伍華雯，郭 平，張遠(yuǎn)芳，曾 贊，萬建春，占春瑞

(1.江西出入境檢驗(yàn)檢疫局 綜合技術(shù)中心，江西 南昌 330035；2.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150040)

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高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定供港生豬尿液中29種限用獸藥殘留

伍華雯1*，郭 平1，張遠(yuǎn)芳1，曾 贊2，萬建春1，占春瑞1

(1.江西出入境檢驗(yàn)檢疫局 綜合技術(shù)中心，江西 南昌 330035；2.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150040)

建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)同時(shí)測定生豬尿液中喹諾酮類、磺胺類、磺胺增效劑、四環(huán)素類、林可胺類、大環(huán)內(nèi)脂共29種限用獸藥殘留量的檢測方法。試樣經(jīng)乙酸銨和EDTA-Na緩沖液提取，HLB固相萃取小柱凈化后，HPLC-MS/MS進(jìn)行測定，其中β-受體激動(dòng)劑類用內(nèi)標(biāo)法定量，其余獸藥用外標(biāo)法定量。在電噴霧電離正離子模式下，以多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方式采集數(shù)據(jù)進(jìn)行定性與定量分析。29種獸藥在豬尿基質(zhì)中標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性系數(shù)(r)均大于0.99，3個(gè)不同加標(biāo)水平下的平均回收率為58%～108%，日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.9%～18.9%，日間RSD為3.4%～20.9%；定量下限(LOQ，S/N≥10)為1.0～10.0 μg/L。該方法經(jīng)濟(jì)、高效、可靠，可用于生豬屠宰前獸藥多殘留的快速檢測。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)；生豬尿液；限用獸藥；多殘留

隨著贛港經(jīng)貿(mào)的快速發(fā)展，江西對港出口呈連續(xù)增長趨勢，供港生豬尤為明顯，目前年供應(yīng)量已居全國前列，香港市場約30%豬肉來自江西。香港對進(jìn)口農(nóng)副產(chǎn)品有嚴(yán)格質(zhì)量要求，《食物內(nèi)有害物質(zhì)規(guī)例》中規(guī)定了生豬的46種獸藥限量標(biāo)準(zhǔn)，在一定程度上給江西供港生豬企業(yè)帶來障礙。目前，生豬體內(nèi)獸藥殘留監(jiān)控主要通過尿液檢測來實(shí)現(xiàn)，但我國豬尿中獸藥多殘留檢測標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)重缺乏，參考方法存在通量低的不足，難以滿足生豬供港快速通關(guān)要求。

目前采用液相色譜法、高效液相色譜法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定動(dòng)物源性食品中獸藥殘留已有較多報(bào)道[1-5]。而在獸藥殘留檢測基質(zhì)趨于多樣化的當(dāng)下，豬尿中獸藥殘留的研究多為β-受體激動(dòng)劑方面的檢測[6]。雖有同時(shí)測定多種獸藥殘留的方法報(bào)道[7-16]，但同時(shí)對豬尿中喹諾酮類、磺胺類、磺胺增效劑、林可胺類、大環(huán)內(nèi)酯類5大類藥物殘留檢測技術(shù)的研究尚未見報(bào)道。本研究采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測生豬尿液中29種限用藥物的殘留量，以期實(shí)現(xiàn)生豬屠宰前獸藥多殘留的快速檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

API4000+三重四極桿液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國AB Sciex公司)，配30A系列高效液相色譜儀(日本島津公司)；電子天平(德國Sartorius公司，感量0.01 g和0.1 mg)；旋渦混合器(德國IKA公司)；Eppendorf 5430R 冷凍高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；N-EVAP 112氮吹濃縮儀(美國Organomatian Associates公司)；Visiperp DL固相萃取裝置(美國Supelco公司)；KQ-600B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SI G560E型旋渦混合器(美國Scientific Industries公司)；pH計(jì)(美國Mettler Toledo公司)；Waters ACQUITY UPLC BEH RP C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，粒徑1.7 μm，美國Waters公司)。

