林怡辰，孟范平，萬(wàn) 茹，杜永祥，王曰杰，崔鴻武 （中國(guó)海洋大學(xué)海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266100）

利用文蛤生物標(biāo)志物評(píng)價(jià)尾水-海水混合體系污染水平

林怡辰，孟范平*，萬(wàn) 茹，杜永祥，王曰杰，崔鴻武 （中國(guó)海洋大學(xué)海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266100）

采用不同濃度（體積比0%～40%，經(jīng)天然海水稀釋而成）的市政污水處理廠（MSTP）尾水對(duì)文蛤（Meretrix meretrix）連續(xù)培養(yǎng)9d，通過(guò)測(cè)定9種生化因子水平評(píng)價(jià)污染暴露對(duì)雙殼類的生物學(xué)效應(yīng)包括：內(nèi)臟中的超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPx）、谷胱甘肽還原酶（GR）、谷胱甘肽（GSH）、乙酰膽堿酯酶（AChE）、金屬硫蛋白（MTs）、硫代巴比妥酸反應(yīng)物（TBARs）以及血細(xì)胞的溶酶體膜穩(wěn)定性（LMS）.SOD、CAT除外的所有生化因子均能對(duì)尾水污染產(chǎn)生敏感響應(yīng)，其中，GPx、MTs、AChE和LMS的響應(yīng)與尾水濃度呈顯著相關(guān)（P＜0.05或P＜0.01），適于作為尾水污染的生物標(biāo)志物；依據(jù)這些生物標(biāo)志物計(jì)算的綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)指數(shù)值（IBRv2=0.61～2.65）隨尾水濃度上升而增大，且兩者間存在顯著相關(guān)性（P＜0.01）.研究結(jié)果表明，基于生物標(biāo)志物響應(yīng)值計(jì)算IBR指數(shù)的方法適于MSTPs尾水-海水混合體系的綜合污染評(píng)價(jià).

尾水；市政污水處理廠；海水；綜合評(píng)價(jià)；雙殼類動(dòng)物；生物標(biāo)志物

近岸海域往往是市政污水處理廠（MSTPs）尾水的受納水體.由于進(jìn)入MSTPs的生活污水和工業(yè)廢水中含有重金屬、表面活性劑、農(nóng)藥、多環(huán)芳烴（PAHs）、多氯聯(lián)苯（PCBs）等眾多種類的化合物和內(nèi)分泌干擾物，而現(xiàn)有的污水處理工藝難以將其有效去除［1-2］，因此這些化學(xué)物質(zhì)大多隨著尾水外排進(jìn)入海洋中.研究證明，某些異源物質(zhì)在痕量水平時(shí)即能對(duì)水生生物產(chǎn)生急性或亞致死毒性效應(yīng)［3］.針對(duì)此類含有復(fù)雜污染成分的混合體系，采用化學(xué)分析方法逐一監(jiān)測(cè)出所有污染物幾乎是不可能的，因而無(wú)法滿足海水綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)的需要.海洋生物長(zhǎng)期生存于一定范圍的海洋環(huán)境中，能夠在生物化學(xué)和細(xì)胞學(xué)水平上對(duì)化學(xué)污染物產(chǎn)生靈敏的響應(yīng).這些在亞致死劑量有毒化合物暴露下發(fā)生異常變化的分子學(xué)、細(xì)胞學(xué)指標(biāo)統(tǒng)稱為生物標(biāo)志物，它們?cè)趨^(qū)域環(huán)境污染預(yù)警方面具有重要作用.

海洋環(huán)境（特別是尾水受納海域）中常常同時(shí)存在著幾十種甚至上百種污染物，而每種生物標(biāo)志物能夠提供環(huán)境中一種或數(shù)種污染物質(zhì)的有用信息，這意味著海洋環(huán)境質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)需要篩選一套適宜的生物標(biāo)志物作為評(píng)價(jià)指標(biāo).近十多年來(lái)，法國(guó)、英國(guó)、德國(guó)、意大利等歐洲學(xué)者提出利用多種生物標(biāo)志物的同步響應(yīng)聯(lián)合指示海洋污染水平，并在對(duì)這些標(biāo)志物響應(yīng)信息進(jìn)行綜合統(tǒng)計(jì)的基礎(chǔ)上，發(fā)展了多種綜合指數(shù)方法用于某些海域污染特征的綜合診斷，取得了良好應(yīng)用效果，其中以綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)（IBR）指數(shù)應(yīng)用最為廣泛［4］.鑒于不同國(guó)家、城市的經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平存在差異，其MSTPs尾水中的污染成分種類也必然不同.只有根據(jù)一定區(qū)域尾水的性質(zhì)和特征，篩選出針對(duì)性強(qiáng)的生物標(biāo)志物組合，才能滿足納污海域的水質(zhì)評(píng)價(jià)需要.

