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        酶功能化聚多巴胺包覆納米普魯士藍(lán)的制備及電化學(xué)分析應(yīng)用

        2016-12-01 01:12:07王海寧馮濤濤洪成林
        分析測(cè)試學(xué)報(bào) 2016年10期
        關(guān)鍵詞:復(fù)合材料

        王海寧,齊 譽(yù),孫 昭,馮濤濤,洪成林

        (石河子大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院 新疆兵團(tuán)材料化工工程技術(shù)研究中心,新疆維吾爾自治區(qū)教育廳高校材料化工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 石河子 832003)

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        酶功能化聚多巴胺包覆納米普魯士藍(lán)的制備及電化學(xué)分析應(yīng)用

        王海寧,齊 譽(yù)*,孫 昭,馮濤濤,洪成林*

        (石河子大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院 新疆兵團(tuán)材料化工工程技術(shù)研究中心,新疆維吾爾自治區(qū)教育廳高校材料化工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 石河子 832003)

        在納米金表面原位沉積普魯士藍(lán),然后在核殼結(jié)構(gòu)納米金-普魯士藍(lán)的表面包覆一層易氧化聚合的多巴胺保護(hù)膜,利用多巴胺聚合表面殘留的大量氨基和羥基進(jìn)一步將納米鉑粒子修飾于聚多巴胺膜表面制得普魯士藍(lán)-聚多巴胺-納米鉑多層納米復(fù)合材料。將此復(fù)合材料修飾于金電極表面,協(xié)同使用辣根過(guò)氧化物酶用于H2O2濃度的檢測(cè)。結(jié)果表明:聚多巴胺的引入有效增加了普魯士藍(lán)的穩(wěn)定性,增大了納米鉑的負(fù)載量以及辣根過(guò)氧化物酶的生物活性;由于普魯士藍(lán)、納米鉑和辣根過(guò)氧化物酶的多重信號(hào)放大作用,酶功能化納米復(fù)合材料修飾電極對(duì)H2O2表現(xiàn)出良好的電還原活性。優(yōu)化條件下,對(duì)H2O2的檢測(cè)范圍為2.0×10-7~1.0×10-3mol·L-1,檢出限(S/N=3)為1.2×10-7mol·L-1。

        過(guò)氧化氫傳感器;納米復(fù)合材料;普魯士藍(lán);聚多巴胺;辣根過(guò)氧化物酶

        新型納米復(fù)合材料由于具有較大的比表面積,較高的表面反應(yīng)活性和催化效率等特性[1-2]而被越來(lái)越多地應(yīng)用于催化和電催化研究[3-4]。納米材料具有良好的生物相容性,酶功能化的納米復(fù)合材料具有特異性和高效的催化活性,因此其在電化學(xué)分析方面有著極大的應(yīng)用前景[5-6]。酶或酶功能化的納米電活性材料修飾于電極表面后其穩(wěn)定性和電催化活性的保持已經(jīng)成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一[7-8]。

        研究表明,納米普魯士藍(lán)(PB)具有優(yōu)良的電化學(xué)氧化還原活性,且對(duì)H2O2具有極強(qiáng)的催化活性,被譽(yù)為“人工過(guò)氧化物酶”[9-10]。然而,立方體結(jié)構(gòu)的PB容易流失,不易進(jìn)一步修飾,且pH值適應(yīng)范圍窄,使其應(yīng)用受到很大限制。多巴胺(DA)具有良好的氧化自聚合能力和優(yōu)良的生物相容性[11-13],能夠阻止PB的流失并增大其pH值適應(yīng)范圍,DA聚合成膜后表面殘留有大量的羥基和氨基[14],可與納米鉑粒子(Pt NPs)結(jié)合。Pt NPs不僅具有較大的比表面積和優(yōu)良的生物相容性,而且其對(duì)H2O2也有著獨(dú)特的催化活性[15-16]。

