曹亞青,宋 歌,王曼曼，王學(xué)生*，艾連峰*

(1.華北理工大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，河北 唐山 063000；2.河北出入境檢驗(yàn)檢疫局，河北 石家莊 050000)

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TurboFlow在線凈化/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定動(dòng)物源性食品中聚醚類(lèi)抗生素的研究

曹亞青1,宋 歌2,王曼曼1，王學(xué)生1*，艾連峰2*

(1.華北理工大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，河北 唐山 063000；2.河北出入境檢驗(yàn)檢疫局，河北 石家莊 050000)

建立了TurboFlow在線凈化/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速同時(shí)測(cè)定牛奶、雞肉和雞蛋中拉沙洛菌素、鹽霉素、莫能菌素、甲基鹽霉素、馬杜霉素和尼日利亞菌素殘留的方法。樣品提取液經(jīng)在線凈化柱Cyclone-p凈化，Thermo Scientific Hypersil-Gold C8(150 mm × 2.1 mm，5 μm)色譜柱分離，電噴霧正離子模式測(cè)定，整個(gè)分析過(guò)程僅13 min。方法在1～100 μg/L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系(r≥0.999)，定量下限為1 μg/kg，在動(dòng)物源性食品中3個(gè)加標(biāo)水平下的回收率為71.9%～109.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～14.9%。

TurboFlow在線凈化；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；聚醚類(lèi)抗生素；動(dòng)物源性食品

聚醚類(lèi)抗生素(Polyether antibiotics)又名離子載體抗生素，作為高效、廣譜的抗球蟲(chóng)藥和促生長(zhǎng)劑已廣泛應(yīng)用于畜禽飼養(yǎng)業(yè)。然而聚醚類(lèi)抗生素的不合理使用會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物產(chǎn)品中的獸藥殘留，從而危害食用者的健康。加拿大、美國(guó)、日本和中國(guó)對(duì)食品中聚醚類(lèi)抗生素的最大殘留限量進(jìn)行了嚴(yán)格規(guī)定，低至0.008 mg/kg；歐盟規(guī)定在飼料中禁止使用莫能菌素、鹽霉素[1-3]。我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，日常獸藥殘留檢測(cè)工作繁重。因此，建立準(zhǔn)確、快速的動(dòng)物源性食品中聚醚類(lèi)抗生素的殘留分析方法十分必要。

目前，聚醚類(lèi)抗生素殘留檢測(cè)主要采用液相色譜法(HPLC)和液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)[4-8]。但由于食品組成復(fù)雜，且被分析物處于痕量狀態(tài)，需富集才能檢出，因此，樣品前處理成為食品分析過(guò)程中的必要環(huán)節(jié)。通常，樣品預(yù)處理占用整個(gè)分析方法所用時(shí)間的2/3；對(duì)于聚醚類(lèi)抗生素前處理目前多采用離線的固相萃取法，步驟較多、耗時(shí)，易出現(xiàn)人為操作誤差和污染。TurboFlow在線凈化技術(shù)結(jié)合了擴(kuò)散、化學(xué)和體積排阻的原理，凈化柱為第一維色譜柱系統(tǒng)，樣品通過(guò)凈化柱凈化、富集后進(jìn)入切換閥的接口，經(jīng)捕集后，切換進(jìn)入分析柱(第二維色譜柱)和檢測(cè)器，即在捕獲目標(biāo)分析物的同時(shí)快速凈化樣品。同時(shí)，商品化的凈化柱可重復(fù)使用，簡(jiǎn)化了前處理操作，降低了測(cè)定成本。由于方法簡(jiǎn)單快速，自動(dòng)化程度高，該技術(shù)已成功用于食品中化學(xué)污染物的分析測(cè)定[9-16]。

本文采用TurboFlow在線凈化技術(shù)進(jìn)行樣品預(yù)處理，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行分離檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)了動(dòng)物源性食品中聚醚類(lèi)抗生素殘留的分析，方法簡(jiǎn)便、靈敏度高，可用于動(dòng)物源性食品中聚醚類(lèi)抗生素的快速定性定量分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