生豬尿樣采自養(yǎng)殖場；陰性豬尿樣品采自養(yǎng)殖場中未給藥的生豬，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室處理后上機(jī)測定，所得譜圖與標(biāo)準(zhǔn)溶液的譜圖進(jìn)行比對加以確證。

甲醇、乙腈(HPLC純，德國Merck公司)；甲酸(HPLC 純，上海安普公司)；甲酸銨(HPLC 純，瑞士Sigma-Aldrich 公司)；無水乙酸銨(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；氨水、乙二胺四乙酸鈉(分析純，廣州西隴化工化學(xué)試劑有限公司)；HLB固相萃取小柱(500 mg，6 mL，美國Waters公司)；Milli-Q超純水(GB/T6682 規(guī)定的一級(jí)水)。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：29種獸藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度在93.0%～99.0%范圍內(nèi)，均購于德國Dr.Ehrenstorfer公司。

標(biāo)準(zhǔn)溶液：1.0 g/L，取適量上述29種獸藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別用甲醇溶解配制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，-18 ℃保存于棕色玻璃瓶中。使用前以甲醇稀釋成合適濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

提取液：稱取15.4 g乙酸銨，加水溶解并定容至1 L，混勻，用乙酸調(diào)至pH 5.2，得到0.2 mol/L乙酸銨溶液；稱取37.2 g乙二胺四乙酸二鈉，加水溶解并定容至1 L，混勻后即得0.1 mol/L EDTA-2Na。

流動(dòng)相：準(zhǔn)確稱取0.315 3 g甲酸銨，加800 mL水溶解，準(zhǔn)確加入1 mL甲酸，用水定容至1 L，搖勻，得到5 mmol/L甲酸銨(含0.1%甲酸)。

溶解液：乙腈-流動(dòng)相(2∶8，體積比)。

1.2 樣品預(yù)處理

1.2.1 樣品提取及凈化 準(zhǔn)確移取(2±0.05) mL試樣，置于50 mL具塞聚丙烯離心管中，加6 mL 0.2 mol/L乙酸銨緩沖溶液(乙酸調(diào)至pH 5.2)和6 mL 0.1 mol/L EDTA溶液，渦旋，4 500 r/min離心5 min。

上清液轉(zhuǎn)入HLB固相萃取柱(預(yù)先經(jīng)5 mL甲醇、5 mL水活化)，依次用5 mL水、5 mL 0.5%的氨水、5 mL甲醇水(1∶9)淋洗小柱，真空抽干小柱，再依次用5 mL甲醇、5 mL濃氨水-甲醇(5∶95)洗脫，洗脫液于40 ℃下氮?dú)獯蹈?，?zhǔn)確加入1 mL溶解液復(fù)溶，超聲，渦旋均勻，過0.22 μm濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。

1.2.2 空白基質(zhì)溶液的制備 準(zhǔn)確移取(2±0.05) mL陰性豬尿試樣，按“1.2.1”操作步驟進(jìn)行處理。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜條件 柱溫45 ℃;流速200 μL/min；進(jìn)樣體積5 μL；流動(dòng)相：A為5 mmol/L甲酸銨(含0.1%的甲酸)，B為乙腈。梯度洗脫程序：0～2 min，20%B；2～3 min，線性遞增至24%B；3～5 min線性遞增至28%B；5～5.5 min，保持28%B；5.5～7 min，線性遞增至32%B；7～10.5 min，線性遞增至36%B；10.5～12 min，線性遞增至95%B；12～12.01 min，線性遞減至5%B；12.01～15 min，5%B。

1.3.2 質(zhì)譜條件 ESI正離子模式掃描(ESI+)，多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)，霧化氣壓力(GSI)：60 psi；輔助氣壓力：60 psi；氣簾氣壓力(CUR)：35 psi;離子源溫度：600 ℃；電噴霧壓力(IS)：5 500 V;單位分辨率掃描；碰撞氣體流速：中流速。

圖1 29種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of 29 analytes mixed standard solution

