呂茂利，于立權(quán)，秦學(xué)功，崔玉東

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶163319）

一個金黃色葡萄球菌蛋白磷酸酯酶基因的克隆表達(dá)及酶活性測定

呂茂利，于立權(quán)，秦學(xué)功，崔玉東

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶163319）

金黃色葡萄球菌是一種引起人畜多種感染的主要病原菌，開發(fā)治療金黃色葡萄球菌感染的新藥途徑之一是藥物尋靶。研究克隆了一個金黃色葡萄球菌基因，并進(jìn)行了蛋白誘導(dǎo)表達(dá)和酶活性測定。結(jié)果表明，該基因編碼的蛋白具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酯酶活性。實驗結(jié)果為進(jìn)一步挖掘該蛋白作為藥物靶標(biāo)的潛在功能奠定了基礎(chǔ)。

金黃色葡萄球菌；蛋白磷酸酯酶；活性測定

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）是一個能引起奶牛乳房炎和子宮內(nèi)膜炎等疾病的致病微生物，同時也能引起廣泛的醫(yī)院內(nèi)和社區(qū)內(nèi)感染重要致病微生物，包括食物中毒、假膜性腸炎、燙傷樣皮膚綜合癥、毒素休克綜合癥、化膿性炎癥和敗血癥等［1］。近年來，隨著金黃色葡萄球菌耐藥菌株頻現(xiàn)和多重耐藥性增加，養(yǎng)殖業(yè)的疫病防控壓力也隨之加大，同時也給人類健康造成了極大的威脅［2］。

研究表明，從原核生物到真核生物，由蛋白激酶和磷酸酶共同調(diào)節(jié)的蛋白可逆性磷酸化在進(jìn)化上高度保守［3］。在原核生物中，信號感知和信息傳遞主要是由組氨酸激酶感應(yīng)蛋白和效應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白組成的雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)來完成的［4］。但越來越多的研究證明，細(xì)菌和古菌也存在著多種類型的類真核絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（ESTK）和蛋白磷酸酯酶（ESTP）［5］。一些包括金黃色葡萄球菌在內(nèi)的致病菌，它們中的類真核絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶調(diào)控著壓力脅迫感應(yīng)、生物膜形成、細(xì)胞壁合成、芽孢生成等許多細(xì)胞過程，并與毒力密切相關(guān)［6-8］。

為揭示蛋白磷酸酯酶在金黃色葡萄球菌可逆性蛋白磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的功能和尋找新藥靶標(biāo)，實驗克隆表達(dá)了一種金黃色葡萄球菌蛋白磷酸酯酶并進(jìn)行了活性測定分析。研究工作為后續(xù)研發(fā)抗金黃色葡萄球菌有效藥物提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及試劑

金黃色葡萄球菌菌株Newman、大腸桿菌DH5α和BL21、質(zhì)粒pET32a為實驗室保存。PMD18-T和T4 DNA連接酶購自大連寶生物公司，Taq DNA聚合酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，限制性內(nèi)切酶購自Thermo scientific公司，基因組提取試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒及膠回收試劑盒購自Axygen公司，絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酯酶測定試劑盒購自Promega公司。

1.2 生物信息學(xué)分析

利用生物信息學(xué)網(wǎng)站http：//smart.embl-heidelberg.de/smart，對該蛋白酶基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行在線分析。

1.3 引物設(shè)計

參考Pubmed數(shù)據(jù)庫，利用Primer5軟件設(shè)計引物（下劃線標(biāo)注為外加酶切位點）：0140F：5′-GCCGGATCCTCAAACATAGCATTTTATGTCG-3′（BamH I）和0140R：5′-GCGGTCGACCTTTTCAACTTTAAAATCAAC-3′（Sal I）。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.4 基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增

按照基因組提取試劑盒上操作說明，提取基因組DNA。以提取的S.aueus Newman基因組DNA為模板，用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95℃5 min預(yù)變性，95℃30 s，65℃30 s，72℃1.5 min，共30個循環(huán)，末次循環(huán)后72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.5 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

將TA克隆測序正確的重組質(zhì)粒pMD18T-0140和載體pET32a分別進(jìn)行BamH I/Sal I雙酶切，回收純化后進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化。用酶切和PCR方法鑒定陽性克隆。

