房 磊 范建華 李元廣（華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237）

利用真核微藻表達(dá)外源蛋白的現(xiàn)狀與展望

房 磊 范建華 李元廣（華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237）

近年來(lái)，隨著基因工程技術(shù)的迅猛發(fā)展，利用真核微藻表達(dá)外源蛋白技術(shù)得到廣泛關(guān)注。綜述了真核微藻表達(dá)外源重組蛋白的研究現(xiàn)狀，并分析了其中存在的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題。在此基礎(chǔ)上，闡述了真核微藻作為新型表達(dá)系統(tǒng)所面臨的機(jī)遇與挑戰(zhàn)，最后展望了真核微藻表達(dá)重組蛋白的發(fā)展前景。

房磊，博士研究生，研究方向?yàn)槲⒃寤蚬こ獭?/p>

E-mail:fangleismile@163.com

微藻生物資源具有集“碳減排、新能源、大健康、水處理”于一體的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，微藻這一戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)可以被培育為一個(gè)應(yīng)用面廣的“大產(chǎn)業(yè)”，其發(fā)展對(duì)當(dāng)前及未來(lái)經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展有著巨大推動(dòng)作用，已成為當(dāng)今世界生物技術(shù)領(lǐng)域的研發(fā)熱點(diǎn)。微藻作為一種“活細(xì)胞生物反應(yīng)器”，不但可以充分吸收環(huán)境中排放的CO2，解決工廠CO2的點(diǎn)源排放問(wèn)題，緩解溫室效應(yīng)，而且通過(guò)基因工程改造可以滿足人類對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖、生物柴油、醫(yī)藥蛋白1、保健品2、飼料3、功能食品4的需要。因此，微藻的基因工程研究備受科技工作者的關(guān)注。

微藻作為“天然的綠色工廠”，可以高效表達(dá)藥物蛋白、功能蛋白、食品添加劑等一系列高附加值產(chǎn)品。與細(xì)菌的表達(dá)系統(tǒng)相比，真核微藻可以完成復(fù)雜的蛋白質(zhì)折疊，形成有活性的蛋白；與酵母表達(dá)系統(tǒng)相比，可以進(jìn)行糖基化，滿足人們對(duì)抗原、抗體特異性需求；與轉(zhuǎn)基因植物相比，其培養(yǎng)周期短、受季節(jié)等外界環(huán)境的限制較少；與動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)相比，生產(chǎn)成本（蛋白質(zhì)未純化）不到動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的萬(wàn)分之一5，并且可以實(shí)現(xiàn)微藻規(guī)?；囵B(yǎng)。此外，微藻來(lái)源的蛋白具有生物相容性，可以不進(jìn)行純化，直接被動(dòng)物食用，大大降低純化回收的成本。

屬于藍(lán)細(xì)菌的Synechocystis PCC 6803是研究較為透徹的原核微藻，目前在其中已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)Flounder growth hormone、Acyl-acyl carrier protein thioesterase、Hydrogenase等多種外源蛋白的表達(dá)。由于原核微藻除了核糖體以外不具有其他細(xì)胞器，不具備蛋白質(zhì)加工修飾的功能，且藍(lán)細(xì)菌普遍生長(zhǎng)較為緩慢，導(dǎo)致重組蛋白的產(chǎn)率低，因而近年來(lái)利用真核微藻表達(dá)外源蛋白技術(shù)逐漸得到關(guān)注。但目前來(lái)說(shuō)，利用真核微藻生產(chǎn)外源重組蛋白技術(shù)尚未獲得重大突破，理論基礎(chǔ)研究和應(yīng)用基礎(chǔ)研究亟待加大投入，以期盡快為微藻戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)的形成提供新的增長(zhǎng)點(diǎn)。本文僅對(duì)利用真核微藻作為表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白的現(xiàn)狀進(jìn)行分析并對(duì)其發(fā)展前景進(jìn)行展望。

