張嘉熙　何美麗　趙冰松　李臨梅

1.中國人民解放軍第263醫(yī)院口腔治療中心 北京 101149；2.北京佳美口腔醫(yī)院正畸科 北京 100020

促紅細胞生成素在成骨細胞分化中的實驗研究

張嘉熙1何美麗1趙冰松1李臨梅2

1.中國人民解放軍第263醫(yī)院口腔治療中心 北京 101149；2.北京佳美口腔醫(yī)院正畸科 北京 100020

目的 研究促紅細胞生成素（EPO）對成骨細胞分化和功能的影響以及EPO-EPO受體（EPOR）信號在成骨細胞中的作用，探討EPO在骨穩(wěn)態(tài)中的作用及其機制。方法 體外培養(yǎng)小鼠骨髓基質細胞系（ST2），加入EPO蛋白，采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應方法檢測成骨分化相關基因的變化，采用堿性磷酸酶（ALP）和茜素紅染色方法觀察成骨細胞骨形成功能。采用RNA干擾技術沉默EPOR基因，檢測阻斷EPO-EPOR信號通路后成骨細胞分化和功能的變化。結果 骨髓基質細胞表達EPOR，EPO與受體EPOR結合后，可誘導其向成骨細胞分化，增加Runx2、Alp和Col1等成骨細胞相關基因的表達，同時增加ALP蛋白的表達和鈣結節(jié)的沉積。EPOR基因沉默后，成骨相關基因的表達受到抑制。結論 EPO通過EPOR信號促進成骨細胞的分化和功能。

骨髓基質細胞； 成骨細胞； 促紅細胞生成素； 促紅細胞生成素受體

促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）是由腎皮質腎小管周圍間質細胞和肝臟分泌的一種激素樣物質，是參與紅細胞前體細胞分化和成熟的一個至關重要的細胞因子，EPO腎功能衰竭的患者必須注射促紅細胞生成素以避免嚴重貧血[1]。EPO與促紅細胞生成素受體（erythropoietin receptor，EPOR）結合發(fā)揮作用，引發(fā)信號傳導調節(jié)紅細胞的增殖和分化[2]。因此EPO-EPOR信號是調節(jié)紅細胞增殖、分化和存活所必需的關鍵信號轉導通路。 然而，EPO/EPOR信號在非造血細胞中的作用還知之甚少。最近，有學者已經(jīng)證明了EPO能激活造血干細胞（hematopoietic stem cell，HSC）的JAK/STAT信號，導致骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）的產(chǎn)生和骨形成，而且EPO在體外還直接激活間充質細胞分化為成骨細胞[3]。因此，本研究設想EPO-EPOR信號參與了骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化的過程，應用骨髓基質細胞系ST2，研究EPO通過與EPOR結合誘導成骨細胞的骨形成的作用。

1　材料和方法

1.1材料

α-最低必需培養(yǎng)基（minimum essential medium，MEM）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（GIBCO公司，美國）；RNA提取試劑盒（北京博邁德公司）；熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒、PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司），小鼠骨髓基質細胞系ST2（ATCC號：TIB-71，ATCC細胞庫，美國）。青霉素-鏈霉素（PAA公司，美國）。維生素C、β-甘油磷酸鈉、地塞米松、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）檢測試劑盒（Sigma公司，美國）。

1.2儀器設備

CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱（三洋公司，日本），ABI7300熒光定量PCR儀（非凡公司，美國）。

1.3細胞培養(yǎng)

ST2細胞用α-MEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素）培養(yǎng)于37℃、95%濕度、5%CO2環(huán)境中。細胞達70%～80%融合時，用0.25%胰蛋白酶進行消化傳代。ST2細胞的誘導培養(yǎng)：取細胞生長狀況比較良好的ST2細胞進行傳代后，加入成骨誘導培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件與ST2細胞培養(yǎng)相同。每日觀察細胞貼壁增殖情況及細胞形態(tài)的變化。成骨誘導培養(yǎng)液的配制：在正常的有血清培養(yǎng)基中加入終濃度為50 mg·L-1維生素C，β-甘油磷酸鈉10 mmol·L-1，1×10-8mol·L-1地塞米松，避光，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

ST2細胞以每孔1.5×105個細胞的密度接種于6孔板，實驗分為4組：實驗組（簡稱EPO組），對照組，轉染組（EPO+轉染質粒GI583527），轉染對照組（EPO+空白質粒TR30013）。實驗組和對照組分別用含或不含EPO蛋白（20 U·mL-1）的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)（含10%FBS、成骨細胞誘導液和1%青霉素-鏈霉素）。轉染組采用RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術使EPOR基因沉默，分別按實驗分組轉染空質粒shRNA TR30013作為陰性對照和實驗組質粒EPOR shRNA-GI583527，每2天換液。

