李 婕，衣麗霞，趙 倩，徐仰倉

（天津市海洋資源與化學重點實驗室，天津科技大學海洋與環(huán)境學院，天津 300457）

不同水質(zhì)對杜氏鹽藻生長和生理的影響

李 婕，衣麗霞，趙 倩，徐仰倉

（天津市海洋資源與化學重點實驗室，天津科技大學海洋與環(huán)境學院，天津 300457）

分析杜氏鹽藻（Dunaliella salina）在不同水質(zhì)中的生長狀況，確定適合養(yǎng)殖杜氏鹽藻的水源.根據(jù) GB 17378.4—2007的方法檢測天津中心漁港海水、天津北疆電廠冷卻水、稀釋10倍后的青海柴達木盆地察爾汗鹽湖原鹵水、老鹵水及成礦鹵水的水質(zhì)后，將杜氏鹽藻接種于其中，分析水質(zhì)對鹽藻各生理指標的影響.結(jié)果表明：除青海柴達木盆地察爾汗鹽湖老鹵水外，其余4種水樣均可以用來培養(yǎng)鹽藻.雖然不同水質(zhì)對鹽藻生長及生理的影響不同，但綜合來看，利用稀釋 10倍后的成礦鹵水培養(yǎng)的杜氏鹽藻培養(yǎng)至第 15天時，硝酸還原酶活性為（4.41±0.18）μg/（mg·h），顯著高于用海水培養(yǎng)的杜氏鹽藻.培養(yǎng)至 21，d時，葉綠素質(zhì)量濃度為（24.9±1.0）mg/L，藻細胞質(zhì)量濃度為（409.5± 21.1）mg/L，與用海水培養(yǎng)的杜氏鹽藻間均無顯著性差異.凈光合速率為（128.6±3.0）μmol/（mg·h），呼吸速率為（28.2± 0.9）μmol/（mg·h）.證明在同樣的培養(yǎng)條件下，利用稀釋 10倍后的成礦鹵水培養(yǎng)的杜氏鹽藻與用海水培養(yǎng)的杜氏鹽藻積累同樣多的干物質(zhì).

杜氏鹽藻；水質(zhì)；光合速率；生長

杜氏鹽藻（Dunaliella salina）是一種嗜鹽的綠色微藻，含有豐富的 β-胡蘿卜素、蛋白質(zhì)、鹽藻多糖，在食品、醫(yī)藥保健以及化工和養(yǎng)殖業(yè)中具有獨特經(jīng)濟價值，是開發(fā)功能食品的優(yōu)質(zhì)原料［1-2］.近年來，世界市場上對天然 β-胡蘿卜素的需求量不斷增大［3］.我國目前養(yǎng)殖杜氏鹽藻的區(qū)域主要在內(nèi)蒙古的吉蘭泰、天津的塘沽、甘肅的張掖等地.為了擴大養(yǎng)殖區(qū)域，查明杜氏鹽藻能否在除海水外的其他水源中生長是必做的環(huán)節(jié).本文采集了天津塘沽的海水、鍋爐冷卻用海水及青海察爾汗鹽湖的水樣，檢測了3個區(qū)域的5種水樣的水質(zhì)，并研究了杜氏鹽藻在5種水質(zhì)中的生長情況和生理情況，以期為擴大我國杜氏鹽藻的養(yǎng)殖區(qū)域提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

1　材料與方法

1.1水樣來源及杜氏鹽藻培養(yǎng)方法

本實驗所用水樣分別取自天津中心漁港海水（1號）、天津北疆電廠冷卻水（2號）、青海柴達木盆地察爾汗鹽湖原鹵水（3號）、提鉀后老鹵水（4號）及成礦鹵水（5號），由于 3種鹵水鹽度較高，用鹽度計測量時已超過最大量程 100，故在后期水質(zhì)測定和鹽藻培養(yǎng)時將3種鹵水均稀釋10倍.

實驗用杜氏鹽藻（Dunaliella salina）購自中國科學院淡水藻種庫，以 Walne培養(yǎng)基培養(yǎng)［4］，培養(yǎng)液體積為 150，mL，接種量為 10%，，培養(yǎng)溫度為 30，℃，光照強度為3，550，lx，搖床轉(zhuǎn)速為130，r/min.

1.2水質(zhì)指標的檢測

水質(zhì)指標包括 pH、鹽度、汞、砷、鈣、鎂、氯、硫酸根、堿度、總氮、總磷，測定方法參照GB 17378.4—2007［5］的方法.

