令利軍，馮 蕾，雷 蕾，何 楠，丁 蘭

(西北師范大學生命科學學院,甘肅蘭州 730070)

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地衣芽孢桿菌TG116誘導黃瓜抗病性相關防御酶系的研究

令利軍，馮 蕾，雷 蕾，何 楠，丁 蘭

(西北師范大學生命科學學院,甘肅蘭州 730070)

為了探討地衣芽孢桿菌TG116誘導黃瓜抗病性機理，研究其對黃瓜葉片防御酶活性的影響.采用比色法測定了地衣芽孢桿菌TG116誘導黃瓜根部后對葉片中多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)等3種防御酶活性及丙二醛(MDA)含量的影響.結果顯示,經地衣芽孢桿菌TG116灌根處理后，黃瓜葉片中的POD、PPO、PAL等防御酶類活性升高，MDA含量略有下降并達到新的平衡；經黃瓜枯萎病病原菌灌根處理后，黃瓜葉片中的POD、PPO、PAL等防御酶活性及MDA含量迅速上升；尤其同時接種TG116和黃瓜枯萎病病原菌后，3種防御酶類活性上升的幅度比單獨接種要高，同時黃瓜葉片中MDA含量比單獨接種黃瓜枯萎病病原菌有所降低，減輕植株細胞膜脂過氧化損傷.研究表明,地衣芽孢桿菌TG116在一定程度上能夠誘導黃瓜的系統(tǒng)抗病性.

地衣芽孢桿菌；防御酶系；誘導系統(tǒng)抗性；誘導抗病性

誘導植物抗性是生防菌防治植物病害的主要作用機制之一，一些微生物可作為植物激活劑，誘導植物產生系統(tǒng)抗性，因而具有良好的防病效果[1-5].其作用機制是通過組織木質化從而增強細胞機械屏障，以及產生植保素、積累酚類等物質[6-7]，這些過程是通過防御酶系應答而實現(xiàn)，防御酶活力往往與抗病性呈正相關[8].寄主植物的防御酶系主要包括苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)、β-1，3-葡聚糖酶和超氧化物歧化酶(SOD)等.

近年來研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌(Bacillusssp)是生防菌的優(yōu)勢菌種，誘導植物抗性是其生防作用實現(xiàn)的重要機制之一[7-9]. 高偉[10]研究發(fā)現(xiàn)，海洋芽孢桿菌B-9987菌株能誘導番茄(Solanumlycopersicum)PAL,PPO,POD,CAT和SOD等5種防御酶的酶活性增強；陳劉軍等[11]用蠟質芽孢桿菌(Bacilluscereus)處理水稻(Oryzasativa)后發(fā)現(xiàn)，水稻的SOD,POD,PAL和CAT酶活力明顯增加；孫建波等[12]研究指出，香蕉經內生枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)XBl6灌根處理后，香蕉假莖中PPO及POD的活性相對于清水對照和接種病原菌均顯著提高，且與抗病性密切相關.生防菌處理植物后誘導其體內發(fā)生一系列有益于植物抗病性增強的生理反應現(xiàn)象，這對于農作物健康生長和防治植物病害具有重要意義.

TG116是由本課題組從獨角蓮(Typhoniumgiganteum)塊莖分離到的1株地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，其在平板對峙實驗中表現(xiàn)出對植物病原真菌的廣譜抗性，尤其對黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)有較強的抑菌作用[13].本文闡述了在單獨接種生防菌TG116及單獨接種黃瓜枯萎病病原菌和先接種生防菌TG116再接種黃瓜枯萎病病原菌等3種不同情況下，黃瓜葉片PAL、PPO和POD酶活性及MDA含量的變化趨勢，以期揭示TG116誘導黃瓜產生抗病性的作用機制，為進一步研究并闡明TG116對黃瓜植株的誘導抗性奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 材料

地衣芽孢桿菌TG116由本實驗室分離并保存.

黃瓜枯萎病菌由甘肅省農業(yè)科學院植物保護研究所李繼平研究員惠贈.

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g，瓊脂 18 g，葡萄糖 20 g，蒸餾水1 000 mL，pH為7.0左右[14].