        本文首先在納米金表面原位沉積PB,然后利用DA易氧化自聚合的特性,在核殼結(jié)構(gòu)Au-PB的表面包覆一層聚多巴胺(PDA)保護(hù)膜,有效增強(qiáng)了PB的穩(wěn)定性和pH值適應(yīng)范圍。利用DA聚合表面殘留的大量氨基和羥基進(jìn)一步將Pt NPs修飾于PDA表面制得Au-PB-PDA-Pt多層納米復(fù)合材料,并對(duì)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)功能化的Au-PB-PDA-Pt復(fù)合材料的電化學(xué)性能進(jìn)行了探究。由于PB,Pt NPs和HRP對(duì)H2O2的協(xié)同催化作用,該復(fù)合材料修飾電極對(duì)H2O2表現(xiàn)出良好的電還原活性。

        1 實(shí)驗(yàn)部分

        1.1 儀器與試劑

        三氯化鐵(FeCl3·6H2O)、二氯化鐵(FeCl2·4H2O)、鐵氰化鉀(K4[Fe(CN)6]·3H2O)、硼氫化鈉、多巴胺(DA)、氯金酸(HAuCl4)、氯鉑酸(H2PtCl6·6H2O)購(gòu)于Alfa Aesar公司;辣根過(guò)氧化物酶(HRP)購(gòu)于上海江萊生物科技有限公司;其它試劑均為分析純?cè)噭?,?gòu)于成都市科隆化學(xué)品有限公司;實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

        Spectrumlab-54型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-Vis,上海譜元儀器有限公司);Hitachi H-600型透射電鏡(TEM,日本日立公司);D8 Advance型X射線衍射儀(XRD,德國(guó)布魯克公司)?;瘜W(xué)實(shí)驗(yàn)采用三電極系統(tǒng):工作電極為金電極(天津艾達(dá)科技發(fā)展有限公司,直徑4.0 mm),對(duì)電極為鉑絲電極,參比電極為飽和甘汞電極(SCE);循環(huán)伏安法(CV)、電流-時(shí)間法和電化學(xué)交流阻抗譜(EIS)測(cè)定均在Potentiostat/Galvanostat Model 283 型電化學(xué)綜合分析儀(美國(guó)阿美特克有限公司)上完成。

        1.2 Au-PB-PDA-Pt納米復(fù)合材料的制備

        Au NPs溶膠的制備:取0.6 mL 1%氯金酸水溶液分別加入40 mL預(yù)冷(4 ℃)的水和0.2 mL 0.2 mol ·L-1K2CO3溶液,在攪拌下加入適量新鮮配制的0.5 mg·mL-1NaBH4溶液,持續(xù)攪拌至溶液由藍(lán)紫色變?yōu)槌燃t色止,即制得Au NPs溶膠。

        Au-PB的制備:配制10 mL含有0.05 mol·L-1K3[Fe(CN)6]和10 mmol·L-1HCl的混合溶液,將其緩慢加入10 mL Au NPs溶膠中,持續(xù)超聲形成均一的混合溶液。再將2 mL 0.05 mol·L-1FeCl3溶液緩慢滴加至上述混合溶液中,并加入過(guò)量的H2O2溶液。室溫下超聲反應(yīng)1 h后離心分離,用超純水洗至中性,定容至10 mL,于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

        Au-PB-PDA的制備:取0.5 mL Au-PB懸濁液超聲10 min,加入40 mL含有60 mg多巴胺的pH 6.5 PBS溶液。在冰水浴中快速攪拌8 h以使多巴胺聚合在Au-PB納米粒子表面。離心分離后,用水洗至中性,定容至5 mL,于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

        Au-PB-PDA-Pt的制備:采用硼氫化鈉還原氯鉑酸制備Pt NPs。將4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的氯鉑酸水溶液在攪拌下緩慢滴加0.5 mL新鮮配制的0.1 mol·L-1NaBH4溶液,強(qiáng)攪拌反應(yīng)30 min后10 000 r/min離心分離,定容至4 mL得Pt NPs溶膠。將5 mL制備好的Au-PB-PDA溶液超聲10 min后,加入2 mL Pt NPs溶膠再次超聲10 min,離心分離后定容至2 mL得Au-PB-PDA-Pt溶膠,于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。Au-PB-PDA-Pt的制備流程如圖1A所示。