1.3鹽藻生長指標的檢測

1.3.1葉綠素、藻細胞的質(zhì)量濃度的測定

用紫外分光光度計測定652，nm處藻液的吸光度，根據(jù)式（1）計算出藻液葉綠素質(zhì)量濃度（mg/L）［6-7］.同時取適量藻液離心，去上清液，用生理鹽水反復洗滌 2～3次，烘干至質(zhì)量恒定，測定藻細胞的質(zhì)量濃度.

式中：ρ為葉綠素質(zhì)量濃度，mg/L；A652為652，nm處藻液的吸光度；34.5為吸收系數(shù).

1.3.2硝酸還原酶活性的測定

根據(jù)陳薇的離體法［8］得到含有硝酸還原酶的粗酶液，并測定粗酶液中的NO-2質(zhì)量濃度，再采用雙縮脲試劑法測定粗酶液中的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度.根據(jù)式（2）計算得出鹽藻硝酸還原酶活性，單位為μg/（mg·h）［6］.

式中：ρ0和ρ空白分別為粗酶液硝酸還原酶的質(zhì)量濃度、空白管硝酸還原酶的質(zhì)量濃度，μg/mL；Vt和 Vs分別為反應液總體積、測定時取樣體積，mL；ρ蛋白為粗酶液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL；t為反應時間，h.

1.3.3光合作用指標的測定

使用液相氧電極 Oxylab測定，使用前先進行飽和氧、零氧的標定.利用恒溫循環(huán)水浴系統(tǒng)，保持小室內(nèi)溫度為30，℃，轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速為50，r/min，設(shè)置光照強度分別為 0、1.11、2.78、5.56、8.33、11.11、13.89、16.67、19.44、22.22，lx，每個梯度保持 3，min，取藻液放入氧電極小室中開始檢測，結(jié)束后根據(jù)公式（3）計算得出藻液的光合速率（P），單位為μmol/（mg·h）.

式中：v為小室內(nèi)氧氣濃度變化速率，min-1；K為30，℃水中的溶氧量 235，μmol/L；60為換算系數(shù)，min/h；ρ為葉綠素質(zhì)量濃度，mg/L.

再利用 Matlab軟件擬合光合作用相關(guān)參數(shù)，擬合公式為式（4）［9-10］.

式中：Pm和 Rd分別為鹽藻理論上能達到的凈光合速率最大值、光照強度為零時的呼吸速率，μmol/（mg·h）；α 為初始斜率；I為光照強度，lx.

1.4數(shù)據(jù)處理

采用 SPSS 19.0 進行差異顯著性分析，*表示與天津中心漁港海水（1號）相比具有顯著差異（P＜0.05）.

2　結(jié)果與分析

2.1水質(zhì)檢測

水質(zhì)檢測結(jié)果見表 1.5種水樣均屬堿性，根據(jù)GB 3097—1997［11］，5種水樣在重金屬汞、砷質(zhì)量濃度方面均符合一類海水水質(zhì)標準.除1號外，其余4種水樣鹽度均高于世界海水平均鹽度 35［12］.以 1號海水作為參照，研究發(fā)現(xiàn)2號冷卻水的鈣離子質(zhì)量濃度高于1號水樣，3種鹵水的鈣離子質(zhì)量濃度低于1號水樣，分別為1號水樣的152%、4.6%、5.1%、4.2%，但鎂離子濃度較高，分別為1號水樣的143%、659%、680%、668%.同時水體總硬度（水中鈣、鎂離子的總質(zhì)量濃度）也較高，分別是 1號水樣的 158%、423%、437%、429%.氯離子質(zhì)量濃度分別是 1號水樣的145%、155%、202%、158%.硫酸根離子質(zhì)量濃度分別是 1號水樣的 103%、53.7%、6.8%、56.8%.碳酸根離子質(zhì)量濃度分別是 1號水樣的 431%、1，327%、 1，973%、1，279%，碳酸氫根離子質(zhì)量濃度分別是 1號水樣的 88.6%、54.1%、59.2%、56.2%.3種鹵水的總氮、總磷質(zhì)量濃度相對較高，其中 3號水樣的總氮、總磷質(zhì)量濃度分別是1號水樣的132.7%，和142.1%，，4號水樣的總氮、總磷質(zhì)量濃度分別是 1號水樣的169.7%，和163.2%，5號水樣的總氮、總磷質(zhì)量濃度分別是1號水樣的141.8%，和131.6%.

