劉 爽，石 歡，周 震

（1.天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，天津 300150；2.北京市大興區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，北京 102600）

化痰通絡法對rt-PA溶栓后急性腦梗死大鼠神經細胞凋亡及Caspase-12表達的影響*

劉 爽1，石 歡2，周 震1

（1.天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，天津 300150；2.北京市大興區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，北京 102600）

［目的］觀察化痰通絡方對急性腦梗死大鼠經重組組織纖溶酶原激活劑（rt-PA）溶栓治療后內質網應激（ERS）神經細胞凋亡途徑中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12（Caspase-12）蛋白和基因表達及神經元凋亡的影響。［方法］選擇160只健康的SD大鼠，隨機分為假手術組、模型組、rt-PA組和實驗組共4組。采用自身栓子法制備大鼠大腦中動脈栓塞模型（MCAO），實驗組與rt-PA組大鼠經尾靜脈注入rt-PA（濃度：5.67 mg/kg）溶栓治療，并聯(lián)合化痰通絡法中藥灌胃（濃度：7.2 g/kg），每日2次。每組分別于為6 h、24 h、3 d和7 d 4個時相，觀察梗死區(qū)域腦組織神經細胞Caspase-12蛋白和基因的表達，及神經元細胞凋亡的情況。［結果］與假手術組相比，模型組各時相Caspase-12蛋白與基因的表達量均明顯增加（P＜0.05）。與模型組相比，除7 d時rt-PA組Caspase-12蛋白表達減少，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）外，rt-PA組和實驗組在其他各時相Caspase-12蛋白與基因的表達均明顯減少（P＜0.05）。與rt-PA組相比，實驗組Caspase-12基因在1 d、7 d時表達量明顯減少（P＜0.05），而Caspase-12蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但有下降趨勢。［結論］化痰通絡法中藥可降低急性腦梗死大鼠溶栓治療后梗死區(qū)域Caspase-12蛋白和基因的表達，該法可能通過影響該環(huán)節(jié)，進而部分抑制內質網應激后期神經細胞的凋亡，從而防治急性腦梗死溶栓后缺血/再灌注的發(fā)生與發(fā)展。

化痰通絡法；急性腦梗死；溶栓；凋亡途徑；Caspase-12

1 實驗材料

1.1 動物 選取清潔級，體質量為200～250 g的健康SD大鼠160只，雄雌各半。大鼠均購自：北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部 ［許可證號：SZXK（京）2011-00120］。

1.2 試劑 實時定量熒光聚合酸鏈式反應（Real Time PCR）試劑如Oligo dT、dNTP、核糖核酸（RNA）抑制酶 ［均購自寶生物工程（大連）有限公司］；Caspase-12引物（上海生物工程有限公司合成）；Quanti Tect TM SYBR Green PCR Kit（購自QIAGEN公司）；逆轉錄酶、Go Taq Green Master mix（購自美國Promega）；Tunel試劑盒（購自碧云天生物試劑有限公司）等。

1.3 藥物 化痰通絡法方藥組成：天麻、半夏、膽南星、丹參、川芎、地龍、酒大黃7味中藥，共5付（400 g）加入10倍水煎煮，共3次，每次30 min，濃縮至生藥溶液500 mL（濃度為0.8 g/mL）。于天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院制劑室制備藥物，4℃保存?zhèn)溆?。注射用重組組織纖溶酶原激活劑（rt-PA）購自德國勃林格殷格翰公司（批號005765201304），血栓誘導劑購自長春國奧藥業(yè)有限公司（批號20081218）。

1.4 實驗儀器日本OLYMPU-IX71倒置顯微鏡和圖像分析系統(tǒng)、美國Beckman-coulter流式細胞儀、實時定量熒光PCR儀（RG-3000，Rotor-Gene生產）等。

2 實驗方法

2.1 動物模型的建立 首先要進行栓子的制備，完成后參照張新江等［4］方法建立大鼠大腦中動脈栓塞模型（MCAO）。rt-PA組、實驗組和模型組大鼠均進行造模。假手術組同模型制作，但只在注射時以生理鹽水0.3 mL代替栓子溶液。