1 真核微藻表達(dá)外源蛋白的國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展

萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）是真核微藻中研究最為成熟的表達(dá)系統(tǒng)。目前，已在微藻中表達(dá)了34種不同的外源蛋白，僅萊茵衣藻中就有29種6。為滿足全球每年1400億元藥物蛋白的市場(chǎng)需求7，迄今已成功在C.reinhardtii中表達(dá)多種外源蛋白如：The fourteenth human fibronectin type III domain（14 FN3）8、The tenth human fibronectin type III domain（10 FN3）8、Immunoglobulin G（IgG）9～11等抗體藥物；E7 protein of the Human Papilloma virus type 16 （16 E7）12、Immunotoxins13、Pfs48/4514等疫苗；Erythropoietin15、Bovine milk amyloid A（MAA）16、 Proinsulin8等功能藥物； Human tumor necrosis factor related apoptosisinducing ligand（hTRAIL）17、Allophycocyanin18等抗腫瘤藥物。此外，萊茵衣藻也可以高效表達(dá)Xylanase19等食品添加劑。但現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道中C.reinhardtii存在生長(zhǎng)速率慢、細(xì)胞密度低、規(guī)?；囵B(yǎng)技術(shù)不成熟、外源蛋白表達(dá)含量低等問(wèn)題，限制了其產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。

小球藻具有生長(zhǎng)周期短、細(xì)胞密度高、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)勢(shì)，因此繼C.reinhardtii后，也成為基因工程的主要研究對(duì)象。目前成功在橢圓小球藻（Chlorella ellipoidea）中實(shí)現(xiàn)了α-defensin20、Flounder growth hormone21的高效表達(dá)，在普通小球藻（Chlorella vulgaris）中實(shí)現(xiàn)了Lactoferrin22的高效表達(dá)。Fan等23首次完成了國(guó)際上首個(gè)可食用且可規(guī)?；囵B(yǎng)的蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）的全基因組測(cè)序并成功實(shí)現(xiàn)了外源基因的轉(zhuǎn)化。筆者所在團(tuán)隊(duì)在國(guó)際上首創(chuàng)了微藻培養(yǎng)領(lǐng)域的一項(xiàng)嶄新的平臺(tái)技術(shù)——異養(yǎng)-稀釋-光誘導(dǎo)串聯(lián)培養(yǎng)（SHDP）技術(shù)24，已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)了小球藻高密度高品質(zhì)培養(yǎng)，其異養(yǎng)培養(yǎng)的平均生長(zhǎng)速率不低于3g/（L·h），最高藻細(xì)胞密度可高達(dá)150g/L，已用于小球藻粉的工業(yè)化生產(chǎn)，這一技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化為小球藻作為外源蛋白表達(dá)平臺(tái)的研發(fā)奠定了重要基礎(chǔ)。

此外，在三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）11、杜氏鹽藻（Dunaliella salina）25等真核微藻中也實(shí)現(xiàn)了外源蛋白的表達(dá)（表1）。

2 真核微藻基因工程技術(shù)存在的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題分析

微藻作為“資源節(jié)約型、環(huán)境友好型”的可再生生物資源，符合全球倡導(dǎo)的“低碳經(jīng)濟(jì)、可持續(xù)發(fā)展”的戰(zhàn)略，以其作為生物反應(yīng)器表達(dá)外源蛋白具有潛在的商業(yè)價(jià)值。但是現(xiàn)有技術(shù)下的蛋白表達(dá)效率較低，導(dǎo)致其生產(chǎn)成本高，距實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)還有距離。分析其原因主要有以下幾點(diǎn)。

①在表達(dá)場(chǎng)所方面，葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的表達(dá)效率高于核基因組，但是實(shí)現(xiàn)葉綠體轉(zhuǎn)化的微藻相對(duì)較少，目前主要有C.reinhardtii6、 D.salina22等微藻，但其培養(yǎng)周期長(zhǎng)、細(xì)胞密度低，不利于外源蛋白的產(chǎn)業(yè)化研究。而生長(zhǎng)速度快且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的微藻（如小球藻）的培養(yǎng)周期短、細(xì)胞密度高、培養(yǎng)工藝成熟，但尚未建立一套完善的小球藻葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。

