宋鐵峰，王 楠，王會琴，袁 穎，黃麗文，莊春雨，張同存

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

PKCα 抑制劑Calphostin C抑制TNF-α 誘導的骨髓間充質(zhì)干細胞遷移

宋鐵峰，王 楠，王會琴，袁 穎，黃麗文，莊春雨，張同存

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α ）可以誘導間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的遷移，但其促進遷移機制尚不清楚.研究使用Calphostin C抑制劑來抑制PKCα 的活性，從而研究TNF-α 誘導MSCs遷移的作用是否通過激活PKCα 來完成.利用50，ng/mL的TNF-α 處理MSCs，劃痕實驗和Transwell實驗表明TNF-α 可以誘導MSCs的遷移.加入PKCα 的抑制劑Calphostin C后，可以抑制TNF-α 對MSCs遷移或侵襲的誘導，并降低遷移標志基因MYL9（Myosin light chain 9，MYL9）、CYR61（Cysteine rich 61，CYR61）的表達.以上結(jié)果表明，PKCα抑制劑Calphostin C可以抑制TNF-α 誘導的MSCs遷移.

MSCs；遷移；TNF-α；PKCα

間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一種具有多向分化能力的干細胞［1-3］.間充質(zhì)干細胞不僅具有多向分化潛能，還能靶向遷移到損傷部位、慢性炎癥部位及腫瘤部位，對于這些部位起到一定程度的修復作用［4］.對于間充質(zhì)干細胞遷移機制的研究，有助于理解間充質(zhì)干細胞“歸巢”的分子機制，為自體修復和細胞治療提供理論依據(jù).間充質(zhì)干細胞的體內(nèi)歸巢和體外遷移也像細胞的其他生理活動一樣由不同因素誘導引發(fā)涉及不同的信號通路［5-7］.雖然多種誘導因子和信號通路被發(fā)現(xiàn)參與間充質(zhì)干細胞的遷移過程，但是其具體的遷移機制依然不明確.

腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF），能引起腫瘤出現(xiàn)壞死，而對正常組織細胞無毒性，故稱之為腫瘤壞死因子.腫瘤壞死因子有 3種亞型：TNF-α、TNF-β和 TNF-γ.TNF-α主要由單核細胞分泌，但在其他細胞中也有分泌，包括間充質(zhì)干細胞［8-9］.作為炎癥因子，TNF-α可以促進間充質(zhì)干細胞的遷移，TNF-α 在MSCs遷移和黏附中均占有重要的作用.

蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）是1977年在鼠腦的胞質(zhì)成分中發(fā)現(xiàn)的一種蛋白激酶，屬于多功能絲氨酸和蘇氨酸激酶，是 G蛋白偶聯(lián)受體信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)中的效應物.絲氨酸/蘇氨酸激酶，PKC家族有3個亞家族：經(jīng)典型 PKCS（α、β和 γ同種型）、新型PKCS（δ、θ、η、ε同種型）以及非典型PKCS（ζ和ι亞型）［10-11］.當被激活時，PKC磷酸化并轉(zhuǎn)運到細胞膜，可調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導途徑［12］，參與多種細胞遷移和侵襲過程.有文獻［13］報道，在肝癌細胞中 PKCα的表達誘導細胞的遷移和侵襲.有研究［14］顯示，TNF-α 通過PKC信號通路誘導肺腺癌細胞遷移.

研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可促進MSCs遷移，但TNF-α影響MSCs遷移的機制目前仍不清楚.因此，在本研究中，首先用TNF-α誘導MSCs遷移，再采用PKCα的特異性抑制劑Calphostin C，進一步研究PKCα 在TNF-α 促進MSCs遷移這一過程中的作用.

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物

健康SD（sprague dawley，SD）大鼠，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，實驗動物許可證號為SCXK-（軍）2012-0004，實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準.

1.1.2主要試劑

DMEM/LG培養(yǎng)基，Gibco公司；胎牛血清，浙江天杭生物科技有限公司；重組大鼠TNF-α，Peprotech公司；Calphostin C、MYL9抗體、CYR61抗體、β-actin抗體，Santa Cruz公司；DAPI、dNTP，北京索萊寶科技有限公司；IRDye?800，CW山羊抗鼠抗體、IRDye?680 山羊抗兔抗體，LI-COR公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Trizol裂解液，上海英俊生物技術(shù)有限公司；隨機引物 B0043，上海生工生物工程有限公司；Bestar?SybGreen qPCR Mastermix，DBI?Bioscience公司.

