李正義，嚴(yán)金貝，殷 樂，徐德峰，孫小強(qiáng)*

(1.常州大學(xué) 石油化工學(xué)院，江蘇 常州 213164；2.常州大學(xué) 制藥與生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 常州 213164)

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二甲基姜黃素對Fe3+的選擇性識別研究

李正義1，嚴(yán)金貝1，殷 樂1，徐德峰2，孫小強(qiáng)1*

(1.常州大學(xué) 石油化工學(xué)院，江蘇 常州 213164；2.常州大學(xué) 制藥與生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 常州 213164)

以姜黃素和碘甲烷為原料，一步合成了二甲基姜黃素分子探針L，其結(jié)構(gòu)經(jīng)X-射線單晶衍射、1H NMR,13C NMR和ESI-MS等分析手段確證。該化合物晶體屬單斜晶系，空間群C2/c，晶胞參數(shù)：a=22.317(6) nm，b=8.703 8(19) nm，c=23.039(5) nm，β=93.378(10)°，V=4 467.4(18) nm3，Z=4，Dc=1.206 g·cm-3，F(xiàn)(000)=1 720，μ(MoKα)=0.088 mm-1，R=0.080 9，ωR=0.216 3。探針L在甲醇-水溶液(體積比 9∶1，Tris-HCl緩沖溶液，pH 7.2)中對Fe3+具有選擇性識別和較強(qiáng)的抗干擾能力。通過紫外滴定以及質(zhì)譜確證探針L與Fe3+形成1∶1配合物，結(jié)合常數(shù)(K)為1.089×106L/mol。該識別體系在Fe3+濃度為5.5×10-6～3×10-5mol/L范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系(r2=0.997 8)，檢出限為2.2×10-6mol/L。

二甲基姜黃素；分子探針；Fe3+；識別；紫外光譜

鐵是自然界最常見的過渡金屬之一，也是一種人體重要的微量元素，廣泛存在于生物體細(xì)胞中，與人體的造血功能有著很大的關(guān)系[1]。但鐵的過量或缺乏會(huì)對生命體的健康產(chǎn)生嚴(yán)重影響[2-3]，人體攝入過多的鐵會(huì)引起某些器官的功能紊亂，例如心臟病和老年癡呆癥等[4]。因此，有關(guān)Fe3+檢測方法的研究已成為熱點(diǎn)問題。目前，檢測Fe3+的方法繁多，其中原子吸收法、質(zhì)譜法和伏安法操作較為繁瑣耗時(shí)且實(shí)驗(yàn)成本相對較高[5-6]，而熒光法和紫外檢測法操作方便、快捷且準(zhǔn)確度和靈敏度高。因此基于熒光和紫外檢測的Fe3+分子探針的研究受到了廣泛關(guān)注，如羅丹明類[7]、共軛聚合物[8]、苯并咪唑類衍生物[9]和香豆素[10]等功能分子對Fe3+具有較好的識別性能。但其中某些識別體系由于受其他金屬離子的干擾限制了其在特定環(huán)境中的應(yīng)用，且絕大多數(shù)探針分子具有一定的毒性，也限制了其在生物體內(nèi)的應(yīng)用。因此，設(shè)計(jì)、開發(fā)一種對Fe3+具有高選擇性且無毒或低毒的探針分子具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

β-二酮類化合物能通過酮-烯醇互變形成配位能力較強(qiáng)的O-鰲合雙齒，與金屬離子配位可形成穩(wěn)定的六元螯合環(huán)，從而生成功能化的金屬配合物[11-13]。姜黃素及其衍生物具有β-二羰基結(jié)構(gòu)，同樣也能與多種金屬離子(如Cu2+,Pt2+,Hg2+,Re3+等)配位，形成穩(wěn)定的配合物[14-19]。二甲基姜黃素[1，7-二(3,4-甲氧基苯基)-1，6-庚二烯-3，5-二酮]作為天然姜黃素重要的衍生物之一，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗過敏等藥理作用，特別是對前列腺癌有抑制作用[20-21]，且具有較低的毒副作用。因此，本文基于二甲基姜黃素的配位性能及其低毒性，開發(fā)了新型的分子探針，并研究了其對各種金屬離子的識別性能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該探針對Fe3+具有很好的選擇性識別性能，且識別過程不受其它金屬離子干擾。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