雙殼類動(dòng)物在世界范圍內(nèi)廣泛分布，對(duì)污染物具有高富集能力，還能以籠養(yǎng)方式移植到指定站位作為流動(dòng)性生物監(jiān)測(cè)工具，有利于全面監(jiān)測(cè)排污區(qū)的污染程度［5］.文蛤是青島海域乃至我國(guó)北方近岸海域常見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)雙殼類動(dòng)物，易馴養(yǎng)且生命力強(qiáng)，對(duì)污染物有較敏感響應(yīng).本研究在前期探討青島市李村河污水處理廠尾水對(duì)文蛤抗氧化酶影響［6］的基礎(chǔ)上，采用青島市另一家污水處理廠——團(tuán)島 MSTPs的尾水（預(yù)先經(jīng)清潔海水稀釋至不同體積比濃度）對(duì)文蛤進(jìn)行暴露培養(yǎng)，目的是掌握更多有關(guān)雙殼類對(duì)MSTPs尾水的響應(yīng)特征，同時(shí)篩選出響應(yīng)敏感性強(qiáng)、線性好的生物標(biāo)志物構(gòu)成評(píng)價(jià)指標(biāo)，并采用IBR指數(shù)進(jìn)行尾水濃度的識(shí)別，以便為納污海域綜合污染評(píng)價(jià)提供有用工具.

1 材料與方法

1.1 材料

文蛤：購(gòu)于水質(zhì)清潔的青島市嶗山灣大管島養(yǎng)殖區(qū)，健康充滿活力且大小基本一致（平均殼長(zhǎng) 40mm）.在室內(nèi)采用清潔海水（取自青島市石老人海域，pH=7.90±0.02，鹽度32）馴養(yǎng)7d，每天更換新鮮的清潔海水，溫度、溶解氧（DO）分別控制為（15±1）℃和（6±0.5）mg/L，定時(shí)投加海水小球藻（Chlorella autotrophica），密度為 1.3×107cells/（L·d）.

尾水：取自青島市團(tuán)島污水處理廠出水排放口，每6h采集1次，采樣持續(xù)24h.將采集好的4個(gè)尾水樣品等體積混合并于 4℃保存，當(dāng)天使用.該污水處理廠的進(jìn)水以生活污水為主，工業(yè)廢水僅為數(shù)量不多的食品工業(yè)廢水，氮磷含量相對(duì)較高，所以其廢水處理主要采用改良型A2/O（厭氧-缺氧-好氧活性污泥法）和MBBR（生物膜）相結(jié)合的復(fù)合式生物處理系統(tǒng).

尾水與海水混合液：混合液中尾水濃度（即：尾水體積比，EVR）設(shè)置0%、1%、5%、10%、20%、30%、40%七個(gè)梯度，其中 0%濃度組為對(duì)照組.暴露培養(yǎng)前，首先向尾水中添加適量海水晶，調(diào)節(jié)鹽度為 32，再與天然清潔海水按一定比例混合，以消除各處理組中因尾水加入量不同造成的培養(yǎng)體系鹽度差異.

試劑：冰醋酸、NaH2PO4、Na2HPO4、EDTA-2Na、鄰苯二甲醛（OPT）、甲醇、苯甲基磺酰氟（PMSF）、二甲基亞楓（DMSO）、β-巰基乙醇、三羥甲基胺基甲烷（Tris）、四乙氧基丙烷、HCl、NaCl均為國(guó)產(chǎn)分析純.0.9%NaCl注射溶液、中性紅染料為國(guó)產(chǎn)生化試劑.多聚賴氨酸（MW150000～300000）、5，5-雙二硫代（2-硝基苯甲酸）（DTNB）、碘化硫代乙酰膽堿（ATChI）、還原型谷胱甘肽（GSH）由 Sigma公司提供.1-氯-2，4-二硝基苯（CDNB）由Merk公司提供.海水晶為山東濰坊市海佳海水晶廠以純凈海水為原料生產(chǎn).

1.2 文蛤暴露培養(yǎng)

暴露培養(yǎng)于2013年11月進(jìn)行.將經(jīng)過(guò)馴養(yǎng)的文蛤投放于21個(gè)10L玻璃缸中（每個(gè)尾水處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)），每個(gè)玻璃缸投放30只，加入相應(yīng)濃度的尾水-海水混合液，采用與馴養(yǎng)相同的條件連續(xù)培養(yǎng)9d.預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，暴露培養(yǎng)9d的文蛤生物標(biāo)志物響應(yīng)效果較好.為保證培養(yǎng)期間污染物濃度的相對(duì)穩(wěn)定，每24h更換一次相應(yīng)濃度的混合液.暴露期間未見(jiàn)文蛤死亡.暴露培養(yǎng)結(jié)束后，每個(gè)玻璃缸中隨機(jī)取出 15只個(gè)體，其中 2只抽取定量的血淋巴液，分別進(jìn)行溶酶體膜穩(wěn)定性（LMS）測(cè)定，以兩者的平均值表示該重復(fù)的測(cè)定結(jié)果；剩余個(gè)體在冰上解剖分離出內(nèi)臟組織，切細(xì)混合均勻，于-80℃保存，用于另外 8種生化因子的分析.