表1　水質(zhì)檢測結(jié)果Tab.1 Testing results of water quality

2.2不同水質(zhì)對鹽藻葉綠素、藻細胞質(zhì)量濃度的影響

不同水質(zhì)對鹽藻葉綠素和藻細胞質(zhì)量濃度的影響如圖 1所示.培養(yǎng)至第 21天時，不論從葉綠素質(zhì)量濃度的角度還是從藻細胞質(zhì)量濃度的角度分析，4號水樣顯著低于 1號（P＜0.05），其余各組與 1號間均無顯著性差異.

氮、磷是藻類葉綠素進行光合作用所必須的營養(yǎng)物質(zhì)，高玉榮等［13］發(fā)現(xiàn)葉綠素質(zhì)量濃度會隨著氮磷比的上升而上升.另外，鎂是葉綠素的重要組成部分［14］，鎂離子質(zhì)量濃度增大，有助于植物葉綠素的合成.5號水樣的氮磷比最高，鎂離子質(zhì)量濃度也最高（除 4號外），故葉綠素質(zhì)量濃度也相對最高.同時適當?shù)牡?、磷濃度可促進杜氏鹽藻的生長，質(zhì)量濃度足夠時，會合成一系列含氮、含磷的生命物質(zhì)，促進細胞的生長與代謝過程［15］.4號水樣為察爾汗鹽湖原鹵水提鉀后的老鹵水，雖然其稀釋 10倍后氮磷質(zhì)量濃度最高，但生長量最低.有研究表明老鹵水含硼量較高約為 100，mg/L［16］，而當培養(yǎng)液中硼質(zhì)量濃度大于8，mg/L時不利于鹽藻細胞的增長［17］.同時 4號水樣的鹽度為 59±1.2，約為 60，韋芳三等［18］發(fā)現(xiàn)，當鹽度超過 60時會抑制鹽藻的生物量.由此可推斷杜氏鹽藻在 4號水樣中生物量不高的可能原因是較高的鹽度和硼含量.

圖1　　不同水質(zhì)對鹽藻葉綠素、藻細胞質(zhì)量濃度的影響Fig.1　Chlorophyll content and dry weight of Dunaliella salina cultured with different water

2.3不同水質(zhì)對鹽藻硝酸還原酶活性的影響

培養(yǎng)至第15天時，1—5號各組鹽藻硝酸還原酶活性結(jié)果如圖2所示.除2號外，其余各組均與1號間有顯著性差異（P＜0.05）.硝酸還原酶是一種底物誘導酶，3NO-是硝酸還原酶的誘導劑，硝酸還原酶可將浮游植物所吸收的氧化態(tài)氮化合物轉(zhuǎn)化為還原態(tài)的氮，進一步合成氨基酸和蛋白質(zhì)［19］.因為 3號、5號鹵水中硝酸鹽氮含量高，當鹽藻利用水中的氮進行生物量積累時，硝酸還原酶活性也相應的提高.所以，當鹽藻培養(yǎng)至第 15天時，3號、5號的硝酸還原酶活性相對較高，故其在生長后期可以更好地吸收水中的氮化合物，為后期生物量的積累提供保證.

圖2　不同水質(zhì)對鹽藻硝酸還原酶活性的影響Fig.2 Nitrate reductase activity of Dunaliella salina cultured with different water

2.4不同水質(zhì)對鹽藻光合作用參數(shù)的影響

由于4號水樣鹽藻藻細胞密度較低，通過氧電極的方法無法檢測出其凈光合速率，故在本部分中只討論不同水質(zhì)對其余 4種水樣鹽藻光合作用的影響.在不同水質(zhì)條件下培養(yǎng)至第 15天時，1、2、3、5號水樣鹽藻的凈光合速率結(jié)果如圖 3（a）所示，2號、3號、5號顯著高于1號（P＜0.05）.因為植物進行光合作用需要 CO2作為原料，CO2溶于水后會以和的形式存在［20］，而4種水樣的的總含量分別為（137.8±3.0）、（139.9±1.8）、（140.7± 1.1）、（141.0±2.0）mg/L，說明稀釋 10倍后的鹵水中仍含有相對較高的，可為光合作用提供較充足的原料.1、2、3、5號水樣鹽藻的呼吸速率結(jié)果如圖 3（b）所示，2號、3號、5號顯著高于 1號（P＜0.05）.其中 3號水樣鹽藻的呼吸速率最高，為（35.7±0.5）μmol/（mg·h），說明杜氏鹽藻在 3號水中的生命活動旺盛.鹽藻的總光合速率結(jié)果如圖 4所示，說明在同樣的培養(yǎng)條件下，5號水樣鹽藻的呼吸速率雖然不是最低的，但就整體來看，凈光合作用的積累量與呼吸作用的消耗量之和為4組中最高的，所以利用 5號水樣培養(yǎng)杜氏鹽藻可以提高其對光的利用率，進而提高細胞的光合速率，最終增加藻細胞干物質(zhì)的積累.

