杜文麗，高山，陳中釤，許端祥，林碧英

（福州市蔬菜科學(xué)研究所，350111）

佳寶苦瓜雜交種純度的SRAP鑒定

杜文麗，高山，陳中釤，許端祥，林碧英

（福州市蔬菜科學(xué)研究所，350111）

利用SRAP技術(shù)對(duì)佳寶苦瓜雜交種子進(jìn)行純度鑒定。試驗(yàn)結(jié)果表明，從153對(duì)SRAP引物中篩選出1對(duì)引物Me6-Em4，能同時(shí)擴(kuò)增出F1代及其父母本的多態(tài)性條帶，且PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具有高度的穩(wěn)定性和重復(fù)性；利用該引物對(duì)48株佳寶苦瓜進(jìn)行純度鑒定，其種子純度為97.9%，與其田間鑒定結(jié)果接近，表明利用SRAP分子標(biāo)記可以快速、準(zhǔn)確地鑒定佳寶苦瓜雜交種純度。

苦瓜；佳寶；SRAP；純度鑒定

苦瓜 （Momordica charantiaL．）屬葫蘆科（Cucurbitaceae）苦瓜屬一年生攀緣草本植物，原產(chǎn)印度和中國(guó)南方地區(qū)，現(xiàn)主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)。苦瓜因其具備清爽解暑、營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)，是我國(guó)長(zhǎng)江以南地區(qū)夏季的重要蔬菜，屬于典型的藥食同源瓜類(lèi)蔬菜[1]?？喙暇哂忻黠@的雜種優(yōu)勢(shì)，因此苦瓜商品化種植的品種多為F1代雜交種。在苦瓜雜交種人工制種過(guò)程中，因隔離不嚴(yán)等原因?；煊心副咀越幌捣N子，一旦大面積推廣，會(huì)給菜農(nóng)帶來(lái)不可估量的損失，因此要求苦瓜雜交種在上市銷(xiāo)售前必須經(jīng)過(guò)純度鑒定。近年來(lái)，苦瓜新品種更新速度較快，為保障后期良種的銷(xiāo)售和安全使用，對(duì)育成雜交新品種進(jìn)行快速鑒定及品種保護(hù)具有重要意義。以往以形態(tài)指標(biāo)鑒別為主要方法進(jìn)行苦瓜雜交種的純度鑒定具有很大的局限性，隨著DNA分子標(biāo)記技術(shù)的廣泛應(yīng)用，使得從基因組水平上檢測(cè)苦瓜雜交種純度成為可能，已被越來(lái)越普遍地應(yīng)用于許多蔬菜品種的鑒別及指紋圖譜的構(gòu)建[2～4]。

苦瓜品種的分子鑒別也有報(bào)道[5～7]。自1974年Grodzicker創(chuàng)立 RFLP技術(shù)以來(lái)[8]，RAPD、SCAR、 SSR、ISSR等DNA分子標(biāo)記在動(dòng)、植物和微生物等學(xué)科中得到廣泛應(yīng)用，并取得令人矚目的進(jìn)展，其中的SRAP（Sequence related amplified polymorphism）是一種新型的分子標(biāo)記技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、多態(tài)性高等獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，適用于植物遺傳圖譜構(gòu)建、基因克隆、遺傳多樣性檢測(cè)等方面的研究[9]。

以雜交種佳寶苦瓜及其親本為材料，采用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)，通過(guò)前期引物篩選及反復(fù)驗(yàn)證建立佳寶苦瓜雜交種純度鑒定技術(shù)體系，有效地獲得了該雜交種的純度鑒定結(jié)果，為其純度鑒定和該品種產(chǎn)權(quán)保護(hù)提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

佳寶苦瓜雜交種及親本由福州市蔬菜科學(xué)研究所提供，其母本08311-4是由臺(tái)灣碧秀苦瓜經(jīng)過(guò)多代自交純化而成的自交系，父本0853-2則是由廣東青秀苦瓜經(jīng)多代純化而成的自交系。佳寶苦瓜植株生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，連續(xù)結(jié)瓜能力強(qiáng)，早熟，第一雌花節(jié)位10～12節(jié)，商品瓜棒狀，瓜長(zhǎng)30～35 cm，橫徑6～ 7 cm，肉厚1.1 cm，瓜色綠，油亮有光澤，圓瘤與短縱瘤相間，單瓜質(zhì)量500～600 g，抗病性強(qiáng)，豐產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