1.3 生化因子測(cè)定方法

1.3.1 血細(xì)胞LMS 采用Lowe等［7］的中性紅保持時(shí)間（NRRT）法：用注射器在文蛤后閉殼肌部位抽取 0.5mL血淋巴液于預(yù)冷的硅烷化離心管中，加入 0.5mL 0.9%NaCl注射液，混勻，放置30min.吸取40μL混合液于多聚賴氨酸處理后的載玻片上，恒溫恒濕（15～16℃）放置 3min使細(xì)胞附著.倒掉載玻片上多余液體，加入 40μL中性紅染液，每隔 15min鏡檢一次，當(dāng)觀察到視野中約30%的細(xì)胞因中性紅滲漏到細(xì)胞漿中而變紅時(shí)，改為每隔5min觀察一次，直至細(xì)胞變紅數(shù)量達(dá)到50%，即為NRRT（min）.NRRT出現(xiàn)在兩個(gè)相鄰鏡檢時(shí)刻之間時(shí)，采用內(nèi)插法計(jì)算 50%細(xì)胞變紅時(shí)間并取整.

1.3.2 內(nèi)臟生化因子 提取液制備：本研究所測(cè)內(nèi)臟生化因子有8種，包括：GSH、硫代巴比妥酸活性物質(zhì)（TBARs）、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPx）、谷胱甘肽還原酶（GR）、乙酰膽堿酯酶（AChE）和金屬硫蛋白（MTs）.除了MTs的提取液?jiǎn)为?dú)制備外，其它生化因子采用以下方法進(jìn)行提取.將內(nèi)臟樣品按質(zhì)量體積比 1：4加入 pH值 7.8的 Tris-HCl（0.02mol/L）緩沖溶液中勻漿，離心后取上清液于4℃下保存待測(cè).測(cè)定GSH、TBARs的勻漿液離心參數(shù)為：5000r/min，15min；測(cè)定 SOD、AChE、CAT、GR、GPx的離心條件為：10000r/ min，15min.

GSH測(cè)定：采用張迺哲等［8］的熒光分光光度法.在堿性條件下，GSH中的氨基酸、肽可與OPT反應(yīng)生成熒光復(fù)合物.在激發(fā)波長(zhǎng)為350nm，發(fā)射波長(zhǎng)為430nm時(shí)，熒光強(qiáng)度與GSH濃度呈線性關(guān)系.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得GSH的μmol值，計(jì)算內(nèi)臟組織蛋白中GSH含量，單位為μmol/g prot.

MTs測(cè)定：采用肖靜等［9］優(yōu)化的測(cè)定海洋雙殼類動(dòng)物MTs含量的分光光度法.按質(zhì)量體積比1：5將 Tris-HCl緩沖液（含 0.5mo1/L蔗糖，0.02mo1/L Tris-HCl，0.5mmo1/L PMSF，0.01% β-巰基乙醇）與內(nèi)臟樣品混合勻漿，之后于 4℃下25000r/min離心30min，得到MTs提取液.經(jīng)過(guò)除雜和N2吹干得到MTs干粉，然后利用Ellman試劑與之發(fā)生顯色反應(yīng)，溶液中的DTNB與MTs的-SH反應(yīng)生成黃色物質(zhì)，可在412nm處進(jìn)行MTs定量測(cè)定.MTs含量采用單位質(zhì)量濕組織（ww）中-SH含量間接表示，單位μmol-SH/g.

AChE測(cè)定：采用Ellman等［10］的可見(jiàn)光分光光度法.提取液中的AChE將底物ATChI分解為乙酸和碘化硫代膽堿，后者與DTNB發(fā)生反應(yīng)生成黃色絡(luò)合物（5-巰基-2-硝基苯甲酸），通過(guò)測(cè)定412nm處酶促反應(yīng)的初速度（吸光度隨時(shí)間的變化率）計(jì)算AChE活性，酶活力定義為：每mg組織蛋白每 min水解 ATChI的 nmol數(shù)，單位為nmol/（min·mg prot）.

SOD、CAT、GPx、GR、TBARs均使用南京建成生物工程研究所產(chǎn)品試劑盒測(cè)定.其中，SOD采用黃嘌呤氧化酶法，單位為 U/mg prot.CAT采用紫外分光光度法，以240nm處測(cè)定的底物H2O2消耗量表征酶活性，單位為U/g prot. GPx采用可見(jiàn)光分光光度法，以412nm處測(cè)定的酶促反應(yīng)中 GSH消耗量表示酶活力，單位為U/mg prot.GR采用紫外分光光度法，以340nm處測(cè)定的底物還原型輔酶 II（NADPH）減少量表示酶活力，單位為U/g prot. TBARs采用硫代巴比妥酸法，單位為nmol/mg prot.

1.3.3 內(nèi)臟蛋白質(zhì)測(cè)定 蛋白質(zhì)含量用于除LMS、MTs外的所有生物標(biāo)志物活性/含量的計(jì)算.采用南京建成生物工程研究所的試劑盒（考馬斯亮藍(lán)法）測(cè)定：考馬斯亮藍(lán)染料的陰離子與蛋白質(zhì)分子中的-NH3+特異性結(jié)合，使溶液呈藍(lán)色，通過(guò)測(cè)定595nm處吸光度可計(jì)算出蛋白含量，單位為g/L.