1.2方法

1.2.1骨髓間充質(zhì)干細胞的提取及體外擴增培養(yǎng)

SD大鼠間充質(zhì)干細胞的提取采用全骨髓貼壁法.選健康80～90，g的 SD大鼠，雄性，頸椎脫臼法處死.剪刀剪去皮毛，無菌條件下取股骨和脛骨，剔除骨表面肌肉.吸取含15%，胎牛血清的DMEM/LG放入已滅菌玻璃離心管中.剪開股骨、脛骨關(guān)節(jié)兩端，用 5，mL一次性注射器吸取培養(yǎng)基沖洗骨髓腔.將帶有骨髓懸浮物的培養(yǎng)液用移液器吹散后，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，置于37，℃、5%， CO2培養(yǎng)箱中進行原代細胞培養(yǎng).本研究所用的是第 3～7代的骨髓間充質(zhì)干細胞.

1.2.2細胞加藥處理

將MSCs以1×105，mL-1的密度接種于6孔板，分為4組：對照組，2%，血清DMEM/LG處理細胞；TNF-α 組，加 TNF-α（終質(zhì)量濃度 50，ng/mL）于 2%，血清的 DMEM/LG中，處理細胞 24，h；Calphostin C組，用含Calphostin C（終濃度0.1，μmol/L）的2%，血清的DMEM/LG處理細胞24，h；Calphostin C+TNF-α組，先用含Calphostin C（終濃度0.1，μmol/L）的2%，血清的DMEM/LG處理細胞1，h，再加入終質(zhì)量濃度為50，ng/mL的 TNF-α處理細胞 24，h.加藥處理 24，h后，收集上述細胞進行后續(xù)實驗.

1.2.3細胞劃痕實驗

將MSCs以1×105，mL-1的密度接種于6孔板，12～16，h后用 10，μL槍頭在細胞間按“十”字型劃出痕跡，同時加藥處理，24，h后在倒置顯微鏡下進行觀察拍照，觀察細胞的彌合修復能力.

1.2.4Transwell實驗

在 24孔板中加入 500，μL 10%，血清 DMEM/ LG（含所加的藥 TNF-α），然后在小孔內(nèi)放入小室，使小室下膜與培養(yǎng)基完全契合.在小室的上室中加入 5×104個細胞，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng).16，h后將Transwell的小室取出，用棉簽輕輕擦去上室的細胞，PBS洗2次，每次5，min.4%，多聚甲醛室溫固定下室細胞20，min，PBS洗2次，每次5，min.無水甲醇浸泡下室膜20，min，PBS洗2次，每次5，min.用DAPI染細胞核，室溫放置 15，min，PBS洗 2次，每次5，min.共聚焦顯微鏡下照相.

1.2.5RNA的提取

用 0.5，mL Trizol裂解液在冰上裂解細胞15，min，重復吹懸使細胞充分裂解，加入0.1，mL的氯仿，劇烈振蕩 15，s，靜置 5，min，4，℃、12，000，r/min離心 10，min.取上層水相到另一 EP管中，加入等體積的異丙醇，混勻，-20，℃放置 30，min.12，000，r/min離心 10，min，棄掉上清液，加入 75%，乙醇 1，mL，洗滌RNA，離心棄掉上清液，室溫晾干 RNA.加入 20，μL DEPC水溶解RNA，放于-80，℃保存.

1.2.6RNA逆轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量 PCR（Real-time PCR）

將提取的RNA用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄方法進行逆轉(zhuǎn)錄.RNA 2，μg、隨機引物（B0043）5，μL，70，℃水浴5，min；迅速冰?。?0，mol/L dNTPs 5，μL、5×buffer 5，μL、RNAse inhibitor 0.625，μL、M-MLVRT 1，μL混勻，37，℃反應1，h；70，℃保持10，min終止反應.