①基因組DNA的提取方法 種子用55℃的溫湯浸泡15 min，再放在28℃左右的恒溫箱催芽，待胚根長(zhǎng)至1 cm左右時(shí)轉(zhuǎn)入穴盤(pán)育苗，待幼苗長(zhǎng)到2片真葉時(shí)隨機(jī)抽取佳寶苦瓜及其父母本各20株，剪取剛展開(kāi)的健康嫩葉，用液氮研磨，采用CTAB法進(jìn)行總DNA提取，獲得的DNA經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行濃度和純度鑒定，并稀釋到30 ng/μL左右，于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

②SRAP多態(tài)性引物設(shè)計(jì)與篩選 根據(jù)SRAP引物設(shè)計(jì)原理合成26條引物，隨機(jī)組合成153對(duì)SRAP引物。使用全部153對(duì)SRAP引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析并篩選出現(xiàn)差異條帶的引物。對(duì)篩選到的出現(xiàn)特異條帶的SRAP引物重復(fù)進(jìn)行多次驗(yàn)證，直至獲得穩(wěn)定重復(fù)差異條帶的SRAP引物。

③PCR擴(kuò)增 SRAP-PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL：Taq DNA酶（5 U/μL）0.2 μL，10×PCR buffer 2 μL，dNTPs（10 mmol/L）0.4 μL，DNA模板0.5 μL，10 μmol/L的上下游引物各4 μL，加ddH2O補(bǔ)齊至20 μL。SRAP-PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min；94℃1 min，35℃ 1 min，72℃ 1 min，循環(huán)5次；94℃1 min，50℃1 min，72℃1 min，循環(huán)35次；72℃延伸10 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物放置于4℃冰箱保存或直接用1%瓊脂糖凝膠電泳快速檢測(cè)。

④田間形態(tài)鑒定 于2015年3～6月在福州市蔬菜科學(xué)研究所試驗(yàn)地進(jìn)行，3月7日播種育苗，3月28日定植，隨機(jī)抽取150株植株掛牌編號(hào)，5月下旬在果實(shí)成熟時(shí)對(duì)果形、果色、棱、瘤等性狀進(jìn)行調(diào)查，統(tǒng)計(jì)雜種純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果分析

經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的濃度和質(zhì)量，結(jié)果表明，親本及佳寶F1代3種苦瓜DNA提取的含量均較高，且總DNA中多酚類(lèi)化合物及多糖等雜質(zhì)去除的較為干凈，DNA完整性也好，純度高，適于下一步SRAP多態(tài)性分析（圖1）。

圖1 苦瓜基因組DNA電泳

2.2 特征引物的篩選

按照SRAP引物原則設(shè)計(jì)引物，選用上海翰宇生物有限責(zé)任公司合成的SRAP的9個(gè)上游引物（Me1～Me9）和17個(gè)下游引物（Em1～Em17）組成153對(duì)引物組合對(duì)材料進(jìn)行擴(kuò)增，分析差異條帶，篩選出現(xiàn)差異條帶的引物。試驗(yàn)結(jié)果顯示，僅有1對(duì)引物Me6（5'-TGAGTCCAAACCGGTAG-3'）-Em4（5'-GACTGCGTACGAATTTGA-3'）擴(kuò)增的雜種譜與母本有差異。對(duì)篩選到出現(xiàn)差異的Me6-Em4引物進(jìn)行多次重復(fù)驗(yàn)證（重復(fù)提取DNA，以其為模板進(jìn)行5次SRAP重復(fù)試驗(yàn)），結(jié)果能同時(shí)擴(kuò)增出F1代及其父母本的多態(tài)性條帶，其擴(kuò)增產(chǎn)物具有高度的穩(wěn)定性和重復(fù)性（圖2）。

圖2 引物Me6-Em4父母本和佳寶苦瓜基因組DNA的SRAP擴(kuò)增

2.3 雜種純度的鑒定

隨機(jī)挑選若干粒佳寶F1代種子，按上述方法培育幼苗。隨機(jī)抽取48個(gè)單株編號(hào)提取DNA，選用Me6-Em4特征引物進(jìn)行佳寶苦瓜SRAP的分子純度鑒定。

檢測(cè)結(jié)果顯示（圖3），Me6-Em4擴(kuò)增出雙親的特異條帶，可確定為雜交單株，只有1株單株未擴(kuò)增出父本的特異條帶，可能是母本自交而來(lái)，為假雜種。因此，分子標(biāo)記鑒定結(jié)果表明，該48株單株有真雜種47株，雜交種的純度為97.9%。