        本實(shí)驗(yàn)還制備了Au-PB-Pt和Au-PDA-Pt兩種納米復(fù)合材料以對(duì)比電化學(xué)性能差異。

        Au-PB-Pt的制備:取4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的氯鉑酸水溶液,攪拌下緩慢滴加0.5 mL新鮮配制的0.1 mol·L-1NaBH4溶液,強(qiáng)攪拌反應(yīng)30 min后10 000 r/min離心分離,定容至4 mL得Pt NPs溶膠。將5 mL制備好的Au-PB溶液超聲10 min后,加入2 mL Pt NPs溶膠再次超聲10 min,離心分離后定容至2 mL得Au-PB-Pt溶膠,于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

        Au-PDA-Pt的制備:取0.5 mL制備的Au溶膠,加入至40 mL含有60 mg多巴胺的pH 6.5 PBS溶液中。在冰水浴中快速攪拌8 h以使多巴胺聚合在Au NPs表面。離心分離,用超純水洗至中性,定容至5 mL。將5 mL制備好的Au-PDA溶液超聲10 min后,加入2 mL Pt NPs溶膠再次超聲10 min,離心分離后定容至2 mL得Au-PDA-Pt溶膠,于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

        圖1 Au-PB-PDA-Pt(A)和修飾電極(B)的制備過(guò)程Fig.1 Procedures for the fabrication of Au-PB-PDA-Pt nanocomposites(A) and the modified electrode(B)

        1.3 修飾電極的制備

        將金電極(GE,Φ=4 mm)分別用0.3 μm和0.05 μm的Al2O3粉末拋光成鏡面后,放入Piranha溶液(H2O2與H2SO4體積比為3∶7)中浸泡10 min,再依次用無(wú)水乙醇和水超聲清洗2 min[17-20]。取15 μL預(yù)先充分超聲分散的Au-PB-PDA-Pt溶膠滴在處理好的GE表面,于4 ℃冰箱放置晾干,水洗后移取15 μL 5 mg·mL-1的HRP溶液滴涂于修飾電極表面,放置在盛有少量水的燒杯上方于4 ℃冰箱吸附6 h。將電極取出后用水從電極側(cè)面沖洗掉表面的物理吸附粒子,得到GE/Au-PB-PDA-Pt/HRP,其制備過(guò)程如圖1B所示。本實(shí)驗(yàn)所用的其它納米粒子修飾電極均與GE/Au-PB-PDA-Pt/HRP的制備方法相同。

        圖2 不同納米復(fù)合材料的紫外可見(jiàn)光譜圖Fig.2 UV-Vis spectra of different nanocompositesa:Au;b:PB;c:Au-PB;d:Au&PB;e:Au-PB-PDA

        2 結(jié)果與討論

        2.1 納米復(fù)合材料的表征

        2.1.1 納米復(fù)合材料的UV-Vis表征 采用紫外可見(jiàn)光譜對(duì)復(fù)合材料制備過(guò)程中不同階段的納米材料進(jìn)行分析,結(jié)果見(jiàn)圖2。圖2a在530 nm處出現(xiàn)了Au NPs的特征吸收峰,圖2b在700 nm處出現(xiàn)了PB的特征吸收峰,且無(wú)其他雜峰,表明實(shí)驗(yàn)制備出較純的Au NPs和PB。Au-PB納米顆粒的紫外可見(jiàn)光譜(圖2c)只在700 nm處觀察到PB的特征吸收峰,作為對(duì)照Au NPs和PB混合溶膠的紫外可見(jiàn)光譜圖(圖2d)分別顯示出Au NPs和PB的特征吸收峰,說(shuō)明實(shí)驗(yàn)得到的Au-PB并非二者簡(jiǎn)單的混合物,可能是核殼型的Au-PB納米顆粒。圖2e在280 nm處出現(xiàn)了PDA的特征吸收峰,證明制備的Au-PB-PDA材料中PDA的存在。