②在整合位點(diǎn)方面，微藻細(xì)胞中尚未發(fā)現(xiàn)適合外源基因的整合熱點(diǎn)。微藻的基因工程研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于動(dòng)物細(xì)胞，微藻的遺傳背景尚未研究透徹，外源基因大多以隨機(jī)插入或者某一位點(diǎn)的同源重組整合到基因組中，外源蛋白的表達(dá)可能會(huì)影響到自身蛋白的功能發(fā)揮，導(dǎo)致代謝發(fā)生紊亂。這些因素導(dǎo)致外源基因在轉(zhuǎn)基因微藻中表達(dá)的精確調(diào)控與預(yù)期的目標(biāo)間仍有差距。為此，尚需對(duì)微藻的基因組和比較基因組進(jìn)行系統(tǒng)研究，分析并找到適合引入外源基因的整合熱點(diǎn)。

注：“—”表示引用文章報(bào)道能夠檢測(cè)出相應(yīng)物質(zhì)，但是檢測(cè)量低，沒(méi)有報(bào)道具體數(shù)值。

③在提高外源基因表達(dá)效率方面，微藻轉(zhuǎn)入外源基因后，容易出現(xiàn)表達(dá)效率低、基因沉默、微藻的生長(zhǎng)速率受到限制等一系列問(wèn)題。為此需要找到一種使外源基因高效表達(dá)的方法。研究表明通過(guò)啟動(dòng)子35、終止子36的優(yōu)化，利用2A肽耦聯(lián)技術(shù)19，質(zhì)粒線性化37，葉綠體轉(zhuǎn)化38，增強(qiáng)子、操縱子39、內(nèi)含子40以及3’端非轉(zhuǎn)錄區(qū)41的使用，密碼子優(yōu)化42，Kozak序列的引入43，信號(hào)肽的使用44，利用核基質(zhì)結(jié)合區(qū)（MARs）45，使用轉(zhuǎn)錄因子-UAS表達(dá)系統(tǒng)46，增加基因的拷貝數(shù)47等一系列措施均可以增加轉(zhuǎn)錄、翻譯效率，進(jìn)一步提高外源基因的表達(dá)效率。因此，需要了解和掌握基因的表達(dá)機(jī)制，從而探索高效、大量表達(dá)外源基因的方法。

綜上所述，現(xiàn)階段利用微藻作為表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)外源蛋白技術(shù)的關(guān)鍵突破，需要集中在轉(zhuǎn)基因的精確表達(dá)、高效調(diào)控上48。

3 利用真核微藻生產(chǎn)外源蛋白面臨的機(jī)遇與挑戰(zhàn)

3.1 真核微藻生產(chǎn)外源蛋白所面臨的機(jī)遇

當(dāng)前，微藻生物技術(shù)已步入快速發(fā)展階段，除了把微藻開(kāi)發(fā)成傳統(tǒng)意義上的新食品原料、功能食品等大健康產(chǎn)品外，隨著新能源、碳減排和環(huán)保等方面的迫切需要，微藻在生物能源、生物固碳、富含氮磷廢水處理、動(dòng)物飼料及食品等行業(yè)具有十分廣闊的應(yīng)用前景。在C.reinhardtii中已經(jīng)證實(shí)微藻是一個(gè)良好的“活細(xì)胞生物反應(yīng)器”，可以表達(dá)多種外源高附加值產(chǎn)品，微藻的轉(zhuǎn)基因研究面臨著新的機(jī)遇。

首先，真核微藻滿足“綠色經(jīng)濟(jì)、可持續(xù)發(fā)展”的戰(zhàn)略需求?！澳茉次C(jī)、全球氣候變暖”等問(wèn)題亟待解決，微藻生物技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化受到政府、企業(yè)的大力支持及科研工作者的青睞。國(guó)家投入充足的科研經(jīng)費(fèi)用于微藻生物技術(shù)的相關(guān)研究，必將大力推動(dòng)微藻遺傳背景的認(rèn)識(shí)以及基因工程領(lǐng)域的技術(shù)突破，這為微藻作為生物反應(yīng)器表達(dá)外源蛋白技術(shù)的發(fā)展提供了良好的機(jī)遇。