2.2 動物分組與給藥方法 160只健康SD大鼠，按隨機數字表隨機分為假手術組40只、模型組40只、rt-PA組40只、實驗組40只。選取造模后6 h、24 h，3 d、7 d 4個時相［5］，各組各時相選取10只大鼠進行相應檢測。rt-PA組及實驗組進行rt-PA溶栓治療：于血栓注入后3 h，將濃度為5.67 mg/kg的rt-PA加入生理鹽水2 mL中，一次性由鼠尾靜脈緩慢注入（20 min）。同時實驗組結合化痰通絡法中藥灌胃治療，rt-PA組給予等劑量蒸餾水替代中藥灌胃治療，參照文獻［6］計算給藥劑量。假手術組及模型組在與灌服中藥相同時間點采用與中藥相等劑量的蒸餾水灌胃，同時于溶栓相同的時間點用與rt-PA溶劑相等劑量的生理鹽水由大鼠尾靜脈緩慢注入（同上）。

2.3 實驗室指標檢測方法 各組分別于6 h、24 h、3 d、7 d 4個時間點經相應處理將大鼠斷頭處死，并選取需要檢測的大鼠梗死部位腦組織。按照核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒說明抽提組織的總蛋白質，并進行蛋白質定量（單位：g/L）。采用蛋白印跡法（Western Blot）、實時定量熒光PCR法檢測凋亡性信號途徑中Caspase-12蛋白與基因表達，采用原位末端標記法（TUNEL法）檢測神經細胞凋亡情況。

2.4 統(tǒng)計方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示，計量資料組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較若方差齊采用LSD法，方差不齊采用Dunnett's T3法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 Western Blot結果 同一組內，和6 h相比，模型組7 d時Caspase-12蛋白相對豐度值明顯增加（P＜0.05），其余各組各時相Caspase-12蛋白相對豐度值均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），但均以1 d時相對豐度值為最高。同一時相內，與假手術組相比，模型組各時相中Caspase-12蛋白相對豐度值均明顯增加（P＜0.05）。與模型組相比，除rt-PA組7 d時降低無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），rt-PA組和實驗組在其他時相Caspase-12蛋白相對豐度值均明顯降低（P＜0.05）。與rt-PA組相比，實驗組在4個時相Caspase-12蛋白相對豐度值差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但存在降低趨勢。見表1，圖1。

表1 不同時相大腦梗死組織Caspase-12蛋白的相對豐度值（±s）Tab.1 Caspase-12 protein in cerebrum infarct tissue at each time（±s）

表1 不同時相大腦梗死組織Caspase-12蛋白的相對豐度值（±s）Tab.1 Caspase-12 protein in cerebrum infarct tissue at each time（±s）

注：同一組內和6 h相比，#P＜0.05；同一時相內，和假手術組相比，*P＜0.05；和模型組相比，△P＜0.05。

組別 24 h 3 d 7 d假手術組 0.95±0.08 0.92±0.11 0.87±0.06模型組 1.26±0.11*1.21±0.06*1.04±0.03#* rt-PA組 1.03±0.06△0.98±0.09△0.93±0.09實驗組 1.01±0.02△0.94±0.09△0.90±0.04△動物數40 40 40 40 6 h 0.91±0.06 1.13±0.02* 0.98±0.01△0.91±0.06△

圖1 各組不同時相大腦梗死組織Caspase-12蛋白的相對豐度值Fig.1 Caspase-12 protein in cerebrum infarct tissue at each time

3.2 PCR結果 同一組內，和6h相比，各組Caspase-12 mRNA表達量以1 d為最高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其他時相均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），均符合腦梗死發(fā)展規(guī)律。同一時相內，與假手術組相比，模型組4個時相Caspase-12 mRNA表達量均明顯增高（P＜0.05）；與模型組相比，rt-PA組和實驗組4個時相Caspase-12 mRNA表達量均明顯降低（P＜0.05）；與rt-PA組相比，實驗組在1d和7d時Caspase-12 mRNA表達量明顯下降（P＜0.05）。見表2。

表2 不同時相大腦梗死組織Caspase-12 mRNA表達量（±s）Tab.2 Caspase-12 mRNA in cerebrum infarct tissue at each time（±s）

表2 不同時相大腦梗死組織Caspase-12 mRNA表達量（±s）Tab.2 Caspase-12 mRNA in cerebrum infarct tissue at each time（±s）

注：同一組內和6 h相比，#P＜0.05；同一時相內，和假手術組相比，*P＜0.05；和模型組相比，△P＜0.05；和rt-PA組相比，▲P＜0.05。

組別 24 h 3 d 7 d假手術組 1.76±0.17#1.00±0.09 0.58±0.38模型組 9.74±1.37#*5.06±0.36* 2.81±0.18* rt-PA組 2.70±1.01#△1.33±0.41△1.08±0.18△實驗組 2.11±0.12#△▲1.07±0.25△▲0.98±0.54△動物數40 40 40 40 6 h 0.63±0.28 4.22±0.74* 1.31±0.23△0.95±0.15△