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：牛肉浸膏 3 g，氯化鈉 5 g，蛋白胨 10 g，蒸餾水1 000 mL，pH為7.0～7.2[15].

1.3 植物病原真菌和誘抗細菌的培養(yǎng)及菌懸液的制備

TG116菌液的制備：將菌株TG116接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h，用無菌水配制成濃度為108CFU·mL-1的菌懸液.

植物病原真菌接種物的制備：將黃瓜枯萎病菌接種在PDA培養(yǎng)基上，25 ℃條件下培養(yǎng)7 d后，用無菌水洗脫孢子并配制成濃度為106CFU·mL-1的游動孢子懸浮液.

1.4 黃瓜的種植和誘導處理

用無菌水將籽粒飽滿的黃瓜種子沖洗干凈，置于55 ℃恒溫水浴中浸泡15 min后30 ℃培養(yǎng)箱中催芽，挑選出芽情況一致的種子每盆2粒播種于裝有滅菌營養(yǎng)土的花盆(80 mm×110 mm)中，待黃瓜幼苗長至3片真葉期時進行誘導處理[16].實驗設4個處理：1)單獨澆灌無菌水作為對照(CK)；2)單獨接種菌株TG116；3)單獨接種黃瓜枯萎病菌(P)；4)接種菌株TG116后間隔24 h再接種黃瓜枯萎病菌(TG116+ P).

1.5 PAL、PPO、POD活性和MDA含量的測定

PAL活性測定參照黃雪梅等[17]的苯丙氨酸法； PPO活性測定參照林植芳等[18]的鄰苯二酚法； POD活性和MDA含量測定參照魏學玲等[19]的愈創(chuàng)木酚法和硫代巴比妥酸法進行測定.實驗設3次獨立重復試驗.

2 結果與分析

2.1 PAL活性變化

由圖1可知，在0～9 d內，對照組黃瓜葉片PAL活性變化平穩(wěn)且處于較低水平.單獨接種病原菌時，PAL活性在1～5 d內逐漸上升，而后緩慢下降，其酶活峰值(5.60 U·gFW-1)明顯高于對照組(3.51 U·gFW-1).而經菌株TG116單獨處理植株后，PAL活性在1～5 d快速升高至峰值，第7 d有明顯的下降，但至第9 d時PAL酶活仍是對照組的1.49倍.TG116+P組PAL酶活變化趨勢與單獨接種TG116相似，但是酶活性要比對照組明顯升高，同樣在第5 d時PAL活性達到峰值(8.95 U·gFW-1)，此時的PAL酶活分別是單獨接種TG116和對照處理的1.20倍和2.55倍.實驗表明，單獨接種病原菌和TG116能夠誘導黃瓜葉片中PAL活性的升高，而且在病原菌脅迫下，植物可以通過TG116誘導獲得更高的PAL活性，以緩解生物脅迫造成的傷害.

圖1 菌株TG116誘導處理對黃瓜葉片中 PAL酶活力的影響Fig 1 The activity of PAL in cucumber leaves after strain TG116 treatment

2.2 PPO活性變化

由圖2可知，經菌株TG116單獨誘導處理，PPO活性在1～3 d內逐漸上升達到峰值后再適度下降，至第9 d時酶活性又有所回升且保持在較高水平.TG116+P組PAL活性升幅最大，在第5 d時PPO活性達到峰值(15.43 U·gFW-1)，分別是單獨接種TG116和對照處理的1.27倍和1.87倍.病原菌單獨接種后，葉片中PPO活性的增加幅度遠小于單獨接種TG116處理組及TG116+P處理組，且PPO活性回調速度比后2組要迅速,說明TG116誘導接種有利于PPO的積累.TG116處理組和TG116+P處理組相比，說明在病原菌的脅迫下，TG116有利于抗病相關酶PPO的積累，從而有利于植物對脅迫產生積極應答.