用Bestar?SybGreen qPCR Mastermix進行Realtime PCR.擴增程序：95，℃ 2，min；95，℃ 10，s，60，℃30，s，72，℃ 30，s，40個循環(huán).融解曲線：95，℃ 1，min，55，℃ 1，min，95，℃ 10，s.目的基因引物：GAPDH上游5′-ATTCAACGGCACAGTCAAGG-3′，GAPDH下游5′-GCAGAAGGGGCGGAGATGA-3′；CYR61上游5′-GAAGAAATACCGGCCCAAAT-3′，CYR61下游5′-CAGACTGTAGAGGCGAAACGAC-3′；MYL9上游5′-ATGAGGAGGTGGACGAGATGT-3′，MYL9下游5′-CGTGCTTGAGGATGCGAG-3′.

1.2.7免疫印跡實驗（Western blot）

收集各組細胞，PBS洗1次，SDS細胞裂解液冰上裂解細胞，100，℃變性10，min，12%， SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至 NC膜.5%，的脫脂奶粉室溫封閉1，h后，分別用β-actin抗體（1∶500）、CYR61抗體（1∶500）、MYL9抗體（1∶500）4，℃孵育過夜，PBS洗3次，每次10，min；IRDye?800，CW 山羊抗鼠抗體（1∶5，000）、IRDye?680 山羊抗兔抗體（1∶5，000）室溫孵育 2，h后，PBS洗 3次，每次 10，min，Odyssey成像系統(tǒng)進行掃膜成像.

1.2.8統(tǒng)計學分析

所有實驗數(shù)據(jù)均用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件計算，實驗數(shù)據(jù)均以“平均值±標準差”表示.用t檢驗顯著性，*表示統(tǒng)計學上有顯著性差異（P＜0.05）.

2　結(jié)果與分析

2.1劃痕檢測加入 Calphostin C后對 TNF-α 誘導MSCs遷移作用的影響

利用劃痕實驗檢測細胞的遷移能力，結(jié)果如圖 1所示.加入TNF-α 的MSCs細胞的愈合程度大于沒有處理的MSCs細胞的愈合程度，證明 TNF-α 可以促進MSCs細胞的遷移.而加入Calphostin C+TNF-α 組的 MSCs細胞愈合程度小于加入 TNF-α 組的MSCs細胞愈合程度，證明 PKCα 的活性被抑制后，TNF-α 促進MSCs細胞的遷移作用也被抑制.

圖1　Calphostin C抑制 TNF-α 誘導的 MSCs細胞遷移能力Fig.1　Calphostin C inhibits MSC migration induced by TNF-α

2.2Transwell檢測加入Calphostin C后對TNF-α促侵襲作用的影響

利用 Transwell實驗檢測了細胞的侵襲能力，結(jié)果如圖2所示.

圖2　Calphostin C抑制TNF-α 誘導的MSCs細胞侵襲能力Fig.2　Calphostin C inhibits MSC invasion induced by TNF-α

加入TNF-α的MSCs細胞的侵襲能力大于沒有處理的 MSCs細胞的侵襲能力，證明 TNF-α可以促進MSCs細胞的侵襲.而加入Calphostin C+TNF-α組的 MSCs細胞侵襲能力小于加入 TNF-α 組的MSCs細胞侵襲能力，證明 PKCα的活性被抑制后，TNF-α促進MSCs細胞的侵襲作用也被抑制.

2.3檢測遷移marker的表達變化

細胞外基質(zhì)蛋白 CYR61、細胞骨架蛋白 MYL9與細胞遷移有直接的關(guān)系［15-16］.利用 Real-time PCR的方法檢測遷移maker MYL9、CYR61，mRNA水平的變化，結(jié)果如圖3所示.TNF-α可以促進MYL9、CYR61，mRNA 表達的升高，而加入 Calphostin C抑制 PKCα 的活性后，TNF-α 的這種上調(diào)遷移 marker表達的能力被抑制.

圖3　Calphostin C抑制 TNF-α 誘導的 MSCs細胞遷移maker mRNA表達水平Fig.3 Calphostin C inhibits the mRNA levels of migration markers induced by TNF-α in MSCs cells

利用Western blot檢測這兩種基因蛋白水平的變化，如圖4所示.結(jié)果與mRNA水平的變化一致，進一步證明了TNF-α 促進MSCs細胞的遷移能力是通過激活PKCα.