圖3　　不同水質(zhì)對鹽藻凈光合速率和呼吸速率的影響Fig.3　Net photosynthetic rate and respiration rate of Dunaliella salina cultured with different water

圖4　鹽藻藻細胞質(zhì)量濃度與光合速率之間的關(guān)系Fig.4　The relationship between dry weight and photosynthetic rate of Dunaliella salina

2.5影響杜氏鹽藻生長的因素

根據(jù)文章上述實驗結(jié)果得知，在相同的培養(yǎng)條件下，利用不同的水源對杜氏鹽藻進行培養(yǎng)，會對鹽藻的生長有一定的影響.其中總氮、總磷及 Mg2+的質(zhì)量濃度高，會對鹽藻葉綠素的積累及生長產(chǎn)生積極的影響.但水源中含硼量和鹽度過高，則會抑制鹽藻的生長.質(zhì)量濃度高，會為鹽藻的光合作用提供充足的原料，提高其對光的利用率，促進鹽藻干物質(zhì)的積累.

3　結(jié) 論

利用5種不同水源對杜氏鹽藻進行培養(yǎng)，除青海柴達木盆地察爾汗鹽湖老鹵水外，其余4種水樣均可以用來培養(yǎng)鹽藻.雖然不同水質(zhì)對鹽藻生長及生理的影響不同，但綜合來看，利用稀釋 10倍后的成礦鹵水培養(yǎng)的杜氏鹽藻培養(yǎng)至第 15天時，硝酸還原酶活性為（4.41±0.18）μg/（mg·h），顯著高于用海水培養(yǎng)的杜氏鹽藻.培養(yǎng)至 21，d時，葉綠素質(zhì)量濃度為（24.9±1.0）mg/L，藻細胞質(zhì)量濃度為（409.5±21.1）mg/L，與用海水培養(yǎng)的杜氏鹽藻間均無顯著性差異.凈光合速率為（128.6±3.0）μmol/（mg·h），呼吸速率為（28.2±0.9）μmol/（mg·h）.證明在同樣的培養(yǎng)條件下，利用稀釋 10倍后的成礦鹵水培養(yǎng)的杜氏鹽藻與用海水培養(yǎng)的杜氏鹽藻積累同樣多的干物質(zhì).

察爾汗鹽湖地處青海省格爾木市，鹽湖中含有豐富礦物質(zhì)，同時青海省幅員遼闊、光照充足，若能利用鹽湖水在青海省進行鹽藻的培養(yǎng)，進而對其進行開發(fā)利用，是一種推動當?shù)亟?jīng)濟發(fā)展的新途徑.

［1］ 伍先紹，賀稚非，龔霄. 杜氏鹽藻及其在功能食品中的應用［J］. 中國食品添加劑，2008（2）：127-130.

［2］ 尹衛(wèi)強，劉穎芬，李炳乾，等. 國內(nèi)杜氏鹽藻綜合利用的現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢［J］. 鹽業(yè)與化工，2013（12）：1-3.

［3］ 熊科. 天然胡蘿卜素提取及制備相關(guān)產(chǎn)品的工藝技術(shù)研究［D］. 長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學，2008.

［4］ Walne P R. Culture of Bivalve Molluscs：50 Years' Experience at Conwy［M］. Hoboken：Wiley，1979.

［5］ 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會. GB 17378.4—2007海洋監(jiān)測規(guī)范·第 4部分·海水分析［S］. 北京：中國標準出版社，2007.

［6］ 高俊鳳. 植物生理學實驗指導［M］. 北京：高等教育出版社，2006：61-64.

［7］ 張其德. 測定葉綠素的幾種方法［J］. 植物學通報，1985（5）：60-64.

［8］ 陳薇，張德頤. 植物組織中硝酸還原酶的提取、測定和純化［J］. 植物生理學通訊，1980（4）：45-49.