TurboFlow在線凈化液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(LC-MS/MS，美國(guó)Thermo Fisher公司)：包括CTC多功能自動(dòng)進(jìn)樣器、兩個(gè)四元梯度液相泵、六通閥切換裝置、多元柱切換裝置和TSQ Quantum Ultra三重四極桿質(zhì)譜儀。AH-20全自動(dòng)均質(zhì)器(中國(guó)?？苾x器有限公司)；3K15高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)。

乙腈、丙酮、甲醇(色譜純，美國(guó)Fisher 公司)。聚醚類(lèi)抗生素標(biāo)準(zhǔn)品：拉沙洛菌素(純度98.0%)、鹽霉素(75.5%)、莫能菌素(98.0%)、馬杜霉素(85.5%)均購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；甲基鹽霉素(98.0%)購(gòu)自加拿大TRC公司；尼日利亞菌素(98.0%)購(gòu)自英國(guó)Apollo Scientific Limited公司；用甲醇配制濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，冷藏、避光保存。

1.2 樣品前處理

稱(chēng)取牛奶、均質(zhì)的雞肉和雞蛋樣品5 g(精確至0.01 g)于50 mL離心管中，加入15 mL乙腈和5 g無(wú)水硫酸鈉。雞肉和雞蛋樣品均質(zhì)提取1 min，牛奶渦旋振蕩提取1 min；樣品以10 000 r/min離心10 min后用10 mL乙腈再次提取，合并上清液，分取5 mL上清液氮吹至干，準(zhǔn)確加入1 mL甲醇-水(體積比8∶2)溶解殘?jiān)?，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，待測(cè)。

圖1 在線凈化模式及流路模式切換圖Fig.1 The modes of on-line SPE systemA：loading and washing；B：eluting

1.3 在線凈化色譜條件

在線凈化程序包括凈化(上樣泵)和分離(分析泵)，凈化步驟主要靠其配置的四元耐壓泵驅(qū)動(dòng)，樣品在凈化柱上凈化和富集；經(jīng)過(guò)以上步驟后，通過(guò)閥切換技術(shù)，將凈化后的物質(zhì)在分析柱上進(jìn)行分離和分析，程序中各步所用流路模式見(jiàn)圖1。以Cyclone-p柱(50 mm× 0.5 mm，60 μm)為固相萃取柱，流動(dòng)相A為0.5%甲酸水溶液，B為乙腈，C為丙酮-乙腈-異丙醇(體積比1∶1∶1)，進(jìn)樣體積為50 μL。分析柱為T(mén)hermo Scientific Hypersil-Gold C8(150 mm×2.1 mm，5 μm)，流動(dòng)相A為0.5%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈。在線凈化程序見(jiàn)表1，其中凈化過(guò)程(OCC)在程序中每步的變化采用瞬變模式，而HPLC采用漸變模式。整個(gè)分析時(shí)間需13 min，在2.5 min開(kāi)始至第3 min切入質(zhì)譜系統(tǒng)。

1.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)，溫度：300 ℃；毛細(xì)管電壓：3 200 V；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)正離子掃描模式；鞘氣壓力：30 units；輔助氣壓力：5 units；離子源溫度：320℃；源內(nèi)誘導(dǎo)解離電壓：10 V；Q1,Q3單位分辨率：0.7 U；其他測(cè)定條件見(jiàn)表2。

表1 在線凈化和液相色譜-質(zhì)譜分析動(dòng)物源性食品中聚醚類(lèi)抗生素的實(shí)驗(yàn)條件

表2 分析物的保留時(shí)間和MRM分析質(zhì)譜參數(shù)