1.4 IBRv2指數(shù)計(jì)算方法

采用 IBR指數(shù)創(chuàng)立者 Burgeot［5］研究團(tuán)隊(duì)2013年提出的改進(jìn)型綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)（Integrated Biological Responses version 2，IBRv2）指數(shù)［11］.同改進(jìn)前的 IBR 指數(shù)法相比，IBRv2指數(shù)法避免了繪制星狀圖時(shí)因生物標(biāo)志物排序不同造成的計(jì)算結(jié)果偏差，同時(shí)能夠反映多種生物標(biāo)志物在不同污染條件下的誘導(dǎo)和抑制效應(yīng)，但是需要預(yù)先確定清潔站位作為對(duì)照［11］.由于本研究不是現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查項(xiàng)目，因此采用不含尾水（即EVR= 0%）時(shí)的生化因子測(cè)定值作為對(duì)照.

首先根據(jù)公式（1）對(duì)各尾水處理組中每種生物標(biāo)志物測(cè)定值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，式中，Xi為各處理組中該生物標(biāo)志物響應(yīng)值，X0為對(duì)照組的響應(yīng)值；

然后根據(jù)公式（2）計(jì)算每個(gè)處理組中每種生物標(biāo)志物的均一化值，式中，Yi為某生物標(biāo)志物標(biāo)準(zhǔn)化值，M和S分別為其在所有濃度組中的總平均值和標(biāo)準(zhǔn)差；

計(jì)算每個(gè)處理組中每種生物標(biāo)志物的偏離指數(shù)見(jiàn)式（3），式中Zi和Z0分別為某處理組和對(duì)照該生物標(biāo)志物的均一化值，Ai＞0或 Ai＜0時(shí)，分別表示該生物標(biāo)志物被誘導(dǎo)或受到抑制；

最后，將每個(gè)處理組中所有生物標(biāo)志物的 Ai絕對(duì)值相加后，再除以所用生物標(biāo)志物個(gè)數(shù) n，即得到IBRv2指數(shù)值，公式如下：

2 結(jié)果與討論

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)于每個(gè)處理組（或?qū)φ战M），各種生物標(biāo)志物測(cè)定結(jié)果均以 3個(gè)重復(fù)測(cè)定值的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.采用 SPSS18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，通過(guò)單因素方差分析（ANOVA）中 Tukey（方差齊性）和 Games-Howell（方差非齊性）檢驗(yàn)法進(jìn)行某生物標(biāo)志物響應(yīng)值在不同濃度處理組間的差異性檢驗(yàn).同時(shí)，對(duì)生物標(biāo)志物含量（活性）與尾水濃度、IBR指數(shù)值與尾水濃度，進(jìn)行雙變量Pearson相關(guān)性分析，顯著性水平設(shè)為P＜0.05和P＜0.01.

2.1 對(duì)尾水暴露無(wú)敏感響應(yīng)的生化因子

SOD和CAT是生物細(xì)胞內(nèi)兩種重要的抗氧化酶，共同抵御污染逆境下的活性氧（ROS）毒性

［12］.前者存在于細(xì)胞質(zhì)和線粒體內(nèi)外膜之間，主要作用是清除機(jī)體產(chǎn)生的O2-生成 H2O2；后者是一種末端氧化酶，能夠?qū)?H2O2水解以減輕H2O2對(duì)細(xì)胞的氧化損傷.

由圖1（A）、（B）可見(jiàn)，在EVR1%～40%范圍內(nèi)，文蛤的內(nèi)臟SOD活性雖有波動(dòng)，但是均與對(duì)照組（0%尾水濃度處理組）無(wú)明顯差異；CAT活性則僅在 EVR40%處理組中受到顯著抑制（P＜0.05），為對(duì)照組的55.06%，其他處理組的CAT活性與對(duì)照組差異均不顯著.筆者之前采用青島市李村河污水處理廠的尾水（EVR1%～20%）培養(yǎng)文蛤（M. meretrix）所得到的結(jié)果［6］有所不同：暴露9d時(shí)，各尾水處理組的內(nèi)臟 SOD活性均顯著增加（P＜0.05），CAT活性則全部受到顯著抑制（P＜0.05），且與 EVR呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）.兩期研究中SOD、CAT對(duì)尾水暴露的敏感性差異較大，可能與不同來(lái)源的MSTPs尾水中化學(xué)污染成分存在差異有關(guān).根據(jù)筆者調(diào)查，李村河 MSTPs所接受的污水中，工業(yè)廢水約占 40%，相應(yīng)的，所排尾水中毒性強(qiáng)的污染物（重金屬等）濃度可能較大，即使在較低EVR時(shí)也會(huì)在文蛤體內(nèi)產(chǎn)生較高的氧化逆境，誘導(dǎo)內(nèi)臟 SOD活性以消除積累的O2