1.6 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

將過夜培養(yǎng)的重組菌以1∶100稀釋接種于含有100 μg·mL-1氨芐的LB液體培養(yǎng)基中震搖。當(dāng)菌液OD600達(dá)到0.5時，加入終濃度為1 mM·L-1的IPTG誘導(dǎo)不同時間，離心收集菌體后超聲破碎裂解。若蛋白以包涵體形式存在，則用含8 M尿素的緩沖液溶解，再緩慢稀釋至溶液中尿素終濃度為2 mol·L-1，4℃12 000 rpm·min-1離心15 min，SDS-PAGE電泳分析。

1.7 蛋白酶活性測定

按照絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酯酶測定試劑盒進(jìn)行。設(shè)7組，分別是：酶、底物、酶+底物、酶+底物+氯化鎂、酶+底物+氯化鎂+氟化鈉、酶+底物+氯化錳、酶+底物+氯化錳+氟化鈉。每組樣品加入緩沖液后37℃反應(yīng)3 min，隨后加入終止液室溫作用15 min。酶標(biāo)儀測定OD600nm值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成磷酸根濃度。實驗重復(fù)三次。

2 結(jié)果

2.1 目的蛋白結(jié)構(gòu)域

經(jīng)過在線SMART分析，目標(biāo)基因編碼的蛋白具有一個絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酯酶結(jié)構(gòu)域（PP2C結(jié)構(gòu)域），該結(jié)構(gòu)域位于蛋白N端（4-278AA）（圖1）。

圖1 目的基因的SMART分析Fig.1Analysis of SMART of target gene

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

從Newman菌株中PCR擴(kuò)增得到約1 536 bp的目的條帶（圖2），測序結(jié)果顯示序列全長為1 536 bp，其核苷酸序列與Pubmed數(shù)據(jù)庫上Newman菌株對應(yīng)的核苷酸序列同源性達(dá)99%，編碼511個氨基酸，閱讀框正確無誤。從轉(zhuǎn)化平板上挑取單菌落，小量培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用0140F/0140R引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，顯示一約1 536 bp大小條帶，用BamH I/Sal I雙酶切，獲得約1.5 kb和約5.9 kb大小兩條條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖2），說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 目的基因的分子克隆Fig.2Molecular cloning of target gene

2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

按照常規(guī)轉(zhuǎn)化方法，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET32a-0140轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21，以1 M濃度的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。同時設(shè)空菌BL21和轉(zhuǎn)入表達(dá)載體pET32的BL21做對照。通過不同時間（1 h，2 h，3 h和4 h）誘導(dǎo)，重組蛋白均得到良好誘導(dǎo)表達(dá)，且隨著時間的延長，重組蛋白表達(dá)量沒有顯著提高（圖3）。菌體誘導(dǎo)表達(dá)后，超聲裂解菌體，SDSPAGE電泳上清液和菌體沉淀發(fā)現(xiàn)，重組蛋白以包涵體的形式存在（結(jié)果未顯示）。

圖3 重組蛋白的表達(dá)Fig.3Expression of recombinant protein

2.4 重組蛋白的酶活性測定

應(yīng)用商品化試劑盒，對合適濃度的目標(biāo)蛋白進(jìn)行了磷酸酶活性測定。結(jié)果顯示，當(dāng)僅僅加入酶或/和底物時，反應(yīng)體系中游離磷酸的含量非常低。但加入Mg2+或Mn2+后，酶與底物寡肽反應(yīng)釋放的游離磷酸量顯著增高，分別達(dá)到約28%和35%。同時在加入絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酯酶特異性抑制劑NaF后，反應(yīng)體系中的蛋白磷酸酯酶活性受到抑制（圖4）。以上結(jié)果說明，實驗誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白具有蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酯酶活性，且這種去磷酸化活性受到Mg2+或Mn2+的激活和NaF抑制。

3 討論

細(xì)菌感染的蔓延和耐藥性菌株的出現(xiàn)，需要一種新的治療手段和治療藥物［8，9，10］。蛋白磷酸酯酶是細(xì)胞中催化可逆磷酸化反應(yīng)的關(guān)鍵酶，在生物進(jìn)化中高度保守［9，11］。目前，金黃色葡萄球菌可逆磷酸化信號途徑中關(guān)鍵分子特別是蛋白磷酸酯酶的鑒定識別已成為研究熱點。國外文獻(xiàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并報道了金黃色葡萄球菌類真核絲/蘇氨酸蛋白磷酸酯酶（STP1）參與細(xì)菌細(xì)胞壁的生物合成，對細(xì)菌毒力有調(diào)節(jié)作用，△STP1對萬古霉素的敏感性發(fā)生變化［12，13］。但對于其他金黃色葡萄球菌假定編碼的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酯酶基因及其功能研究，國內(nèi)外尚無報道［2］。研究通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)研究基因編碼蛋白具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酯酶結(jié)構(gòu)域（PP2C結(jié)構(gòu)域），并進(jìn)行了分子克隆和蛋白表達(dá)。酶活性測定表明，該基因編碼的蛋白具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酯酶活性。研究結(jié)果為后續(xù)開展基于蛋白磷酸酯酶的抗金黃色葡萄球菌感染治療藥物靶點篩選工作奠定了基礎(chǔ)。