1.4基因沉默

ST2細胞轉染EPOR短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA），使EPO的配體EPOR基因沉默，從而達到EPO不發(fā)揮作用的效果。使用脂質體2000攜帶EPOR shRNA，按照試劑盒的說明操作。ST2細胞接種到6孔板，培養(yǎng)直到細胞達到80%匯合。應用脂質體轉染，使EPOR基因沉默，在無血清培養(yǎng)基中轉染質粒EPOR（shRNAGI583527），6孔板每孔脂質體2000為6 μL，相對應EPOR shRNA為2.5 μg。稀釋培養(yǎng)基為250 μL的無血清、無雙抗α-MEM培養(yǎng)基，混勻之后，靜止20 min，轉染5 h后換10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基。對照組，轉染空白質粒shRNA-TR30013，方法同上。

1.5熒光定量PCR

細胞分別培養(yǎng)2、4、6 d時提取總RNA，總RNA進行定量（260 nm的吸光度），逆轉錄成cDNA后進行熒光定量PCR反應，使用SYBR?Premix Ex Taq? PCR試劑盒，內參為β-肌動蛋白，熒光定量PCR所用引物如下：Epor（基因片段標號為：NM_ 010149.3），Runx2（NM_001145920.1），Col1（NM_007742.3），Alp（NM_007431.2）。結果表示成2（-ΔΔCt）形式，以對照組為1。

1.6ALP活性檢測

ALP檢測試劑盒內A、B溶液比例為1∶1，避光，吸取培養(yǎng)基，鹽水沖洗1遍，每孔加入200 μL的AB混合液，靜置40 min后加入50 μL終止液。檢測細胞ALP活性，酶聯(lián)儀520 nm測定各孔吸光度。

1.7鈣結節(jié)測定

取ST2細胞接種于6孔板內，各個實驗組分別處理，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各組按要求相應的換條件培養(yǎng)液，而對照組仍為等體積的常規(guī)培養(yǎng)液。各組每3 d換液1次，連續(xù)培養(yǎng)3周左右，顯微鏡觀察鈣化結節(jié)形成過程。

茜素紅染色：鏡下可以查見黑色不透明區(qū)域時行茜素紅染色，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗后，95%乙醇固定10 min，10 ℃、0.2%茜素紅染色30 min，蒸餾水沖洗，倒置顯微鏡下拍照保存。

茜素紅定量：染色完成后，配洗脫液：10%氯化十六烷吡啶單水合物（用PBS緩沖液稀釋），37 ℃以6孔板每孔1 mL洗脫20 min，將洗脫液吸取到96孔板內，設5個復孔，在波長562 nm處振蕩10 s測光密度（optical density，OD）值。

1.8統(tǒng)計分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件，配對t檢驗分析實驗結果，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1EPO對成骨細胞的作用

ST2細胞在成骨誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，實驗組加入終濃度為20 U·mL-1的EPO，對照組加入相同體積的PBS液，培養(yǎng)2、4和6 d分別提取總RNA。采用熒光定量PCR檢測EPO對成骨細胞的影響。結果顯示（圖1），實驗組EPOR的表達在培養(yǎng)2 d（P＜0.05）和4 d（P＜0.01）時呈遞增趨勢，而成骨分化標志性基因Runx2、Col1和Alp的表達都有所增加。其中Runx2和Alp細胞培養(yǎng)第4天時表達增加（P＜0.05），Col1在培養(yǎng)2、4和6 d時表達明顯增加（P＜0.01）。

圖1　定量熒光PCR檢測EPO對成骨分化相關基因表達的影響Fig 1 The expression of gene osteoblast differentiation of EPO by real-time PCR

2.2EPOR基因沉默對成骨細胞的作用

采用熒光定量PCR檢測EPOR基因沉默后，EPO對成骨向誘導的ST2細胞的影響。圖2A結果顯示，EPOR基因沉默后，其表達受到抑制。其中第四天表達明顯降低（P＜0.01），沉默效率最高能達到約80%。圖2B～D為成骨分化標志性基因的表達，Runx2、Col1和Alp表達都有所降低。其中Runx2的表達在第2天和第4天明顯降低（P＜0.01），Col1和Alp在細胞培養(yǎng)第6天時表達明顯降低（P＜0.01）。

圖2　EPOR基因沉默后定量熒光PCR檢測成骨相關基因的表達Fig 2 The expression of gene osteoblast differentiation of EPO by real-time PCR after EPOR gene silence

2.3EPO對成骨細胞的功能作用

ST2細胞培養(yǎng)3、7和14 d的ALP檢測結果見圖3，圖中2組3、7和14 d的ALP活性均呈遞增趨勢，7和14 d實驗組明顯比對照組表達升高（P＜0.01）。圖4為茜素紅染色，檢測2組鈣結節(jié)量的變化，圖4A為對照組，4B為實驗組，實驗組的鈣結節(jié)量明顯比對照組高。對照組茜素紅定量在波長562 nm處測得OD值為0.134 3，而實驗組OD值為0.189，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

圖3　ALP檢測Fig 3 ALP activity assay

圖4　鈣結節(jié)檢測EPO對成骨細胞的影響 體式顯微鏡 × 100Fig 4 Alizarin red stain for erythropoietin calcium in osteoblasts stereomicroscope × 100