-［12-13］.孟范平等［12］綜合國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)研究中重金屬對(duì)雙殼類CAT活性呈現(xiàn)抑制作用.而PAHs、有機(jī)氯農(nóng)藥等有機(jī)污染物常常誘導(dǎo)雙殼類內(nèi)臟 CAT活性［14］.由此推測(cè)，前文所發(fā)現(xiàn)的CAT活性受抑可能因?yàn)槔畲搴覯STPs尾水中含有較高濃度的重金屬污染物所致.相反，進(jìn)入團(tuán)島MSTPs的污水中只有少量食品工業(yè)廢水，高毒污染物的來(lái)源較少，尾水中此類污染物的濃度相對(duì)較低，在文蛤內(nèi)臟中產(chǎn)生的脅迫效應(yīng)不足以引起SOD的應(yīng)激反應(yīng)和CAT活性的抑制，因此認(rèn)為，文蛤內(nèi)臟SOD、CAT對(duì)尾水暴露的弱敏感性將限制其在團(tuán)島MSTPs尾水排放海域生物監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用.

圖1 暴露于不同尾水濃度的文蛤內(nèi)臟SOD、CAT活性變化Fig.1 Activities of SOD and CAT in the viscera of M. meretrix exposed to increasing concentrations of effluents

2.2 對(duì)尾水暴露響應(yīng)敏感但與 EVR無(wú)顯著相關(guān)性的生化因子

GSH是在動(dòng)物肝臟中合成的富含-SH的三肽，在清除細(xì)胞內(nèi) ROS過(guò)程中起到重要作用［15］：在GPx催化下，可將H2O2還原為H2O；在谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶（GST）催化下，能與外源親電子化合物結(jié)合，使其轉(zhuǎn)化為無(wú)毒或低毒的化合物排出體外.在這些反應(yīng)中，兩分子GSH通過(guò)二硫鍵連接形成一分子氧化態(tài)谷胱甘肽（GSSG）.在輕微氧化逆境下，作為生物體內(nèi)抗氧化酶的GR可利用NADPH作為電子供體，催化GSSG的二硫鍵還原，重新生成 GSH，以保持細(xì)胞正常代謝所需的適宜GSH/GSSG比值，即維持細(xì)胞內(nèi)一定-SH水平.換言之，如果GR活性受到抑制，將引起GSH/GSSG比例失衡，使細(xì)胞處于氧化脅迫狀態(tài).由圖2（A）、（B）可見(jiàn)，暴露于尾水9d后，文蛤內(nèi)臟的GR、GSH總體上的響應(yīng)特征是活性抑制或含量降低.對(duì)于GR，只在 EVR5%處理組與對(duì)照組差異不顯著，EVR30%處理組的抑制率最大，活性降至（8.21± 0.23） U/g prot，為對(duì)照組的64.04%.文獻(xiàn)［16］報(bào)道，海水中重金屬能夠抑制地中海貽貝（Mytilus galloprovincialis）內(nèi)臟GR的活性.這意味著本研究所用尾水中可能含有某些種類的重金屬（雖然其濃度可能低于李村河 MSTPs）.GSH在大多數(shù)處理組（除EVR20%、40%處理組外）的含量明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），最低值出現(xiàn)在 EVR30%處理組中，為對(duì)照組的 82.15%.但是，尾水暴露期間，內(nèi)臟GR與GSH之間的消長(zhǎng)關(guān)系并不完全遵循上述抗氧化機(jī)理，例如，在EVR5%處理組中，雖然GR活性未受到明顯抑制而保持在較高水平，但是GSH含量顯著低于對(duì)照組；在EVR20%、40%處理組中，GR活性受抑的同時(shí)觀察到較高的GSH含量.這可能是因?yàn)?，除了受到GR活性調(diào)節(jié)外，GSH含量的高低還受到GST催化下的GSH消耗速率、GPx催化下的 GSH氧化速率以及GSH合成速率等多因素的影響［15，17］.相關(guān)性分析表明，在EVR1%～40%范圍內(nèi)，無(wú)論是GR還是GSH，其響應(yīng)值與EVR之間均不存在顯著相關(guān)性，無(wú)法對(duì)不同尾水濃度產(chǎn)生規(guī)律性的響應(yīng)，因而不適于作為團(tuán)島MSTPs尾水污染的生物標(biāo)志物.

生物體在逆境脅迫下積累的ROS攻擊細(xì)胞膜上的多不飽和脂肪酸（PUFA），會(huì)引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化作用，形成脂質(zhì)過(guò)氧化物，這是細(xì)胞氧化性損傷的一個(gè)典型標(biāo)志.脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物常通過(guò)測(cè)定MDA或TBARs的含量表征，其水平升高往往意味著污染程度超出生物體抗氧化防御系統(tǒng)的調(diào)節(jié)能力，機(jī)體內(nèi)氧化還原平衡受到破壞［18］.尾水暴露期間，文蛤內(nèi)臟的脂質(zhì)過(guò)氧化較為明顯，表現(xiàn)為T(mén)BARs含量在EVR1%～10%范圍內(nèi)呈單調(diào)增加，在 EVR20%～40%范圍內(nèi)也有類似變化趨勢(shì)，最 高 值 ［（4.65±0.04）nmol/mg prot］出 現(xiàn) 在EVR10%處理組中，為對(duì)照組的1.36倍，見(jiàn)圖2（C）.與低EVR尾水相比，高EVR尾水對(duì)TBARs的誘導(dǎo)作用較弱，這與2.3節(jié)圖3中高EVR尾水暴露下內(nèi)臟MTs含量較高相一致，表明MTs的大量合成有利于減輕尾水中重金屬離子對(duì)文蛤內(nèi)臟細(xì)胞的毒害作用.但是，由于在研究所設(shè)置的 EVR范圍內(nèi)TBARs含量與EVR之間的相關(guān)性未達(dá)到顯著水平，因此，該因子同樣不適于客觀指示海水中尾水污染程度.