3.3 HE染色光鏡觀察皮質神經元結果 假手術組各個時相，神經元均著色均勻，可見深染核仁，少見紅色凋亡神經元。6 h時：模型組可見部分紅色凋亡神經元，神經元數量輕中度減少；rt-PA組和實驗組可見少部分紅色凋亡神經元，神經元數量輕度減少。24 h時：模型組大部分神經元高度腫脹，可見部分紅色凋亡神經元，神經元數量明顯減少；rt-PA組和實驗組部分神經元中度腫脹，可見少部分紅色凋亡神經元，神經元數量明顯減少，其中實驗組有明顯的炎性細胞浸潤現(xiàn)象。3 d時：模型組可見大部分紅色凋亡神經元，神經元數量明顯減少；rt-PA組和實驗組可見部分紅色凋亡神經元，神經元數量明顯減少，其中實驗組仍可見到明顯的炎性細胞浸潤現(xiàn)象。7 d時：模型組神經細胞明顯減少，可見絕大部分為紅色凋亡神經元；rt-PA組神經細胞明顯減少，大部分為紅色凋亡神經元；實驗組神經細胞中度減少，部分為紅色凋亡神經元。見圖2。

4 討論

腦梗死歸屬于中醫(yī)學中所講的“中風病”范圍。根據中醫(yī)學中“急則治其標”的治療原則，發(fā)病早期應投用化痰瀉濁、祛瘀通絡方藥可切中病機［7］?；低ńj法方中天麻性味甘平，為治風之神藥；半夏辛溫、膽南星性苦微辛，具有清熱化痰通絡之功；地龍咸寒，能清熱熄風通絡；川芎辛散上行，為血中氣藥；丹參味苦微寒，可涼血活血，兩藥合用可達行氣活血祛瘀之目的；酒大黃清熱祛瘀瀉濁，上述7味藥合用共奏祛風化痰、清熱瀉濁、祛瘀通絡之功效。在臨床對于超早期急性腦梗死風痰瘀阻證患者，采用化痰通絡法聯(lián)合溶栓治療也取得了滿意的療效。

ERS可以激活多條途徑誘導細胞凋亡［8］，盡管ERS介導的凋亡途徑并沒有完全闡明，但是內質網膜上的Caspase-12的活化已經被確認參與這個過程［8-9］。其中，Caspase-12是內質網應激導致凋亡的特異性介質，它使ERS可以不依賴于其他通路，而獨立誘導細胞凋亡，并且Caspase12的表達上調也在腦缺血/再灌注動物模型中被發(fā)現(xiàn)證實。內質網應激引起凋亡時，胞漿內的Caspase12被轉移至內質網表面，并被Caspase-7激活，移位到胞質后序貫激活Caspase-9與Caspase-3，進而引起細胞凋亡［10］。大腦中動脈栓塞1 h之后再灌注6～24 h，檢測發(fā)現(xiàn)Caspase-12合成被活化，并且其定位與神經細胞的凋亡相一致，同時隨著缺血/再灌注時間的延長，保護性因子GRP78/Bip的活性亦被Caspase-12抑制［11］。

圖2 各組大鼠皮質組織病理學觀察（HE染色，×40）Fig.2 Cortical histopathology of rats'cortex in each group（HE staining，×40）

本實驗研究結果顯示：rt-PA溶栓后可以部分的抑制MCAO梗死區(qū)出現(xiàn)的明顯神經元凋亡現(xiàn)象，再通過聯(lián)合化痰通絡法中藥治療，神經細胞凋亡明顯減少。而分子生物學機制研究進一步提示，實驗組可顯著降低模型大鼠梗死區(qū)域腦組織中升高的Caspase-12蛋白與基因的表達，效果優(yōu)于單純應用rt-PA溶栓治療組。綜上所述，本實驗選擇ERS特異性分子Caspase-12作為標志物，通過觀察不同時相Caspase-12蛋白和基因的表達變化以及神經細胞凋亡情況，得出化痰通絡法可以通過降低Caspase-12蛋白和基因的表達，部分抑制ERS后期神經細胞的凋亡，進一步防止急性腦梗死溶栓后缺血/再灌注的發(fā)生與發(fā)展。

［1］Cho S，Szeto HH，Kim E，et al.A novel cell permeable antioxidant peptide，SS31，attenuates ischemic brain by down-regulating CD36［J］.J Biol Chem，2007，282（7）：4634-4642.