        圖3 納米復(fù)合材料的TEM表征圖Fig.3 TEM images of different nanocompositesA:Au;B:Au-PB;C:Au-PB-PDA;D:Au-PB-PDA-Pt

        2.1.2 納米復(fù)合材料的TEM表征 圖3為納米復(fù)合材料制備過(guò)程的透射電鏡表征圖。由圖3A可以看出所制備的納米金粒徑分布在5~8 nm。所制備的Au-PB粒徑則明顯增大,達(dá)到70 nm左右,且主要為球形(圖3B),說(shuō)明PB成功包裹在Au NPs的表面。Au-PB進(jìn)一步包覆上PDA膜后,形貌有所改變,PDA膜清晰可見(jiàn)(圖3C)。由圖3D可以看出Au-PB-PDA表面已負(fù)載上一定量的Pt NPs,表明已成功制備了Au-PB-PDA-Pt納米復(fù)合材料。

        圖4 Au-PB(a)與Au-PB-PDA-Pt(b)的 XRD 表征圖Fig.4 XRD patterns of Au-PB(a) and Au-PB-PDA-Pt(b)

        圖5 不同納米材料修飾電極的循環(huán)伏安圖Fig.5 CV curves of different electrodes insert:EIS curves of different electrodes;0.1 mol/L PBS buffer(pH 6.5);a:bare GE;b:GE/Au-PB-PDA;c:GE/Au-PB-PDA-Pt;d:GE/Au-PB-PDA-Pt/HRP

        2.1.3 納米復(fù)合材料的 XRD 表征 圖4為納米復(fù)合材料的XRD表征結(jié)果。其中,圖 4a為 Au-PB復(fù)合材料的XRD圖,PB在 2θ為 17.54°,24.74°,35.52°和39.61°處出現(xiàn)了特征衍射峰,對(duì)應(yīng)PB晶面為(200),(220),(400) 和(420);未出現(xiàn)明顯的Au NPs特征峰,可能是由于Au NPs的量相對(duì)較少,被較強(qiáng)的PB特征峰掩蓋。圖4B為 Au-PB-PDA-Pt的XRD圖,除了PB的特征衍射峰外,新出現(xiàn)了 2θ為 46.29°,67.47°,81.36°和85.72°的衍射峰,同時(shí)2θ=39.61°處的衍射峰明顯增強(qiáng),分別對(duì)應(yīng)于Pt NPs的(200),(311),(222) 和(111)晶面,表明Pt NPs已在Au-PB-PDA復(fù)合物表面成功負(fù)載。

        2.2 修飾電極的電化學(xué)行為

        2.2.1 不同納米材料修飾電極的CV表征 圖5為納米材料修飾電極過(guò)程的循環(huán)伏安表征。由圖可見(jiàn),裸金電極表面無(wú)電活性材料,故未觀察到氧化還原峰(圖5a);而GE/Au-PB-PDA的CV曲線在PBS緩沖溶液中出現(xiàn)1對(duì)明顯的氧化還原峰(圖5b),其原因是修飾在金電極表面的Au-PB-PDA含有電化學(xué)活性物質(zhì)PB和導(dǎo)電性能優(yōu)良的Au NPs;GE/Au-PB-PDA-Pt產(chǎn)生的氧化還原峰電流進(jìn)一步增大(圖5c),這也是由于Pt NPs良好的導(dǎo)電性能及其較大的比表面積提高了復(fù)合材料的性能;而當(dāng)HRP被固載在電極表面后,HRP阻礙了電子在電極表面的傳遞,致使峰電流有所降低(圖5d)。

        2.2.2 不同納米材料修飾電極的EIS表征 進(jìn)一步考察了不同納米材料修飾電極的電化學(xué)交流阻抗譜圖(圖5插圖)。結(jié)果顯示,裸金電極表現(xiàn)出非常小的交流阻抗,當(dāng)被修飾上Au-PB-PDA之后,雖然有Au NPs的存在,但PDA較弱的導(dǎo)電性能依然使電極的阻抗出現(xiàn)較大增加。加入了Pt NPs的復(fù)合材料Au-PB-PDA-Pt修飾于電極表面之后,由于Pt NPs較大的比表面積與良好的電子傳遞性能使得交流阻抗值有所降低。HRP修飾于電極表面后由于其較弱的導(dǎo)電性能使得交流阻抗進(jìn)一步增大。這與納米材料修飾電極的CV表征結(jié)果一致。