*quantitative ion

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件優(yōu)化

聚醚類(lèi)抗生素易溶于中等極性有機(jī)溶劑，因此實(shí)驗(yàn)分別采用甲醇、乙腈、乙酸乙酯和異辛烷作為提取溶劑進(jìn)行提取。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇、乙酸乙酯和異辛烷提取的雜質(zhì)較多，回收率均達(dá)不到80%，而選用乙腈提取時(shí)回收率均大于70%，因此選擇乙腈作為提取溶劑。

2.2 TurboFlow凈化條件的建立

TurboFlow在線凈化過(guò)程主要包括上樣、洗脫、轉(zhuǎn)移和淋洗步驟。實(shí)驗(yàn)采用不接分析柱，分流進(jìn)入質(zhì)譜方式優(yōu)化各步條件。考慮到聚醚類(lèi)化合物屬中等弱極性化合物，所以選擇具有類(lèi)似反相柱性質(zhì)的Cyclone-p為凈化柱，分別考察了甲酸(0.5%和0.1%)水溶液、10 mmol/L乙酸銨溶液以及10 mmol/L乙酸銨-0.1%乙酸水溶液作為上樣流動(dòng)相時(shí)對(duì)6種聚醚類(lèi)抗生素的影響。結(jié)果顯示，6種聚醚類(lèi)抗生素在以上流動(dòng)相條件下均能有效保留，當(dāng)以0.5%甲酸水溶液為上樣液時(shí)，6種聚醚類(lèi)抗生素的峰形最佳、響應(yīng)值最高，即上樣損失率最低，所以選擇0.5%甲酸水溶液作為上樣流動(dòng)相。

實(shí)驗(yàn)考察了不同比例的乙腈和0.5%甲酸水溶液流動(dòng)相對(duì)目標(biāo)化合物的洗脫效果。結(jié)果顯示極性最大的拉沙洛菌素需使用100%乙腈才能洗脫完全，故采用乙腈作為洗脫溶劑。

2.3 分離條件的建立

凈化柱洗脫下的目標(biāo)物通過(guò)分析柱進(jìn)行分離，凈化過(guò)程的洗脫液和分離時(shí)HPLC流動(dòng)相的初始比例會(huì)影響目標(biāo)化合物的峰形及分離度。實(shí)驗(yàn)分別選擇0.5%甲酸水溶液、0.1%甲酸水溶液、10 mmol/L乙酸銨溶液以及10 mmol/L乙酸銨-0.1%乙酸水溶液作為水相，有機(jī)相分別為甲醇和乙腈，進(jìn)行流動(dòng)相的選擇實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以0.5%甲酸水溶液為水相，乙腈為有機(jī)相，采用時(shí)間梯度洗脫條件時(shí)(表1)，6種化合物的峰形最佳。

2.4 線性范圍與基質(zhì)效應(yīng)

選用牛奶、雞蛋和雞肉空白基質(zhì)溶液配制濃度在1～100 ng/mL范圍的基質(zhì)加標(biāo)溶液及相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以分析物的峰面積(y)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中被測(cè)組分的濃度(x，μg/L)作圖。以基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線斜率的比值(Ratio of slope)來(lái)考察基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)弱，當(dāng)兩者斜率的比值高于1.2或低于0.8時(shí)說(shuō)明基質(zhì)效應(yīng)較強(qiáng)，影響結(jié)果的定量。以雞蛋樣品為例(如表3)，未使用在線凈化柱時(shí)，基質(zhì)對(duì)分析物的響應(yīng)具有抑制作用，響應(yīng)值變低。使用在線凈化柱后，分析物具有基質(zhì)增強(qiáng)或抑制作用，但明顯優(yōu)于未使用在線凈化柱，且經(jīng)過(guò)在線凈化柱后，所有化合物的線性相關(guān)系數(shù)均有提高，說(shuō)明在線凈化柱具有一定的凈化效果。由于6種分析物斜率的比值大部分高于1.2或低于0.8，表明未能完全消除基質(zhì)效應(yīng)影響，所以實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配曲線來(lái)校正結(jié)果。