姜黃素(純度≥97%，阿拉丁有限公司)，碘甲烷(純度≥99%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，氘代試劑(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)，其他試劑和所有的金屬鹽均為國產(chǎn)分析純。

Brucker ARX-300MHz 核磁共振儀(300 MHz，瑞士布魯克公司，TMS為內(nèi)標(biāo))；Shimadzu LCMS-2020 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、Shimadzu UV-1700 紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)；Bruker ApexⅡ型X 射線單晶衍射儀(瑞士布魯克公司)。

1.2 探針L的合成

探針L的合成路線如圖1所示。稱取200 mg (0.54 mmol)姜黃素溶于36 mL無水丙酮中，加入100 mg (0.72 mmol)無水K2CO3和342 mg (2.41 mmol)碘甲烷，回流攪拌反應(yīng)6 h。反應(yīng)結(jié)束后加入15 mL二氯甲烷，水洗(2×10 mL)后用無水Na2SO4干燥。減壓蒸除溶劑后采用硅膠柱分離，二氯甲烷進(jìn)行洗脫，產(chǎn)物進(jìn)一步用干燥的乙腈結(jié)晶，得到黃色晶體。Yield：45%，m.p.129～131 ℃ (Lit.[22]129～130 ℃)。1H NMR (DMSO-d6，300 MHz)δ：3.81(s，6H)，3.83(s，6H)，6.12(s，1H)，6.85(d，J=15.9 Hz，2H)，7.01(d，J=8.4 Hz，2H)，7.27(d，J=8.4 Hz，2H) 7.36(d，J=1.5 Hz，2H)，7.59(d，J=15.9 Hz，2H)，16.35(s，1H);13C NMR(DMSO-d6，75 MHz)δ：56.0，101.5，110.8，112.1,122.5，123.4，128.0，140.9，149.5，151.4，183.7。 ESI-MSm/z(%)：397 [(M + H)+，100]。

圖1 探針L的合成路線Fig.1 The synthetic route to probe L

1.3 探針L晶體結(jié)構(gòu)的測定

選取大小為0.22 mm×0.20 mm×0.18 mm的單晶，置于Bruker Smart Apex-Ⅱ型CCD單晶衍射儀，在297(2) K 下采用石墨單色器單色化的MoKα射線(λ= 0.071 073 nm)，以ω-2θ掃描方式，在1.771°≤θ≤24.999°范圍內(nèi)共收集12 252個(gè)衍射點(diǎn)，其中獨(dú)立衍射點(diǎn)3 947(Rint=0.070 2)個(gè)。所有計(jì)算均由SHELXTL-97晶體結(jié)構(gòu)分析軟件包完成。主要晶體學(xué)數(shù)據(jù)列于表1。

表1 探針L的晶體學(xué)數(shù)據(jù)

CCDC：1 433 145

圖2 探針L在不同金屬離子存在下的紫外吸收光譜Fig.2 Ultraviolet spectrum of probe L in the presence of various metal ions

2 結(jié)果與討論

2.1 探針L對金屬離子的選擇性識別及抗干擾性

進(jìn)一步考察了常見的其他金屬離子和Fe3+共存時(shí)對體系中Fe3+識別的干擾情況。在10 mL探針L的甲醇-水溶液(10 μmol/L)中分別加入4 μL濃度為0.5 mol/L的Fe3+和其他金屬離子，觀察不同共存金屬離子對探針L識別Fe3+的影響。結(jié)果表明，當(dāng)有不同的金屬離子共存時(shí)，對探針L識別Fe3+的影響很小，說明探針L對Fe3+具有很好的選擇性識別能力和較高的抗干擾能力。這可能是由于Fe3+的半徑大小與探針L的空間結(jié)構(gòu)更加匹配，探針L會(huì)優(yōu)先與其結(jié)合。