圖4 重組蛋白的酶活性測定Fig.4Enzyme assay of recombinant protein

［1］唐俊妮，龍飛，史賢明，等.金黃色葡萄球菌基因組DNA提取方法的比較研究［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2008，118（8）：1467-1469.

［2］Cameron D R，Ward D V，Kostoulias X，et al.Serine/Threonine Phosphatase Stp1 Contributes to Reduced Susceptibility to Vancomycin and Virulence in Staphylococcus aureus［J］.The Journal of Infectious Diseases，2012，205：1677-1687.

［3］Kennelly P J.Archeal protein kinases and protein phosphatases-insights from genomics and biochemistry［J］. The Biochemical Journal，2003，370：373-389.

［4］Macek B，Gnad F，Soufi B，et al.Phosphoproteome analysisof E.coli reveals evolutionary conservationof bacterial Ser/Thr/Tyr phosphorylation［J］.Molecular&cellular proteomics，2008（7）：299-307.

［5］張皓，田金華，樸明淑，等.氣腫疽梭菌鞭毛基因克隆載體的構(gòu)建［J］.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報，2015，37（2）：91.［6］Shah I M，Laaberki M H，Popham D L，et al.A eukaryoticlike Ser/Thr kinase signals bacteria to exit dormancy in response to peptidoglycan fragments［J］.Cell，2008，135：486-496.

［7］Burnside K，Lembo A，Reyes M，et al.Regulation of Hemolysin Expression and Virulence of Staphylococcus aureus by a Serine/Threonine Kinase and Phosphatase［J］.PLoS ONE，2010，5（6）：11071.

［8］Liebeke M，Meyer H，Donat S，et al.A Metabolomic View of Staphylococcus aureus and Its Ser/Thr Kinase and Phosphatase Deletion Mutants：Involvement in Cell Wall Biosynthesis［J］.Chemistry&Biology，2010，27：17820-81730.

［9］王超，曲曉軍，崔艷華.cDNA-AFLP技術(shù)及其在基因差異表達(dá)中的應(yīng)用［J］.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014，42（21）：6937-6940.

［10］代建，樊自堯，楊軒，等.定點突變阻止金黃色葡萄球菌α-溶血素溶血活性［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，2014，26（2）：44-49.

［11］杜驍杰，潘秀珍.真核樣絲氨酸蘇氨酸激酶在鏈球菌中的研究進(jìn)展［J］.中國病原生物學(xué)雜志，2014（3）：282-285.

［12］于立權(quán).白念珠菌CaPTC6和CaHXT5基因及釀酒酵母ScATP16基因的功能研究［D］.天津：天津大學(xué)，2010.

［13］Débarbouillé M，Dramsi S，Dussurget O，et al.CharacterizationofaSerine/ThreonineKinaseInvolvedin Virulence of Staphylococcus aureus［J］.Journal of Bacteriology，2009，191（13）：4070-4081.

Cloning，Expression and Enzyme Assay of Staphylococcus aureus Protein Phosphatase Gene

Lv Maoli，Yu Liquan，Qin Xuegong，Cui Yudong
（College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

Staphylococcus aureus was an important pathogen causing various infections of human and livestock.Targeting of a drug was a new approach of developing new drugs against S.aureus.A S.aureus gene was cloned，then induced protein was expressed and enzyme assay was conducted.The results showed that the recombinant protein coded by the gene had serine/threonine protein phosphatase activity.This work provided a reference points for further investigating the protein as target for a drug.

Staphylococcus aureus；protein phosphatase；enzyme assay

Q933

A

1002-2090（2016）04-0072-03

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.04.016

2015-03-19

黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)“博士科研啟動基金”（校啟2011YB-15）；國家自然基金面上項目（31072120）。

呂茂利（1976-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院2012級碩士研究生。

秦學(xué)功，教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：flyylq@163.com；崔玉東，教授，博士研究生導(dǎo)師，cuiyudong@yahoo.com。