3　討論

EPO是一種造血肽激素，調節(jié)細胞增殖、存活和紅系祖細胞前體細胞的終末分化[4]。人EPO基因位于7號染色體長臂22區(qū)，有多肽和糖基構成，相對分子質量約3.4×104，含有2個二硫鍵、一個碳末端的精氨酸（Arg）殘基[5]。未成熟的EPO前體僅由193個氨基酸組成，發(fā)育過程中，一個包含27個氨基酸的信號肽和一個碳末端C-精氨酸解離，碳水化合物加入，形成由165個氨基酸和4條糖鏈組成的成熟EPO。

EPOR是人類Epor基因編碼的蛋白質，由細胞外結構域、跨膜域、胞內域組成。EPOR是分子量為5.9×104，其本身沒有內源性酪氨酸激酶活化劑來激活受體信號。EPOR作為一個二聚體預先存在，它與3.4×104的EPO配體結合，改變其二聚化的狀態(tài)。在EPO的刺激下，EPOR胞漿近膜部分到羧基末端的8個酪氨酸殘基全部發(fā)生磷酸化，結合胞質內包含SH2功能區(qū)的信號傳遞因子，從而發(fā)揮EPO促進細胞增殖和分化等的功能。

EPO可以活化造血干細胞中的JAK/STAT信號，誘導BMP2的產(chǎn)生，進而促進骨形成，同時發(fā)現(xiàn)EPO可以直接作用于骨髓間充質干細胞誘導成骨細胞表型，增加Runx2、Col1和Alp等成骨細胞相關基因的表達。

經(jīng)熒光定量PCR實驗結果顯示，EPO組的Runx2、Col1和Alp等成骨細胞相關基因的表達明顯增加，得出EPO可以促進骨髓基質細胞向成骨細胞的分化。同時，EPOR基因沉默組成骨相關基因的表達受到抑制。由此得出，EPO促進成骨細胞的分化是通過與EPOR結合而發(fā)揮作用的。本研究又對EPO功能進行檢測，通過ALP與鈣結節(jié)的結果得出，加入EPO的實驗組明顯比對照組高表達，說明EPO能夠促進成骨細胞的功能。

[1] Elliott S, Lorenzini T, Asher S, et al. Enhancement of therapeutic protein in vivo activities through glycoengineering[J]. Nat Biotechnol, 2003, 21(4):414-421.

[2] Lombardero M, Kovacs K, Scheithauer BW. Erythropoietin: a hormone with multiple functions[J]. Pathobiology, 2011, 78(1):41-53.

[3] Kim J, Jung Y, Sun H, et al. Erythropoietin mediated bone formation is regulated by mTOR signaling[J]. J Cell Biochem, 2012, 113(1):220-228.

[4] Klingmüller U. The role of tyrosine phosphorylation in proliferation and maturation of erythroid progenitor cells—signals emanating from the erythropoietin receptor[J]. Eur J Biochem, 1997, 249(3):637-647.

[5] Buemi M, Cavallaro E, Floccari F, et al. Erythropoietin and the brain: from neurodevelopment to neuroprotection[J]. Clin Sci(Lond), 2002, 103(3): 275-282.

（本文編輯 張玉楠）

Roles of erythropoietin on the differentiation of osteoblasts

Zhang Jiaxi1, He Meili1, Zhao Bingsong1, Li Linmei2.

(1.Center of Stomatology, 263 Hospital of People Liberation Army, Beijing 101149, China; 2. Dept. of Orthodontics, Jiamei Dental Hospital, Beijing 100020, China)

Objective This study aimed to investigate the effects of erythropoietin(EPO) on the differentiation and function of osteoblasts, to identify the roles of EPO-erythropoietin receptor(EPOR) in osteoblasts, and to explore the effects and mechanism of EPO in bone homeostasis. Methods Mouse bone marrow stromal cell line ST2 was cultured in vitro and treated with EPO. Changes in osteoblastic gene levels were quantified by real-time polymerase chain reaction. The function of osteoblasts in bone formation was observed by alkaline phosphatase(ALP) and alizarin red staining. EPOR expression was knocked down by RNA interfere. The differentiation and function of osteoblasts were then tested by the above methods. Results ST2 cells expressed EPOR. After binding with EPOR, EPO induced osteoblast differentiation from bone marrow stromal cells. Expression levels of osteoblast-related genes Runx2, Alp, and Col1 increased. ALP and calcium deposition increased. Expression levels of osteoblast-related genes were repressed after EPOR knockdown. Conclusion EPO promotes the differentiation and function of osteoblasts through EPO-EPOR signaling.

bone marrow stromal cell； osteoblasts； erythropoietin； erythropoietin receptor

Q 51

A [doi] 10.7518/gjkq.2016.06.004

2016-03-22；

2016-09-01

張嘉熙，碩士，Email：491994879@qq.com

李臨梅，學士，Email：jeson_yue5@sina.com