2.2 pH值對探針L識別Fe3+的影響

圖3 探針L對Fe3+的Job曲線Fig.3 Job′s plot of probe L toward Fe3+[L]+[ Fe3+]=50 μmol/L

考察了pH 值對探針L與Fe3+作用的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)Fe3+存在時(shí)，探針在pH 3.0～7.6之間的吸收強(qiáng)度基本保持不變。當(dāng)pH 值高于7.6時(shí)，隨著pH值增大，體系的吸收強(qiáng)度不斷減弱。這是由于Fe3+在堿性條件下易沉淀，從而減少了其與探針L配位的數(shù)量。此外，探針L在堿性條件下結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易分解成類似于香蘭素和肉桂酸的系列化合物[25]。本實(shí)驗(yàn)選用Tris-HCl緩沖溶液將體系pH值調(diào)至7.2左右，以利于探針L用于生命體系中Fe3+的檢測。

2.3 Job曲線及紫外滴定

等摩爾Job法是測定配合物絡(luò)合比的常用方法[26]。本文固定金屬離子與配體的總濃度不變，以紫外吸收強(qiáng)度對金屬離子與配體比例作圖。將探針L和Fe3+的總濃度保持為50 μmol/L，改變Fe3+的摩爾分?jǐn)?shù)。結(jié)果顯示，波長362 nm處的紫外吸收強(qiáng)度隨探針L和Fe3+摩爾比的變化而變化(如圖3)。當(dāng)Fe3+的摩爾分?jǐn)?shù)為0.5時(shí)，探針L和Fe3+的絡(luò)合物在362 nm處出現(xiàn)最大的紫外吸收強(qiáng)度，表明探針L與Fe3+為1∶1絡(luò)合。

紫外滴定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白探針L(10 μmol/L)在423 nm處出現(xiàn)最大吸收峰，隨著Fe3+的加入，在362 nm處出現(xiàn)1個(gè)新的吸收峰，且其吸收強(qiáng)度隨著Fe3+濃度的增加而增大，直至 Fe3+的濃度達(dá)到10 μmol/L后，362 nm處的吸收強(qiáng)度不再變化，進(jìn)一步證實(shí)了Fe3+與探針L的絡(luò)合比為1∶1。

2.4 結(jié)合常數(shù)及檢出限

確定探針L與Fe3+絡(luò)合模式屬于1∶1模型之后，按照Benesi-Hildebrand公式[27]：1/(A-Amin)=1/{K(Amax-Amin)[Fe3+]}+1/(Amax-Amin),計(jì)算得到探針L與Fe3+的結(jié)合常數(shù)，式中，K為探針L與Fe3+的結(jié)合常數(shù)，Amin代表空白探針L溶液的紫外吸收強(qiáng)度，Amax為在探針L溶液中加入過量Fe3+所產(chǎn)生的最大紫外吸收強(qiáng)度，A代表加入Fe3+后溶液的紫外吸收強(qiáng)度。以1/[Fe3+]為橫坐標(biāo)，1/(A-A0)為縱坐標(biāo)作圖，得到擬合曲線方程為y=1.831×10-5x-19.95，r2=0.992 9，其線性關(guān)系較好。根據(jù)該直線方程，并結(jié)合Benesi-Hildebrand公式，得到探針L與Fe3+的結(jié)合常數(shù)K=1.089×106L/mol，表明二甲基姜黃素對Fe3+有著較強(qiáng)的絡(luò)合能力。

探針L對不同濃度Fe3+的響應(yīng)結(jié)果顯示，在5.5×10-6～3×10-5mol/L濃度范圍內(nèi),探針L紫外吸收強(qiáng)度的增強(qiáng)(y)與Fe3+濃度(x，mol/L)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y=6 774.4x+ 0.145(r2=0.997 8)。以3σ(3倍空白的標(biāo)準(zhǔn)偏差)計(jì)算檢出限[28]，得到該探針L對Fe3+的LOD為2.2×10-6mol/L，表明探針L對Fe3+的識別作用具有較高的靈敏度。

圖4 探針L和Fe3+配合物的質(zhì)譜圖(ESI-MS，負(fù)離子掃描)Fig.4 MS spectrum of complex of probe L with Fe3+(ESI-MS，negative scan)