表3 雞蛋基質(zhì)溶液使用凈化柱與未使用凈化柱的凈化效果對(duì)比

2.5 回收率、精密度及定量下限

在優(yōu)化條件下，選擇1，5，10 μg/kg 3個(gè)濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)水平平行6個(gè)樣品，得方法回收率為71.9%～109.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.5%～14.9%(見(jiàn)表4)。

表4 方法回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

計(jì)算得方法的定量下限(LOQ，S/N=10)為1 μg/kg，可滿(mǎn)足我國(guó)對(duì)聚醚類(lèi)抗生素所規(guī)定的最大殘留限量的測(cè)定要求。以牛奶樣品為例，圖2為空白牛奶樣品加標(biāo)1 μg/kg聚醚類(lèi)抗生素的MRM色譜圖，說(shuō)明該方法能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)動(dòng)物源性食品中的6種聚醚類(lèi)抗生素。

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

將該方法用于28份樣品的日常檢測(cè)，1份雞肉樣品中檢出馬杜霉素，其含量為5±0.5 μg/kg(n=3)，低于我國(guó)規(guī)定的動(dòng)物源性食品中聚醚類(lèi)抗生素的最高殘留限量。

3 結(jié) 論

本文建立了基于TurboFlow在線凈化技術(shù)對(duì)動(dòng)物源性食品中聚醚類(lèi)抗生素的檢測(cè)方法，滿(mǎn)足了國(guó)內(nèi)外對(duì)該類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)要求。方法快速，僅需13 min，極大地節(jié)約了前處理時(shí)間，自動(dòng)化程度高，凈化柱能夠重復(fù)使用(高于1 000針)，有利于大批量樣品的處理，保證了方法的穩(wěn)定性及準(zhǔn)確性。

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Rapid Determination of Polyether Antibiotics Residues in Animal-originated Foodstuffs Using TurboFlow On-line Clean-up Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

CAO Ya-qing1， SONG Ge2， WANG Man-man1， WANG Xue-sheng1*， AI Lian-feng2*

(1.School of Public Health，North China University of Science and Technology，Tangshan 063000，China；2. Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantion Bureau，Shijiazhuang 050000，China )

A new method using TurboFlow online cleanup combined with tandem mass spectrometry was developed for the rapid and simultaneous determination of six polyether antibiotics residues,e.g.lasalocid,salinomicin,monensin,narasin,maduramycin and nigericin in animal-originated foods of animal origin.The milk，chicken and egg samples were extracted with acetonitrile，and the extracts were purified on a Cyclone-p column.After being eluted from the clean-up column，the analytes were separated on a Thermo Scientific Hypersil-Gold C8(150 mm×2.1 mm，5 μm) column and detected by electrospray mass spectrometry in positive ionization mode with multiple reaction monitoring.Under the optimized conditions，the linear ranges of six polyether antibiotics were in the range of 1-100 μg/L with correlation coefficients higher than 0.999.The limits of quantitation(LOQ) for all samples were 1 μg/kg.The recoveries from milk，chicken and egg samples were in the range of 71.9%-109.0% with relative standard deviations of 1.5%-14.9%.Key words：TurboFlow on-line cleanup；liquid chromatography-tandem mass spectrometry；polyether antibiotics；animal-originated foodstuffs

2016-03-17；

2016-04-07

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21305028)；河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(B2013209238，H2016209018)；河北省教育廳自然科學(xué)項(xiàng)目(Q2012155)；國(guó)家質(zhì)檢總局項(xiàng)目(2013IK154，2014IK092)

研究簡(jiǎn)報(bào)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.10.009

O657.63;O616.73

A

1004-4957(2016)10-1273-05

*通訊作者：王學(xué)生，碩士，教授，研究方向：衛(wèi)生化學(xué)，Tel：0315-2592086，E-mail：xswang64@163.com

艾連峰，博士，研究方向：食品安全，Tel：0311-85980745，E-mail：ai_lianfeng@126.com