其次，真核微藻具備表達(dá)高附加值產(chǎn)品的優(yōu)勢(shì)。微藻具有葉綠體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等多種細(xì)胞器，可以完成復(fù)雜的蛋白質(zhì)折疊與修飾，是外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)的不二之選。美國(guó)食品與藥品管理局（FDA）將微藻列為安全食品49 50，因此利用微藻表達(dá)的外源蛋白可省去提取、純化費(fèi)用，大大提高了藻源蛋白的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。

3.2 真核微藻生產(chǎn)外源蛋白所面臨的挑戰(zhàn)

微藻轉(zhuǎn)基因及其產(chǎn)業(yè)化研究具有廣闊的市場(chǎng)前景，但是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的道路是曲折的。目前微藻表達(dá)高附加值產(chǎn)品的含量都相對(duì)較低，導(dǎo)致生產(chǎn)成本居高不下，限制了其產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。此外，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全問(wèn)題備受爭(zhēng)議，因此利用轉(zhuǎn)基因微藻表達(dá)外源蛋白要經(jīng)過(guò)各種驗(yàn)證安全后才能使用。如藻源蛋白易于糖基化，使其表達(dá)的外源蛋白具有免疫原型51，作為疫苗等藥物靜脈注射到人體后可能會(huì)產(chǎn)生免疫排斥，因此，藻源的外源蛋白需要經(jīng)過(guò)繁瑣的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和多期臨床試驗(yàn)，這無(wú)形中增加其產(chǎn)業(yè)化的成本。另外，微藻轉(zhuǎn)基因技術(shù)尚未成熟，微藻生產(chǎn)重組蛋白在衣藻、三角褐指藻、集胞藻6803等模式微藻中已經(jīng)取得突破，但藻細(xì)胞生長(zhǎng)速率較低、藻細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)成分少，應(yīng)用價(jià)值低；而在生長(zhǎng)快營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的小球藻等微藻中，已成功實(shí)現(xiàn)核基因組轉(zhuǎn)化（集中在電擊轉(zhuǎn)化、農(nóng)桿菌介導(dǎo)、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化等方面），但穩(wěn)定性、表達(dá)效率亟待提高，并且更加高效的葉綠體轉(zhuǎn)化、同源重組、RNAi、CRISPR/Cas9體系等技術(shù)均尚未突破，需要投入更大精力開(kāi)展系統(tǒng)的研究。

4 真核微藻表達(dá)重組蛋白的發(fā)展前景

隨著微藻生物技術(shù)的進(jìn)步，真核微藻表達(dá)外源蛋白的研究將會(huì)不僅僅限于C.reinhardtii、P.tricornutum、 C.ellipsoidea、C.vulgaris、C.pyrenoidosa、D.salina等幾種微藻，將會(huì)有更多的微藻應(yīng)用于基因工程研究，特別是那些具有商業(yè)價(jià)值的微藻。在洞悉微藻的理化性質(zhì)和遺傳背景的前提下，建立微藻的轉(zhuǎn)錄組和代謝組學(xué)，實(shí)現(xiàn)人們的預(yù)期目標(biāo)與微藻基因表達(dá)的精確調(diào)控相統(tǒng)一的目標(biāo)，使代謝流集中在目標(biāo)蛋白的生產(chǎn)上，避免造成能源浪費(fèi)，走“最少的投入、最大的產(chǎn)出”綠色經(jīng)濟(jì)路線，是微藻基因工程研究的下一步目標(biāo)。

基因工程技術(shù)日新月異，借助真核微藻這一“活細(xì)胞生物反應(yīng)器”表達(dá)外源蛋白、食品添加劑及工業(yè)原料，將會(huì)降低醫(yī)藥及功能食品的成本，解決醫(yī)藥蛋白和功能食品價(jià)格昂貴的問(wèn)題。這預(yù)示未來(lái)的轉(zhuǎn)基因研究將聚焦以微藻作為生物反應(yīng)器的研究，可滿足人們對(duì)高附加值產(chǎn)品的需求，具有廣闊的應(yīng)用前景。

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