圖2 暴露于不同尾水濃度的文蛤內(nèi)臟GR、GSH、TBARs活性（含量）變化Fig.2 Activity of GR and contents of TBARs and GSH in the viscera of M. meretrix exposed to increasing concentrations of effluents

2.3 對(duì)尾水暴露響應(yīng)敏感且與 EVR呈顯著相關(guān)的生化因子

LMS可以從細(xì)胞水平上反映環(huán)境脅迫造成的功能完整性受損程度，是雙殼類動(dòng)物細(xì)胞的總逆境因子［19］.采用 NRRT評(píng)價(jià)雙殼類動(dòng)物的LMS不僅操作簡(jiǎn)便、成本較低并可快速測(cè)定［20］.以往的研究證實(shí)，有機(jī)污染物和重金屬的暴露均能造成NRRT降低［21-22］.Steven等［23］利用天然氣加工廠生產(chǎn)廢水對(duì)紫貽貝（Mytilus edulis）進(jìn)行5周暴露實(shí)驗(yàn)，所有處理組（EVR為0.01%、0.1%、0.5%和1%）的NRRT表現(xiàn)出敏感的單向響應(yīng)（持續(xù)降低）.聯(lián)合國(guó)環(huán)境規(guī)劃署“地中海污染監(jiān)測(cè)項(xiàng)目（MEDPOL）”的專家認(rèn)為，LMS是水質(zhì)評(píng)價(jià)中最可靠的生物標(biāo)志物［24］.本研究中（圖3（A）），經(jīng)過(guò) 9d培養(yǎng)，對(duì)照組 NRRT平均值為97.41min，各處理組的 NRRT均出現(xiàn)大幅降低，除 EVR1%處理組外，均與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05），以 EVR40%處理組的溶酶體膜穩(wěn)定性最差，NRRT（58.93min）降為對(duì)照組的 59.33%.隨著EVR增加，NRRT基本上呈單調(diào)降低趨勢(shì)，相關(guān)性分析表明，兩者之間具有顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系：NRRT= -75.721EVR+ 84.501（R= -0.785，P＜0.05）.因此，由NRRT表征的LMS適于作為監(jiān)測(cè)尾水污染的生物標(biāo)志物.

GPx是與CAT具有相同催化底物的一類重要抗氧化酶，能夠催化GSH與H2O2或氫過(guò)氧化物反應(yīng)，有效阻止細(xì)胞內(nèi)ROS引起的氧化損傷［14］.根據(jù)圖3（B），對(duì)照組GPx活性為8.72U/mg prot，暴露于尾水的各處理組GPx活性均受到顯著抑制（P＜0.05），降幅在8.83%-21.67%.相關(guān)性分析顯示，內(nèi)臟GPx活性與EVR之間呈顯著負(fù)相關(guān)：GPx = -3.154EVR+8.045（R= -0.758 ，P＜0.05）.孟范平等［12］綜合國(guó)內(nèi)外研究成果發(fā)現(xiàn)，重金屬暴露一般會(huì)抑制雙殼類內(nèi)臟的GPx活性.Almeida等［25］研究重金屬暴露后褐貽貝（Perna perna）體內(nèi)生物標(biāo)志物的響應(yīng)指出，GPx是對(duì)重金屬具有較好劑量-效應(yīng)關(guān)系的暴露性生物標(biāo)志物.此外，有機(jī)氯農(nóng)藥、PCBs等有機(jī)污染物也能導(dǎo)致鯡魚(yú)（Sprattus sprattus）體內(nèi) GPx活性顯著下降［26］.本研究觀察到文蛤內(nèi)臟 GPx對(duì)尾水污染有靈敏響應(yīng)且與EVR顯著相關(guān)，表明該生化因子適于作為污染組分復(fù)雜的尾水的生物標(biāo)志物.需要指出的是，筆者于春季［6］采用青島市李村河MSTPs尾水對(duì)文蛤的暴露研究中，內(nèi)臟GPx受到普遍抑制出現(xiàn)在尾水暴露 12d和 15d，這可能與不同季節(jié)的 文蛤生理狀態(tài)存在差異有關(guān).