2.4 雜交種田間鑒定

盛果期選取同批次播種的48株標(biāo)記單株進(jìn)行田間鑒定，鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，選取的48株農(nóng)藝性狀均符合佳寶苦瓜的性狀特征，可以判斷為真雜種。因此，田間鑒定結(jié)果表明，這48株單株的純度為100%。雜交純度分子鑒定與生物學(xué)性狀田間鑒定結(jié)果接近，表明本批次的純度達(dá)到國(guó)家用種標(biāo)準(zhǔn)，顯示了在制種過(guò)程中良好的田間管理水平。

圖3 引物Me6-Em4對(duì)48株佳寶苦瓜單株擴(kuò)增產(chǎn)物電泳

3 結(jié)論與討論

雜交種子的純度鑒定是農(nóng)作物種子質(zhì)量檢驗(yàn)的一項(xiàng)重要內(nèi)容。由于SRAP標(biāo)記具有豐富的多態(tài)性、操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，已被應(yīng)用于多種農(nóng)作物的種子純度鑒定。本試驗(yàn)篩選出1對(duì)共顯性SRAP標(biāo)記Me6-Em4，檢測(cè)佳寶種子純度為97.9%，與其田間農(nóng)藝性狀的鑒定結(jié)果100%接近，并且SRAP標(biāo)記鑒定的結(jié)果更為客觀、可信。用SRAP標(biāo)記鑒定替代田間鑒定，能夠克服田間種植鑒定周期長(zhǎng)、易受環(huán)境影響等缺點(diǎn)。結(jié)果也表明，要完全通過(guò)分子手段鑒定苦瓜雜交種純度的達(dá)到對(duì)新品種保護(hù)的目的，還需要設(shè)計(jì)足夠多的引物，才有可能獲得有效的多態(tài)性引物，從而建立苦瓜雜交種種子的分子水平質(zhì)量監(jiān)控系統(tǒng)。

[1]張偉光，張玉燦，張少平，等．苦瓜栽培育種與貯運(yùn)加工[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2014.

[2]趙秀娟，宋建文，胡開(kāi)林.苦瓜種質(zhì)遺傳多樣性的SRAP標(biāo)記分析[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2013，14（1）：78-84.

[3]嚴(yán)慧玲，閆樹(shù)成，楊慧民，等.利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)鑒定大白菜種子純度[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，31（6）：50-52.

[4]李麗，鄭曉鷹，柳李旺.用SRAP標(biāo)記分析黃瓜品種遺傳多樣性及鑒定品種[J].分子植物育種，2006，4（5）：702-708.

[5]張少平，張玉燦，張偉光，等.RAPD及SRAP兩種分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)苦瓜雜交種純度的鑒定分析[J].生物技術(shù)進(jìn)展，2014（4）：286-291.

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[7]許端祥，高山，林碧英，等.佳美苦瓜純度的SRAP鑒定[J].長(zhǎng)江蔬菜，2011（18）：16-17.

[8]Guo D L,Zhang J P,Xue Y M,et al.Isolation and characterization of 10 SSR markers ofMomordica charantia (Cucurbitaceae)[J].American Journal of Botany,2012,99 (5):182-183.

[9]海燕，何寧，康明輝，等.新型分子標(biāo)記SRAP及其應(yīng)用[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006（9）：9-12.

Hybrid Purity Identification of Jiabao Bitter Gourd by SRAP Markers

DU Wenli,GAO Shan,CHEN Zhongshan,XU Duanxiang,LIN Biying
(Fuzhou Institute of Vegetable Crops,350111)

In this study,SRAP markers technique was used for identifying the purity of Jiabao bitter gourd hybrid seeds. The results showed that only a pair of primers (Me6-Em4)was screened out from 153 pairs of SRAP primers,which could amplify the characteristic polymorphic bands of F1generation and its parents,and the PCR products possessed high stability and repeatability.Using the pair of primers to detect the purity of 48 individuals of Jiabao bitter gourd,the results showed that the purity was 97.9%for hybrid seeds of Jiabao bitter gourd,which was very close to the field morphological test,indicating that SRAP markers could be used to identify the hybrid purity of Jiabao bitter gourd rapidly and accurately.

Bitter gourd;Jiabao;SRAP;Purity identification

S642.5

A

1001-3547（2016）16-0034-03

10.3865/j.issn.1001-3547.2016.16.014

福建省重大專(zhuān)項(xiàng)（2012NZ0003-4）；福建省星火項(xiàng)目（2015S0106）

杜文麗（1989－），女，碩士，研究方向?yàn)槭卟诉z傳育種，E-mail：houpeicengdwl@163.com

2016-06-01