by atom transfer radical polymerization, was used as solid phase extraction material in the experiment. This material played both functions of tetracylines extraction and biomacromolecule exclusion. Tetracyclines extracted from milk sample were back-flushed into a reversed phase C18analytical column and oxytetracycline, tetracycline and chlortetracycline were separated and quantified by HPLC analysis. The exclusion ratio of bovine serum albumin from the restricted access material column was 96.0%, which indicated that the restricted access material had the ability to exclude large biological molecules. The recoveries of three tetracylines in milk samples were 88.3%-101.5% with relative standard deviations <8.0%. The detection limits of 50-80 μg/L and the linear ranges from 0.05 μg/mL to 2.0 μg/mL for the analytes were obtained. The results demonstrated that the method could be used in the determination of tetracycline residues in milk samples with good sensitivity and efficiency.
Restricted accessed poly(styrene-co-divinylbenzene) bonded silica; On-line solid-phase extraction-high performance liquid chromatographic analysis; Tetracylines; Milk
10.11895/j.issn.0253-3820.150443
2015-05-27收稿;2015-09-13接受
* E-mail: xcdong@nankai.edu.cn