        圖6 不同修飾電極對(duì)H2O2的循環(huán)伏安圖Fig.6 CV curves of different electrodes in 0.1 mol ·L-1pH 6.5 PBS with 0.1 mmol·L-1 H2O2a:GE/ Au-PB;b:GE/Au-PB-Pt;c:GE/Au-PB-PDA-Pt;d:GE/Au-PB-PDA-Pt/HRP

        圖7 GE/Au-PB-PDA-Pt/HRP修飾電極對(duì)H2O2的I~t響應(yīng)曲線Fig.7 Chronoamperometric response to H2O2additions on GE/Au-PB-PDA-Pt/HRP

        2.2.3 不同修飾電極對(duì)H2O2的CV響應(yīng) 考察了不同修飾電極對(duì)H2O2的CV響應(yīng)(圖6)。圖6a為GE/Au-PB在含有0.1 mmol·L-1H2O2的pH 6.5 PBS溶液中的CV曲線。在GE/Au-PB電極中引入對(duì)H2O2具有強(qiáng)催化性能的Pt NPs后表現(xiàn)出更強(qiáng)的催化活性(圖6b)。在電極中進(jìn)一步引入聚多巴胺(GE/Au-PB-PDA-Pt)后,增大了Pt NPs的分散性與負(fù)載量,同時(shí)增強(qiáng)了PB的穩(wěn)定性,因此表現(xiàn)出更強(qiáng)的催化活性(圖6c)。而具有生物催化活性的HRP的使用使還原峰電流進(jìn)一步增大(圖6d),表明該修飾電極對(duì)H2O2的催化還原能力得到了進(jìn)一步增強(qiáng)。

        2.2.4 pH值對(duì)電極性能的影響 檢測(cè)液的pH值是影響生物酶分子HRP活性和電子媒介體PB穩(wěn)定性的重要因素。因此,考察了GE/Au-PB-PDA-Pt/HRP在 pH 4.0~9.0范圍內(nèi) PBS 緩沖液中的CV響應(yīng)情況。結(jié)果顯示,還原峰電流隨著pH值的增加而增大,pH 6.0時(shí)峰電流達(dá)到最大值,此后還原峰電流隨著pH值的增加而降低,故選擇pH 6.0的PBS為傳感器的檢測(cè)底液。

        2.2.5 工作電位對(duì)響應(yīng)電流的影響 在-0.45~0.05 V范圍內(nèi),考察了工作電位對(duì)修飾電極性能的影響,繪制了不同電位下傳感器在每次加入0.1 mmol·L-1H2O2的I~t曲線。不同工作電位下對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線以及標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與其對(duì)應(yīng)電位的折線圖顯示,工作電位在-0.35 V時(shí)修飾電極表現(xiàn)出最大的靈敏度。因此實(shí)驗(yàn)選擇工作電位為-0.35 V。

        2.2.6 不同修飾電極對(duì)H2O2電催化活性的比較 比較了GE/ Au-PDA-Pt,GE/ Au-PB-PDA,GE/Au-PB-PDA-Pt和GE/Au-PB-PDA-Pt/HRP對(duì) H2O2的I~t響應(yīng)曲線。結(jié)果表明,PB NPs和Pt NPs對(duì)H2O2均有一定的電催化活性,兩者的協(xié)同作用表現(xiàn)出更強(qiáng)的催化活性,傳感器靈敏度有了很大的提高,而HRP作為一種具有高催化活性的生物酶,其應(yīng)用進(jìn)一步提高了傳感器的靈敏度。