圖3 暴露于不同尾水濃度的文蛤血細(xì)胞LMS以及內(nèi)臟GPx、MTs、AChE變化Fig.3 GPx， MTs and GSH in the viscera as well as hemocyte LMS of M. meretrix exposed to increasing concentrations of effluents

MTs是生物體內(nèi)一類分子量較低、半胱氨酸含量極高的金屬結(jié)合蛋白質(zhì).當(dāng)體內(nèi)非必需重金屬（Pb2+、Cd2+等）過(guò)多時(shí)，MTs會(huì)與這些重金屬發(fā)生特異性結(jié)合，避免細(xì)胞受到損傷.AChE主要位于突觸后膜，鄰近乙酰膽堿的受體，是生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的一種關(guān)鍵酶，能降解乙酰膽堿，終止神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)后膜的刺激作用，保證神經(jīng)沖動(dòng)在突觸間的正常傳導(dǎo). 當(dāng)有機(jī)磷農(nóng)藥與AChE特異性結(jié)合后，會(huì)導(dǎo)致生物體出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)損害.海洋污染監(jiān)測(cè)中常將雙殼類的MTs和AChE分別作為重金屬［27-28］、有機(jī)磷農(nóng)藥［29-30］的特異性生物標(biāo)志物用于水體中這兩類污染物的監(jiān)測(cè)預(yù)警.由圖 3（C）可見(jiàn)，各濃度的尾水暴露均能顯著誘導(dǎo)內(nèi)臟 MTs合成（P＜0.05），MTs含量最大值（0.921μmol-SH/g）出現(xiàn)在 EVR30%處理組，是對(duì)照組的1.5倍；根據(jù)圖3（D），內(nèi)臟AChE活性雖然在低濃度尾水暴露時(shí)變化較小，但是當(dāng)EVR大于20%時(shí)，酶活受到明顯抑制（P＜0.05），其中，EVR40%處理組的酶活最低，降幅為41.92%.這種變化規(guī)律同樣見(jiàn)于以往的文獻(xiàn)報(bào)道中：Kamel等

［31］研究突尼斯蘇賽市的市政尾水（EVR為0%、1%、3%和 10%）對(duì)溝紋蛤仔（Ruditapes decussatus）的影響發(fā)現(xiàn)，各處理組的MTs含量均有所升高；Gagne等［32］將一種淡水貝類（Elliptio complanata）在不同濃度（EVR1%、3%、10%和20%）經(jīng)初級(jí)處理的市政廢水中暴露培養(yǎng) 30d，其體內(nèi)AChE活性均顯著低于對(duì)照組.相關(guān)性分析進(jìn)一步表明，內(nèi)臟MTs含量與EVR呈顯著正相關(guān)：MT = 0.695EVR+ 0.669（R= 0.907，P＜0.01）；而內(nèi)臟AChE活性與EVR呈顯著負(fù)相關(guān)：AChE =-2.760EVR+2.699， R= -0.976，P＜0.01）.由此認(rèn)為，文蛤內(nèi)臟MTs、AChE均與尾水暴露存在良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系，適于作為尾水受納海域的生物標(biāo)志物應(yīng)用于尾水-海水體系的污染監(jiān)測(cè).

2.4 IBRv2指數(shù)計(jì)算及其對(duì)尾水污染的指示效果

在利用 IBR指數(shù)法進(jìn)行環(huán)境污染綜合評(píng)價(jià)時(shí)，所采用的生物標(biāo)志物既要對(duì)不同濃度的尾水產(chǎn)生較大響應(yīng)，又要與尾水 EVR顯著相關(guān).根據(jù)2.1～2.3節(jié)文蛤生化因子的響應(yīng)特征分析，血細(xì)胞LMS以及內(nèi)臟GPx、MTs、AChE符合上述要求，可作為尾水-海水混合體系綜合污染的評(píng)價(jià)指標(biāo).在此基礎(chǔ)上，本研究以零濃度（EVR=0%）的培養(yǎng)體系作為對(duì)照組，分別利用各尾水處理組中上述4種生物標(biāo)志物的實(shí)測(cè)值計(jì)算IBRv2指數(shù)，見(jiàn)圖4.各處理組的IBRv2指數(shù)值隨著EVR的增大而逐漸升高，相關(guān)性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)兩者之間存在顯著正 相 關(guān) 關(guān) 系 （IBRv2=5.4781EVR+0.5579，R= 0.9295，P＜0.01）.這表明，基于上述4種生物標(biāo)志物構(gòu)成的評(píng)價(jià)指標(biāo)所計(jì)算的綜合指數(shù)可以清晰識(shí)別混有尾水的海水污染水平.由此推測(cè)，今后的應(yīng)用研究中，如果采用籠養(yǎng)移植方式將文蛤投放到納污海域進(jìn)行主動(dòng)性監(jiān)測(cè)時(shí)，經(jīng)過(guò)現(xiàn)場(chǎng)暴露 9d，有望利用這些生物標(biāo)志物對(duì)尾水污染的良好響應(yīng)計(jì)算各站位 IBRv2指數(shù)值，以區(qū)分尾水對(duì)海水的污染水平.目前，有關(guān)利用生物標(biāo)志物進(jìn)行尾水排放海域污染監(jiān)測(cè)的研究報(bào)道不多，少數(shù)歐洲學(xué)者利用海域現(xiàn)場(chǎng)雙殼類體內(nèi)多種生物標(biāo)志物進(jìn)行海灣、河口區(qū)域海水污染程度評(píng)價(jià)（表1）.這些研究中所選用的評(píng)價(jià)指標(biāo)體系各不相同，表明針對(duì)污染源類型不同的海域進(jìn)行環(huán)境質(zhì)量評(píng)價(jià)時(shí)，篩選適宜的生物標(biāo)志物組合十分必要.另外，本研究中，各處理組的暴露實(shí)驗(yàn)均在非污染因子（溫度、DO、鹽度）調(diào)控一致的情況下進(jìn)行.但是，在受納尾水的海域現(xiàn)場(chǎng)，不同站位間的鹽度、溫度、DO可能存在差異而且不可能像室內(nèi)研究那樣進(jìn)行調(diào)節(jié)，因此，在現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用生物標(biāo)志物進(jìn)行綜合水質(zhì)評(píng)價(jià)之前，必須進(jìn)一步確定非污染因子變化對(duì)生物標(biāo)志物響應(yīng)值的干擾程度，并提出可行的校正方法.