圖2 菌株TG116誘導處理對黃瓜葉片中 PPO酶活力的影響Fig 2 The activity of PPO in cucumber leaves after strain TG116 treatmen

2.3 POD活性變化

由圖3可知，TG116處理黃瓜葉片后，黃瓜葉片中POD酶活性明顯增高，其中以TG116+P處理組POD酶活性升高最為明顯，5 d后POD酶活性達到峰值(20.82 U·gFW-1)，為CK的1.69倍.與之相比，單獨接種病原菌組，黃瓜葉片POD活性明顯高于對照組，但出現(xiàn)了上升、下降交替變化趨勢，說明TG116誘導接種對黃瓜葉片中POD酶活性的表達有促進和穩(wěn)定表達作用，在植株感病情況下，經TG116誘導可產生并積累更多的POD，幫助植株對病原菌等生物脅迫產生積極應答.

圖3 菌株TG116誘導處理對黃瓜葉片中 POD酶活力的影響Fig 3 The activity of POD in cucumber leaves after strain TG116 treatment

2.4 MDA活性變化

由圖4可知，單獨接種病原菌黃瓜葉片中MDA含量明顯上升，于第3 d達到最大值后逐漸下降，但5～9 d其含量仍高于對照組、單獨接種TG116和TG116+P組.TG116+P組較單獨接種病原菌相比，黃瓜葉片中MDA含量有較大幅度降低，并在第3 d后逐步恢復至接近正常水平.單獨接種TG116，MDA含量在1～3 d內呈緩慢下降趨勢，3 d后開始回升達到新的動態(tài)平衡，與對照相比略有下降.這可能是因為TG116菌液中含有某種保護膜脂過氧化的物質，也可能因其能夠誘導黃瓜苗產生系統(tǒng)抗性激發(fā)黃瓜苗體內其他的活性氧代謝途徑從而降低了細胞的膜脂過氧化程度，減少了MDA的生成，從而達到植物組織免受破壞作用.

圖4 菌株TG116誘導處理對黃瓜葉片中 MDA酶含量的影響Fig 4 The content of MDA in cucumber leaves after strain TG116 treatment

3 討論

誘導植物抗性現(xiàn)已成為植物病害生物防治和現(xiàn)代農藥發(fā)展的新理念.研究發(fā)現(xiàn)[20]，參與植物體內多種防衛(wèi)反應的PAL、PPO及POD等酶系與植物抗病性密切相關.PAL活性升高有利于植物抗病作用的發(fā)揮，它是莽草酸途徑的限速酶，由該途徑合成的中間產物都是植物體內一些重要的抗菌物質，如酚類物質、植保素和木質素等[21]；POD能夠清理植物體內的活性氧，同時可催化酚類物質的前體合成木質素，加固植物細胞壁，形成防衛(wèi)屏障從而抵御病原物的入侵[22-23]；PPO可以氧化酚類物質生成具有更強毒性的醌類物質，直接毒殺入侵的病原菌[20].

很多研究表明[24-27]，誘導抗性可使植株內PAL、PPO及POD活性增強，如短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)203-6和203-7誘導甜菜的抗病性與POD活性提高密切相關[24].徐韶等[25]研究發(fā)現(xiàn)，內生枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)B6和木霉(Trzchocerma)T23復合接種能夠誘導甜瓜根系PAL、POD和PPO活性有不同程度的提高.這些酶類的活性與植株抗病性呈正相關，在植物的抗病反應中起到非常重要的作用[24-27]，因此通常以這3種酶作為衡量植物體內防御反應的重要指標.

本研究結果表明，TG116灌根處理黃瓜后，黃瓜葉片中PPO、POD及PAL活性均比無菌水對照組和接種病原菌明顯提高，這與前人相關的研究結果相吻合[24-27].TG116與病原菌共同接種后， PPO、POD及PAL酶活性升高的幅度均高于單獨接種病原菌，說明接種TG116有利于誘導植株抗性相關酶系的表達.MDA含量可以反映細胞的膜脂過氧化程度[28]，單獨接種植物病原真菌后MDA含量明顯升高，菌株TG116和病原菌共同接種的處理MDA含量較單獨接種植物病原真菌低，說明TG116能夠抑制因病原菌脅迫而誘發(fā)的MDA含量升高，從而通過降低生物脅迫誘發(fā)的膜脂過氧化程度而達到保護植株的作用.以上結果均表明，TG116誘導的系統(tǒng)抗性可能是其生物防治作用的防治機制之一.