        2.2.7I~t法檢測(cè)H2O2濃度 在最佳檢測(cè)條件下,考察了傳感器對(duì)H2O2的檢測(cè)性能。由圖7可見(jiàn),傳感器對(duì)H2O2的線性回歸方程為I=7.753+32 913cH2O2,r2=0.998 0 。線性范圍為2.0×10-7~1.0×10-3mol ·L-1,檢出限(S/N=3)為1.2×10-7mol·L-1。該傳感器性能優(yōu)良,這主要得益于PB NPs優(yōu)良的電化學(xué)活性,PDA良好的生物相容性和對(duì)Pt NPs良好的分散吸附性能;而Pt NPs的引入不僅增強(qiáng)了修飾電極表面的電子傳導(dǎo)能力,還極大提高了對(duì)H2O2的催化活性。由于PB,Pt NPs和HRP對(duì)H2O2的協(xié)同催化作用,該復(fù)合材料構(gòu)建的H2O2傳感器具有更高的靈敏度。

        3 結(jié) 論

        本文成功制備了Au-PB-PDA-Pt多層納米復(fù)合材料,并將HRP功能化的Au-PB-PDA-Pt修飾電極用于H2O2濃度的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),PDA的引入有效增加了PB的穩(wěn)定性、Pt NPs的負(fù)載量和后續(xù)HRP的生物活性;由于PB,Pt NPs和HRP對(duì)H2O2的協(xié)同催化作用,酶功能化納米復(fù)合材料修飾電極對(duì)H2O2表現(xiàn)出良好的電還原活性。該H2O2傳感器成本低廉,所使用的納米復(fù)合材料制備過(guò)程簡(jiǎn)便,有望應(yīng)用于生物體中H2O2的分析檢測(cè)。

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        [20] Zhu Y P,Yuan R,Chai Y Q,Qin S,Yuan Y L.Chin.J.Anal.Chem.(朱宇萍,袁若,柴雅琴,覃松,袁亞利.分析化學(xué)),2012,40(3):359-364.

        Preparation and Electrochemical Analysis Application of Enzyme-functionalized Prussia Blue-Polydopamine-Platinum Nanocomposites

        WANG Hai-ning,QI Yu*,SUN Zhao,F(xiàn)ENG Tao-tao,HONG Cheng-lin*

        ( Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering of Xinjiang Uygur Autonomous Region,Engineering Research Center of Materials-Oriented Chemical Engineering of Xinjiang Bingtuan,School of Chemistry and Chemical Engineering,Shihezi University,Shihezi 832003,China)

        In this paper,prussian blue(PB) coated gold nanoparticles(Au NPs) were firstly prepared by in situ method.Then,polydopamine(PDA) wrapped Au-PB was synthesized based on the characteristic of one-step oxidative polymerization of dopamine.The bioinspired surface enriched amino and hydroxyl groups were further used as a support to anchor active platinum nanoparticles(Pt NPs).Horseradish peroxidase(HRP) functionalized Au-PB-PDA-Pt nanocomposites was also used for the fabrication of H2O2biosensor.By taking advantages of the excellent biocompatibility and film forming ability of PDA,the large surface area and high biocompatibility of Pt NPs,and the synergistic employ of PB,Pt and HRP,the HRP functionalized nanocomposites modified electrode exhibited an excellent electroreduction activity to H2O2.Under the optimum conditions,the linear detection range from 2.0×10-7-1.0×10-3mol·L-1was observed,and a detection limit was 1.2×10-7mol·L-1.

        H2O2sensor;nanocomposites;prussia blue;polydopamine;horseradish peroxidase

        2016-04-02;

        2016-05-09

        國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21065009);教育部重點(diǎn)資助項(xiàng)目(210251);兵團(tuán)重點(diǎn)領(lǐng)域創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃(2015BD003)

        10.3969/j.issn.1004-4957.2016.10.012

        O657.1;O625.524

        A

        1004-4957(2016)10-1289-06

        *通訊作者:洪成林,教授,研究方向:納米材料和電化學(xué)分析,Tel:0993-2057270,E-mail:hcl_tea@shzu.edu.cn

        齊 譽(yù),研究方向:有機(jī)及電化學(xué)分析,Tel:0993-2057270,E-mail:qy_01tea@shzu.edu.cn

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