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜條件的選擇 因待測的化合物種類較多，采用普通C18色譜柱分離所需時(shí)間較長，故本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜柱Waters ACQUITY UPLCBEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)進(jìn)行分離。采用5 mmol/L甲酸銨(含0.1%甲酸)-乙腈作為流動(dòng)相，通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的洗脫梯度，各化合物的色譜峰分離良好，峰形尖銳。29種化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖如圖1所示。

2.1.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 去簇電壓(DP)和碰撞氣能量(CE)直接影響定性和定量離子的豐度，與方法的靈敏度密切相關(guān)[10]。本實(shí)驗(yàn)對0.2 mg/L的各化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描，結(jié)合各化合物的理化性質(zhì)，在Q1MS(Q1)模式下確定母離子，Product Ion(MS2)模式選定2個(gè)豐度較高、干擾較少的子離子分別作為定性和定量離子，并依次對各化合物子離子的去簇電壓(DP)、碰撞氣能量(CE)、入口電壓(EP)及碰撞室出口電壓(CXP)進(jìn)行優(yōu)化。其中EP和CXP基本在10～12 V左右，其余參數(shù)結(jié)果見表1。

表1 29種獸藥的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)質(zhì)譜相關(guān)參數(shù)

(續(xù)表1)

CompoundRetentiontimet/minQ1Massm/zQ3Massm/zDPU/VCEU/VMRMratio#/%SolventSwineurineTetracyline(四環(huán)素)58644514102?，1540100，10030，37211221Aureomycin(金霉素)64347904445?，4621100，10019，2362675Doxycycline(強(qiáng)力霉素)65444524281?，1539112，11226，434236Lincomycin(林可霉素)37340733592?，126097，9739，26106101Erythromycin(紅霉素)105271675586?，540765，9720，3018361708Tiamulin(硫粘菌素)105949451923?，1191106，5032，32344329

*：quantitative ion(定量離子)；#：average ratios of lincomycin and erythromycin at 1.0,2.0,4.0 μg/L and the other analytes at 10,20,40 μg/L(林可霉素和紅霉素在1.0，2.0，4.0 μg/L，其余化合物在10，20，40 μg/L加標(biāo)水平下，其相應(yīng)離子相對豐度比的平均值)

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 提取方法的優(yōu)化 與單殘留方法相比，多殘留檢測的提取方法顯得頗為關(guān)鍵。喹諾酮類、磺胺類獸藥均呈現(xiàn)酸堿兩性，在酸性溶劑中更易被萃??；大環(huán)內(nèi)酯類化合物在酸性條件下易開環(huán)，不穩(wěn)定[13]，故提取液的酸度不宜過大；四環(huán)素族的化合物易與金屬離子發(fā)生螯合作用形成螯合物[14]。綜上原因，本方法采用乙酸銨和乙二胺四乙酸二鈉的緩沖液進(jìn)行提取。

2.2.2 凈化條件的優(yōu)化 相比動(dòng)物組織肌肉、肝臟等基質(zhì)，尿樣基質(zhì)成分較簡單，因此本實(shí)驗(yàn)主要結(jié)合待測化合物的理化性質(zhì)進(jìn)行凈化條件的優(yōu)化。由于待測化合物種類較多，且各化合物的極性不同，故考慮選擇對酸性、堿性和中性化合物吸附范圍較廣的反相固相萃取小柱。在陰性試樣中分別添加不同濃度水平的29種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，對比研究了HLB柱和PLS柱的凈化效果，發(fā)現(xiàn)兩者對大多數(shù)化合物的凈化效果無明顯差異，但HLB柱對高濃度添加水平的磺胺類、四環(huán)素等化合物的凈化效果略優(yōu)，故確定選用HLB固相萃取柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