王淑霞等[26]用哈茨木酶(Trichodermaharzianum, Tr-92)誘導處理黃瓜根部后測定相關酶活力變化，發(fā)現(xiàn)施用生防菌后可促進相關酶活力的提高，與本實驗結果的變化趨勢一致.但是經哈茨木酶Tr-92單獨誘導處理，POD、PPO及PAL酶活力均在第2 d達到峰值；經哈茨木酶Tr-92+H誘導處理，PAL于第3 d達到酶活峰值.本實驗TG116單獨誘導處理組和TG116+H誘導處理組POD、PPO、PAL酶活力均在第5 d達到高峰，說明不同的生防菌對同一種植物進行誘導處理時，酶活力高峰出現(xiàn)的時間是不同的.林陳強等[27]指出，枯草芽孢桿菌(Bsubtilis)CSl6誘導香蕉(Musanana)抗病性相關防御酶系的研究中發(fā)現(xiàn)，CS16也可以誘導香蕉葉片中PAL、POD和PPO酶活性的上升，但CS16誘導處理香蕉葉片中的PPO酶活性在第8 d已低至對照水平，而用地衣芽孢桿菌TG116處理黃瓜葉片PPO酶活性在第9 d仍明顯高于對照水平.周林等[28]在枯草芽孢桿菌(Bsubtilis)TR21對香蕉抗病相關酶活的誘導作用的研究中發(fā)現(xiàn)，灌根處理TR21后測定香蕉葉片中3種防御酶類的活性表明，經TR21發(fā)酵液處理后葉片中PPO、POD和PAL活性均顯著高于清水對照，但是TR21誘導處理香蕉葉片中的POD、PPO在第5 d已低至對照水平，PAL在第7 d明顯降低.地衣芽孢桿菌TG116處理黃瓜葉片PAL,PPO,POD酶活性在第9 d處于較高水平，這些均說明地衣芽孢桿菌TG116誘導處理具有較好的持效性.

綜上所述，地衣芽孢桿菌TG116發(fā)酵液不僅具有抑菌作用[11]，還可以通過誘導植物防御酶系活性的提高從而增強植株的抗病性.有關地衣芽孢桿菌TG116發(fā)酵液中不同成分在防治黃瓜病害的過程中所起的作用還有待于進一步研究和探討.

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(責任編輯 俞詩源)

Induction of defense-related enzymes in cucumber roots byBacilluslicheniformisStrain TG116

LING Li-jun,FENG Lei,LEI Lei,HE Nan,DING Lan

(College of Life Science，Northwest Normal University，Lanzhou 730070，Gansu，China)

To probe into the biocontrol mechanism ofBacilluslicheniformisStrain TG116 and develop effective biocontrol agents,we determine the activities of polyphenol oxidase(PPO),peroxidase(POD),phenylalanine(PAL) and content of maleic dialdehye(MDA) of cucumber after being inoculated with strain TG116.Results suggest that after inoculation of cucumber roots with TG116,activities of POD,PPO,PAL in cucumber leaves are increased,content of MDA is decreased slightly and reached a new equilibrium.After inoculation of cucumber roots withFusariumoxysporum,activities of defense enzymes and content of MDA in cucumber leaves are increased,especially after inoculated both strain TG116 andFusariumoxysporum,the ascensional range of three kinds of defense enzymes’ activities is higher than that of single inoculation.Meanwhile,the content of MDA in cucumber leaves after being inoculated Strain TG116 is decreased,it reduces the plant cell membrane lipid peroxidation damage.Our results suggest thatBacilluslicheniformisstrain TG116 can induce disease resistance of cucumber.

Bacilluslicheniformis;defensive enzymes;induced systemic resistance;induced resistance

10.16783/j.cnki.nwnuz.2016.01.019

2015-10-08;修改稿收到日期:2015-11-27

甘肅省科技支撐計劃資助項目(1304NKCA143)；甘肅省高?？蒲许椖?2013A-011)；西北師范大學青年教師提升計劃資助項目(NWNU-LKQN-10-18)

令利軍(1975—)，男，甘肅天水人，副教授，博士，碩士研究生導師．主要研究方向為植物與微生物互作．

E-mail:linglijun@nwnu.edu.cn

Q 935

A

1001-988Ⅹ(2016)01-0100-05