圖4　Calphostin C抑制 TNF-α誘導的 MSCs細胞遷移maker蛋白表達水平Fig.4 Calphostin C inhibits the protein expression of migration markers induced by TNF-α in MSCs cells

3　討 論

腫瘤壞死因子 TNF-α 分泌前體是跨膜蛋白，然后經(jīng)過 TNF-α 轉(zhuǎn)化酶的剪切修飾轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄誀顟B(tài).每一種可溶性的亞型均有生理活性，TNF-α 的主要生理作用都是通過TNFR1，將信號傳達到細胞內(nèi)，啟動一系列的生理反應.作為炎癥因子，TNF-α 促進間充質(zhì)干細胞的遷移已有相關(guān)研究.有研究［5］顯示，TNF-α 可以增強間充質(zhì)干細胞的遷移能力，增加ERK的磷酸化和p38蛋白的磷酸化；加入 p38的抑制劑 SB203580后，細胞間黏附分子 1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）表達升高，抑制了TNF-α 引起的間充質(zhì)干細胞的遷移.在 Ponte等［17］的研究中，發(fā)現(xiàn) TNF-α 可以大大增強趨化因子RANTES（regulated upon activation normal T cell expressed and secreted facyor，RANTES）和SDF-1（stromal-cell derived factor-1，SDF-1）誘導 MSCs遷移的能力.PKCα 是信號傳導PKC的大家族成員之一，在肝癌細胞中，PKCα 激活AKT/MAPK信號通路，誘導細胞的增殖、遷移和侵襲［13］.研究［14］顯示，在人的肺腺癌細胞中，TNF-α 誘導的 CLDN1（claudin-1，CLDN1）表達及細胞遷移通過 PKC信號通路.同時有文獻報道，MSCs的遷移與PKC信號通路相關(guān)，Lin等［18］發(fā)現(xiàn)白細胞介素1β（interleukin 1β，IL-1β）通過 PKC信號通路激活肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase，MLCK），從而誘導MSCs遷移.Tang等［19］發(fā)現(xiàn)乙酰膽堿通過PKC信號通路誘導MSCs遷移.

本文發(fā)現(xiàn)TNF-α 可以促進MSCs細胞遷移和侵襲，并且通過加入PKCα 特異性抑制劑Calphostin C證實 TNF-α 誘導 MSCs細胞遷移通過 PKCα 通路.接下來可以通過RNA干擾技術(shù)敲低PKCα ，進一步驗證結(jié)論作出補充.雖然多種誘導因子和信號通路被發(fā)現(xiàn)參與間充質(zhì)干細胞的遷移過程，但是其具體的遷移機制依然不明確.在 TNF-α 誘導的MSCs遷移過程中是否還存在其他分子參與其中，激活PKCα 從而促進TNF-α 誘導MSCs遷移是不是唯一的途徑，這些問題還有待于進一步研究.

［1］ Zipori D. The stem state：Plasticity is essential，whereas self-renewal and hierarchy are optional［J］. Stem Cells，2005，23（6）：719-726.

［2］ Roufosse C A，Direkze N C，Otto W R，et al. Circulating mesenchymal stem cells［J］. International Journal of Biochemistry & Cell Biology，2004，36（4）：585-597.

［3］ Mannello F. Commentary：Multipotent mesenchymalstromal cell recruitment，migration，and differentiation：What have matrix metalloproteinases got to do with it？［J］. Stem Cells，2006，24（8）：1904-1907.

［4］ Karp J M，Leng T G. Mesenchymal stem cell homing：The devil is in the details［J］. Cell Stem Cell，2009，4（3）：206-216.

［5］ Fu X，Han B，Cai S，et al. Migration of bone marrowderived mesenchymal stem cells induced by tumor necrosis factor-alpha and its possible role in wound healing［J］. Wound Repair And Regeneration，2009，17（2）：185-191.

［6］ Rattigan Y，Hsu J M，Mishra P J，et al. Interleukin 6 mediated recruitment of mesenchymal stem cells to the hypoxic tumor milieu［J］. Experimental Cell Research，2010，316（20）：3417-3424.

［7］ Zou C，Luo Q，Qin J，et al. Osteopontin promotes mesenchymal stem cell migration and lessens cell stiffness via integrin beta1，F(xiàn)AK，and ERK pathways［J］. Cell Biochemistry And Biophysics，2013，65（3）：455-462.