對淋洗液的種類進(jìn)行了考察。由于尿樣基質(zhì)中的雜質(zhì)多為水溶性，先選用水淋洗，再選擇5%的甲醇水溶液淋洗，發(fā)現(xiàn)林可胺類等部分化合物存在明顯的雜質(zhì)干擾。綜合考慮化合物的極性及酸堿特性，增加淋洗液中甲醇的比例后，樣液中仍存在雜質(zhì)干擾。進(jìn)一步增加氨水淋洗，并控制氨水的濃度以防待測物被淋洗下來。對不同濃度氨水溶液、不同比例甲醇水淋洗的對比研究顯示，相比僅用5%的甲醇水溶液，經(jīng)0.5%氨水和10%甲醇水淋洗后，磺胺類和喹諾酮類化合物的回收率明顯提高，且對林可胺類化合物的除雜質(zhì)效果明顯。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 定量下限與基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線 在陰性尿樣基質(zhì)中添加一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化的色譜-質(zhì)譜條件下進(jìn)行測定，提取定量離子的色譜圖，根據(jù)色譜峰的信噪比不小于10(S/N≥10)確定29種獸藥的定量下限(LOQ)為1.0～10.0 μg/L。在選定的儀器條件下，測定6個(gè)濃度水平的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以29種獸藥的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x，μg/L)，峰面積為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果表明，29種獸藥在1.0～200.0 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)為0.990 7～0.999 7(見表2)。

表2 29種獸藥在豬尿基質(zhì)中的定量下限、回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)、回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

(續(xù)表2)

CompoundLOQ(μg/L)RegessionequationrSpiked(μg/L)Recovery(%)Intra?RSD(%)Inter?RSD(%)Difloxacin100y=13600x+292000995410，20，4093，98，10479，49，3369，63，36Sulfadiazine100y=9250x+83700994910，20，4070，77，9654，116，47182，123，146Sulfadimidine100y=3960x-84800997210，20，4083，72，91141，181，9947，156，104Sulfachloropyridazine100y=14500x-78900994410，20，4076，77，9586，135，43133，127，68Sulfathiazole100y=5340x+109000998310，20，4070，79，9597，157，66137，138，62Sulfamerazine100y=5320x-30600997910，20，4080，75，10079，170，53198，143，61Sulfamethoxypyridazine100y=14800x+7570994010，20，4069，74，9875，143，49195，147，49Sulfadoxine100y=43100x+1090000990710，20，4066，74，10062，179，79120，117，65Sulfamonomethoxine100y=11400x+60800998210，20，4082，78，10291，79，55209，109，51Sulfamethoxazole100y=9430x+118000994410，20，4073，80，9945，146，4072，70，63Sulfaquinoxaline100y=21700x+745000999710，20，4095，86，10679，54，38150，87，38Trimethoprem100y=932x+14600994410，20，4076，93，10568，33，68156，67，55Sulfisoxazole100y=12900x+141000997010，20，4067，72，9089，189，52198，125，103Oxytetracycline100y=3279x-91350994310，20，4095，67，7061，79，78195，203，182Tetracyline100y=4924x+21280994410，20，4067，83，8966，39，118175，108，105Aureomycin100y=1353x-35820998610，20，4080，65，58173，53，100153，34，121Doxycycline100y=9153x+22940998910，20，4078，94，10035，115，172179，149，179Lincomycin10y=51800x+531000995010，20，4099，98，10888，90，19103，96，70Erythromycin10y=13400x+65700997210，20，4095，96，91127，74，102145，78，135Tiamulin100y=8240x+1020000997410，20，4095，102，10892，32，2198，44，135

2.3.2 回收率與精密度 取陰性豬尿樣液做低、中、高3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平做6個(gè)平行測定，重復(fù)3次，分別計(jì)算同一次實(shí)驗(yàn)同一濃度水平6個(gè)平行之間(日內(nèi))和3次重復(fù)試驗(yàn)之間(日間)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表2。各化合物的平均回收率為58%～108%，日內(nèi)RSD為1.9%～18.9%，日間RSD為3.4%～20.9%。表明該方法的回收率和重現(xiàn)性均較好。