［2］Wang X，Tsuji K，Lee SR，et al.Mechanisms of hemorrhagic transformation after tissue plasminogen activator reperfusion therapy for ischemic stroke［J］.Stroke，2004（35）：2726-2730.

［3］關麗英，許彩民，潘華珍.內質網應激介導的細胞凋亡［J］.生物化學與生物物理進展，2007，34（11）：1136-1141.

［4］張新江，常麗英，張?zhí)K明，等.大鼠自體血栓大腦中動脈閉塞模型的改良［J］.卒中與神經疾病，2003，10（1）：12-15.

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（本文編輯：馬 英，高 杉）

Effect on apoptosis of neural cell and Caspase-12 expression in rat cortex accepted Huatan Tongluo formula with thrombolysis pherapy after acute cerebral infarction

LIU Shuang1，SHI Huan2，ZHOU Zhen1
（1.The Second Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300150，China；2.Traditional Chinese Medicine Hospital of Beijing Daxing District，Beijing 102600，China）

［Objective］To observe the effect of Huatan Tongluo therapy on the expression of Caspase-12 protein，mRNA and apoptosis of nerve cells in the late of endoplasmic reticulum stress（ERS）in rat cortex accepted thrombolysis therapy with recombinant tissue-type plasminogen activator（rt-PA）after the acute cerebral infarction.［Methods］The 160 healthy SD rats which were randomly divided into sham group，model group，rt-PA group and experimental group.By using the MCAO rat model，the rats in rt-PA group and experimental group were injected rt-PA （concentration of 5.67 mg/kg），and those of experiment group were given Chinese herb of Huatan Tongluo therapy （concentration of 7.2 g/kg），2 times a day，and each group was observed at four time points：6 h，1 d，3 d and 7 d.And then respectively observe the gene expression of Caspase-12 protein and mRNA，and the apoptosis in rats'brain neurons.［Results］Compared with sham group，the expression of Caspase-12 protein and mRNA increased significantly （P＜0.05）.Compared with model group，the expression of Caspase-12 protein and mRNA increased significantly（P＜0.05）except 7 d which had no significant difference（P＞0.05）.Compared with rt-PA group，the expression levels of Caspase-12 mRNA of experiment group at 1 d and 7 d were significantly lower，and the protein had no significant difference with others（P＞0.05），but with down trend.［Conclusion］Huatan Tongluo therapy can reduce the activation of Caspase-12 protein and mRNA in ERS，and inhibit the apoptosis of nerve cells，prevent reperfusion injury after acute cerebra accepted thrombolysis.

Huatan Tongluo therapy；acute cerebral infarction；thrombolysis；apoptosis pathway；Caspase-12

R743.3

A

1672-1519（2016）10-0610-04

國家自然科學基金項目（81273942）；天津市應用基礎及前沿技術研究計劃（12JCZDJC25300）；天津市教委“十二五”創(chuàng)新團隊培養(yǎng)計劃資助（NO.TD12-5035）。

劉 爽（1984-），女，主治醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結合治療腦病的臨床、科研及教學工作。

周 震，E-mail：zhouzhen7681@126.com。

2016-05-01）

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.10.09

急性腦梗死發(fā)病急驟，病情變化迅速，早期有效的治療對患者十分重要。超早期溶栓治療是急性腦梗死的有效治療方法，然而溶栓治療后缺血再灌注損傷可導致缺血區(qū)域和周邊半暗帶區(qū)的神經細胞壞死與凋亡，進一步加重腦組織神經細胞繼發(fā)性損傷［1］，嚴重影響著患者的預后［2］。內質網（ER）穩(wěn)態(tài)的紊亂，特別是內質網應激（ERS）參與了腦缺血/再灌注后神經細胞凋亡的發(fā)生，可能是其中的關鍵因素［3］，近年來受到廣泛關注。長時間過強的ERS反應下，內質網穩(wěn)態(tài)若不能及時重新建立，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12（Caspase-12）作為特異性介質可使ERS不依賴于其他通路，而直接獨立誘導細胞凋亡。本次研究通過觀察化痰通絡法中藥對急性腦梗死大鼠溶栓治療后大腦皮質梗死區(qū)Caspase-12蛋白和基因表達的影響，探討其抑制神經細胞凋亡的可能作用機制。