［8］ Li Quansheng，Yu Ping，Wang Wei，et al. Gene expression profiles of various cytokines in mesenchymal stem cells derived from umbilical cord tissue and bone marrow following infection with human cytomegalovirus［J］. Cellular & Molecular Biology Letters，2014，19（1）：140-157.

［9］ Sethi G，Sung B，Aggarw B B，et al. TNF：A master switch for inflammation to cancer［J］. Frontiers In Bioscience，2008，13：5094-5107.

［10］ Ali A S，Ali S，El-Rayes B F，et al. Exploitation of protein kinase C：A useful target for cancer therapy［J］. Cancer Treatment Reviews，2009，35（1）：1-8.

［11］ Mackay H J，Twelves C J. Targeting the protein kinase C family：Are we there yet？［J］. Nature Reviews Cancer， 2007，7（7）：554-562.

［12］ Spitaler M，Cantrell D A. Protein kinase C and beyond［J］. Nature Immunology，2004，5（8）：785-790.

［13］ Wang J，Shao M，Liu M，et al. PKCα promotes generation of reactive oxygen species via DUOX2 in hepatocellular carcinoma［J］. Biochemical & Biophysical Research Communications，2015，463（4）：839-845.

［14］ Iitaka D，Moodley S，Shimizu H，et al. PKCσ-iPLA2-PGE2-PPARγ signaling cascade mediates TNF-α induced Claudin 1 expression in human lung carcinoma cells［J］. Cellular Signalling，2015，27（3）：568-577.

［15］ Luo Xuegang，Zhang Chunling，Zhao Wenwen，et al. Histone methyltransferase SMYD3 promotes MRTF-A-mediated transactivation of MYL9 and migration of MCF-7 breast cancer cells［J］. Cancer Letters，2014，344（1）：129-137.

［16］ Emre Y，Imhof B A. Matricellular protein CCN1/ CYR61：A new player in inflammation and leukocyte trafficking［J］. Seminars in Immunopathyology，2014，36（2）：253-259.

［17］ Ponte A，Marais E N，Gallay A，et al. The in vitro migration capacity of human bone marrow mesenchymal stem cells：Comparison of chemokine and growth factor chemotactic activities［J］. Stem Cells，2007，25（7）：1737-1745.

［18］ Lin C Y，Zu C H，Yang C C，et al. IL-1β-induced mesenchymal stem cell migration involves MLCK activation via PKC signaling［J］. Cell Transplantion，2014， 24（10）：2011-2028.

［19］ Tang J M，Yuan J，Li Q，et al. Acetylcholine induces mesenchymal stem cell migration via Ca2+/PKC/ERK1/2 signal pathway［J］. Journal of Cellular Biochemistry，2012，113（8）：2704-2713.

責任編輯：郎婧

Inhibiting the Migration of Mesenchymal Stem Cells Induced by TNF-α with PKCα Inhibitor Calphostin C

SONG Tiefeng，WANG Nan，WANG Huiqin，YUAN Ying，HUANG Liwen，ZHUANG Chunyu，ZHANG Tongcun
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）

Inflammatory cytokine TNF-α can induce the migration of MSCs，but the mechanism of migration remains unclear.This study used PKCα inhibitor Calphostin C to inhibit PKCα activity，in order to know whether the migration of MSCs induced by TNF-α was accomplished by activating PKCα.MSCs were treated with 50，ng/mL of TNF-α.Wound heal assay and Transwell assay confirmed that TNF-α could induce the migration of MSCs.PKCα inhibitor Calphostin C inhibited TNF-α-induced MSC migration or invasion and reduced the expression of migration marker genes MYL9，and CYR61.In conclusion，PKCα inhibitor Calphostin C can inhibit the migration of MSCs induced by TNF-α.

MSCs；migration ability；TNF-α；PKCα

Q28

A

1672-6510（2016）04-0015-05

10.13364/j.issn.1672-6510.20150148

2015-10-08；

2015-12-08

國家自然科學基金資助項目（31171303）

宋鐵峰（1990—），女，黑龍江人，碩士研究生；通信作者：張同存，教授，tony@tust.edu.cn.