2.3.3 確證分析 根據(jù)相同實(shí)驗(yàn)條件下，檢出物質(zhì)色譜峰的保留時(shí)間應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)品一致(允許偏差為±2.5%)，且扣除背景后樣品譜圖中各定性離子的相對豐度比與濃度接近的標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖相比，允許偏差符合歐盟導(dǎo)則EC Decision 625/2002中的規(guī)定[17]，可判定樣品中存在對應(yīng)的被測物。本實(shí)驗(yàn)計(jì)算了3個(gè)加標(biāo)水平(林可霉素和紅霉素添加1.0，2.0，4.0 μg/L，其余27種添加10，20，40 μg/L)下29種化合物在純?nèi)軇┖拓i尿基質(zhì)中定性離子的相對豐度比，結(jié)果表明，29種化合物在豬尿基質(zhì)中3個(gè)加標(biāo)濃度水平的平均離子相對豐度比與純?nèi)軇┲须x子相對豐度比基本相當(dāng)，均在歐盟導(dǎo)則所允許的范圍內(nèi)，詳見表1。

2.4 實(shí)際樣品的測定

使用該方法測定江西省供港生豬尿樣共884批次，以四環(huán)素類和磺胺類藥物的檢出率較高，其中有437批次尿樣中的四環(huán)素類藥物殘留超出方法定量下限，37批次尿樣中的四環(huán)素類獸藥超出《食物內(nèi)有害物質(zhì)規(guī)例》中的最大殘留限量。

3 結(jié) 論

本文以供港生豬尿液為樣本，采用乙酸銨和EDTA緩沖液體系酶解提取，HLB固相萃取柱凈化，利用Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱進(jìn)行分離，建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測定生豬尿液中29種獸藥殘留的分析方法。該方法的定量下限滿足《食物內(nèi)有害物質(zhì)規(guī)例》對生豬中46種獸藥限量的規(guī)定，各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)均能滿足日常殘留檢測分析的要求，能有效為施檢單位縮短檢測時(shí)間、降低檢測成本；同時(shí)也能為養(yǎng)殖戶縮短生豬通關(guān)時(shí)間,從而節(jié)約存欄成本。

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[17] EC Decision 657/2002.Off.J.Eur.Commun.,2002,1221:8-36.

Simultaneous Determination of 29 Restricted Veterinary Drug Residues in Urine of Swine Supplied to Hong Kong by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

WU Hua-wen1*，GUO Ping1，ZHANG Yuan-fang1，ZENG Zan2，WAN Jian-chun1，ZHAN Chun-rui1

(1.Comprehensive Technology Center,Jiangxi Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Nanchang 330035,China；2.College of Wildlife Resoureces,Northeast Forestry University,Harbin 150040,China)

A new approach was established for the simultaneous determination of 29 restricted drugs,including quinolones,sulfoamides,trimethoprim,tetracyclines,lincosamides,macrolides in urine of swine supplied to Hong Kong by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS).The analytes were extracted with ammonium acetate and EDTA buffer,and followed by cleanup using an HLB solid phase extraction cartridge.The sample matrix-matched calibration was used to determine the residue.Electrospray ionization mass spectrometry was operated in the positive mode. The analysis of 29 restricted drugs was achieved under the multiple reaction monitoring(MRM) mode.The results indicated that correlation coefficients of the calibration curves were more than 0.99.The average recoveries of 29 analytes at three spiked concentration levels ranged from 58% to 108%.The intra-day relative standard deviations(RSDs) were in the range of 1.9%-18.9%,and the inter-day RSDs were 3.4%-20.9%.The limits of quantitations(LOQs,S/N≥10) were in the range of 1.0-10.0 μg/L.The method is economic,high efficient and reliable,and is suitable for the simultaneous determination of multiple residues of veterinary drugs in swine urine．

high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS);swine urine;restricted drug;multiple residues

2016-04-01；

2016-05-04

江西省科技計(jì)劃項(xiàng)目(20151BBF60038)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.10.007

O657.63;TQ460.72

A

1004-4957(2016)10-1261-06

*通訊作者：伍華雯，助理工程師，研究方向：食品安全與檢測分析，Tel:0791-86358771，E-mail:dcwhw@163.com