圖5 核磁滴定圖譜(DMSO-d6/D2O)Fig.5 1H NMR titration spectra in DMSO-d6/D2O

2.5 識別機(jī)理研究

由于探針L的晶體結(jié)構(gòu)中所有的非氫原子位于同一平面上，且由于分子內(nèi)氫鍵作用，L主要以烯醇式的結(jié)構(gòu)存在，說明L在對Fe3+識別過程中以烯醇式與Fe3+相互作用；此外，L與Fe3+形成的配合物的質(zhì)譜圖中,基峰m/z=555.95(100%)，對應(yīng)[L+FeCl3-H]-的峰(圖4)，證實(shí)探針L失去烯醇結(jié)構(gòu)中羥基上的質(zhì)子后與FeCl3以1∶1的計(jì)量比形成穩(wěn)定的絡(luò)合物。

圖6 探針L對Fe3+的識別過程與結(jié)合模型Fig.6 Recognition process and complex model for the probe L toward Fe3+

3 結(jié) 論

本文以姜黃素和碘甲烷為原料合成了低毒的藥物分子二甲基姜黃素L，并以此作為Fe3+檢測的分子探針。研究結(jié)果表明，L在甲醇-水溶液(9∶1，Tris-HCl緩沖溶液，pH 7.2)中對Fe3+具有較好的選擇識別性能、抗干擾能力和靈敏度。紫外滴定和質(zhì)譜分析結(jié)果確證探針L與Fe3+形成了1∶1配合物，結(jié)合常數(shù)為K=1.089×106L/ mol。在Fe3+濃度為5.5×10-6～3×10-5mol/L范圍內(nèi)，該識別體系具有較好的線性關(guān)系，可定量檢出Fe3+的濃度。通過對探針L的晶體結(jié)構(gòu)、配合物的質(zhì)譜及核磁滴定研究，提出了探針L與Fe3+的結(jié)合模型和識別機(jī)理，為其在生物體內(nèi)的潛在應(yīng)用提供了參考依據(jù)。

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Study on Selective Recognition of Di-O-methylcurcumin toward Fe3+Ion

LI Zheng-yi1，YAN Jin-bei1，YIN Yue1，XU De-feng2，SUN Xiao-qiang1*

(1.Institute of Petrochemical Engineering，Changzhou University，Changzhou 213164，China；2.School of Pharmaceutical Engineering & Life Science，Changzhou University，Changzhou 213164，China)

The di-O-methylcurcumin L as a molecular probe was directly synthesized by using curcumin and iodomethane.The title compound was characterized by X-ray single-crystal diffraction,1H NMR，13C NMR and ESI-MS.The crystal structure of the compound belongs to monoclinic system with a space group of C2/c.The cell parameters were as follows：a=22.317(6) nm,b=8.703 8(19) nm，c=23.039(5) nm，β=93.378(10) °，V=4 467.4(18) nm3，Z=4，Dc=1.206 g·cm-3，F(xiàn)(000)=1 720，μ(MoKα)=0.088 mm-1，R=0.080 9，ωR=0.216 3.The probe L exhibited a selective and sensitive absorption response toward Fe3+over a wide range of metal ions in ethanol-water solution(9∶1，Tris-HCl buffer，pH 7.2).The results of ultraviolet titration and mass spectrometry showed that the probe L and Fe3+formed a 1∶1 complex,and the association constantKwas determined to be 1.089×106L/mol.The mothod showed good linearity(r2= 0.997 8) for Fe3+concontration in the range of 5.5×10-6- 3×10-5mol/L with a limit of detection of 2.2×10-6mol/L.

di-O-methylcurcumin;molecular probe;Fe3+ion;recognition;ultraviolet spectra

2016-03-26；

2016-04-29

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21572026，21002009)；江蘇省高校自然科學(xué)研究重大項(xiàng)目(14KJA150002)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.10.015

O657.32；O614.81

A

1004-4957(2016)10-1306-05

*通訊作者：孫小強(qiáng)，博士，教授，研究方向：超分子化學(xué)，Tel：0519-86330257，E-mail：sunxiaoqiang@yahoo.com