［9］ Henley W J. Measurement and interpretation of photosynthetic light-response curves in algae in the context of photoinhibition and diel changes［J］. Journal of Phycology，1993，29（6）：729-739.

［10］ Liu Xiaojuan，Duan Shunshan，Li Aifei，et al. Effects of organic carbon sources on growth，photosynthesis，and respiration of Phaeodactylum tricornutum［J］. Journal of Applied Phycology，2008，21（2）：239-246.

［11］ 國家環(huán)境保護局. GB 3097—1997 海水水質(zhì)標準［S］.北京：中國標準出版社，1997.

［12］ 徐仰倉，于濤，許文宗，等. 祖厲河水質(zhì)狀況及養(yǎng)殖潛力分析［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2012（20）：10542-10544.

［13］ 高玉榮，黃玉瑤，曹宏，等. 氮磷對污水凈化中藻類葉綠素含量的影響［J］. 水生生物學報，1995（4）：291-298.

［14］ 張其德，張世平，張啟豐. 在植物光合作用中鎂離子的作用［J］. 黑龍江大學自然科學學報，1992（1）：82-88.

［15］ 陳晗華，錢凱先. 氮、磷對鹽藻生長及其β-胡蘿卜素積累的影響［J］. 浙江大學學報：工學版，1997（6）：731-736.

［16］ 吳學東. 察爾汗鹽湖老鹵萃取法深度除硼工藝研究［D］. 成都：成都理工大學，2012.

［17］ 楊曉玲，郭金耀. 硼對鹽藻生長與物質(zhì)積累的調(diào)控作用［J］. 鹽業(yè)與化工，2007（3）：20-22.

［18］ 韋芳三，李純厚，戴明，等. 鹽度變化對鹽藻生物量和總脂含量的影響［J］. 湖南農(nóng)業(yè)科學，2011（1）：134-136.

［19］ 王艷，唐海溶，蔣磊，等. 硝酸鹽對球形棕囊藻生長和硝酸還原酶活性的影響［J］. 植物學通報，2006（2）：138-144.

［20］ 池曉勁. 證明光合作用的原料、產(chǎn)物及條件的系列實驗［J］. 丹東師專學報，1997（1）：88-89.

責任編輯：郎婧

Effects of Different Water on the Growth and Physiology of Dunaliella salina

LI Jie，YI Lixia，ZHAO Qian，XU Yangcang
（Tianjin Key Laboratory of Marine Resources and Chemistry，College of Marine and Environmental Sciences，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）

By analysing the growth parameters of Dunaliella salina in different water sources，we found out which kind of water was suitable for culturing Dunaliella salina.The basic components of five different kinds of water were determined according to GB 17378.4-2007.They are the seawater from Tianjin Central Fishing Port，the cooling water from Tianjin Beijiang Power Plant and three kinds of brine from Chaerhan Salt Lake of Qinghai Chaidamu Basin which were diluted 10-folds.Those different water was used to culture Dunaliella salina，then we analysised their influence on the physical parameters of Dunaliella salina.Except the extracted potassium brine，all the other four kinds of water can be used to culture Dunaliella salina.Although the effects of different water on the growth and physiology of Dunaliella salina were different，after 15 days’ culture with the processed brine which had been diluted 10-folds，the nitrate reductase activity was（4.41± 0.18）μg/（mg·h），which was significantly higher than that of the Dunaliella salina which was cultured by seawater.After 21 days，the chlorophyll was（24.9±1.0）mg/L；the dry weight of the Dunaliella salina was（409.5±21.1）mg/L，which was not significantly higher than that of the Dunaliella salina cultured by seawater.The net photosynthetic rate was（128.6± 3.0）μmol/（mg·h），and the respiration rate was（28.2±0.9）μmol/（mg·h）.This shows that under identical conditions，Dunaliella salina cultured by processed brine which was diluted 10-folds can accumulate the same amount of dry matter as Dunaliella salina cultured by seawater.

Dunaliella salina；water quality；photosynthetic rate；growth

Q949.21+2

A

1672-6510（2016）04-0030-05

10.13364/j.issn.1672-6510.20150145

2015-10-09；

2016-01-05

天津市大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃資助項目（201510057096）；天津市科技興海資助項目（KJXH2012-14）

李 婕（1990—），女，甘肅蘭州人，碩士研究生；通信作者：徐仰倉，教授，xuyc@tust.edu.cn.