圖4 各尾水處理組的IBRv2指數(shù)值隨EVR的變化Fig.4 IBRv2values based on four biomarkers in clams exposed to different concentrations （EVR） of effluents

表1 文獻(xiàn)中利用綜合生物標(biāo)志物指數(shù)進(jìn)行近岸海域污染評(píng)價(jià)的基本信息Table 1 Basic information on environmental assessment of coastal waters with integrated biomarker response index reported in some literatures

續(xù)表1

3 結(jié)論

3.1 在尾水-海水混合體系中，文蛤有 4種生物標(biāo)志物（血細(xì)胞LMS以及內(nèi)臟GPx、MTs、AChE）能夠產(chǎn)生敏感響應(yīng)并與尾水 EVR呈顯著相關(guān)，適于作為混合體系綜合污染評(píng)價(jià)的生物學(xué)指標(biāo).

3.2 依據(jù)評(píng)價(jià)指標(biāo)所計(jì)算的 IBRv2指數(shù)值與尾水濃度呈顯著正相關(guān)（R=0.9295，P＜0.01），證明IBRv2指數(shù)法適于受納尾水的海域綜合污染評(píng)價(jià).

3.3 為使 IBRv2指數(shù)法更好應(yīng)用于尾水排放海域綜合評(píng)價(jià)，應(yīng)針對(duì)MSTPs所處理的廢水類型不同篩選適宜的生物標(biāo)志物組合，并注意非污染因子變化對(duì)生物標(biāo)志物響應(yīng)值的干擾及消除方法研究.

［1］ Bolongn， Ismail A F， Salim M R. A review of the effects of emerging contaminants in wastewater and options for their removal ［J］. Desalination， 2009，239：229-246.

［2］ Watkinson A J， Murby E J， Kolpin D W， et al. The occurrence of antibiotics in an urban watershed： from wastewater to drinking water ［J］. Science of the Total Environment， 2009，407（8）：2711-2723.

［3］ Hannam M L， Bamber S D， Sundt R C， et al. Immune modulation in the blue mussel Mytilus edulis exposed to North Sea produced water ［J］. Environmental Pollution， 2009，157（6）：1939-1944.

［4］ Beliaeff B， Burgeot T. Integrated biomarker response： a useful tool for ecological risk assessment ［J］. Environmental Toxicology and Chemistry， 2002，21（6）：1316-1322.

［5］ Hunt C D， Slone E. Long-term monitoring using resident and caged mussels in Boston Harbor yield similar spatial and temporal trends in chemical contamination ［J］. Marine Environmental Research， 2010，70（5）：343-357.

［6］ 蘇恩萍，孟范平，孫 婷，等.短期暴露于城市污水處理廠尾水的文蛤抗氧化酶響應(yīng) ［J］. 中國(guó)環(huán)境科學(xué)， 2014，34（2）：511-517.

［7］ Lowe D M， Soverchia C， Moore M N. Lysosomal membrane responses in the blood and digestive cells of mussels experimentally exposed to fluoranthene ［J］. Aquatic Toxicology，1995，33（2）：105-112.

［8］ 張迺哲，趙會(huì)軍，付宏杰，等.組織中氧化型和還原型谷胱甘肽熒光測(cè)定法 ［J］. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展， 1993，2：136-138.

［9］ 孟范平，肖 靜，趙順順，等.菲律賓蛤仔金屬硫蛋白的提取方法優(yōu)化 ［J］. 中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版， 2010，40（7）：121-125.

［10］ Ellman G L， Courtney K D， Andres V， et al. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity ［J］. Biochemical Pharmacology， 1961，7（2）：88-95.

［11］ Sanchez W， Burgeot T， Porcher J M. A novel “Integrated Biomarker Response” calculation based on reference deviation concept ［J］. Environmental Science and Pollution Research，2013，20（5）：2721-2725.

［12］ 孟范平，高 鷹，趙順順，等.雙殼類分子生物標(biāo)志物對(duì)海水重金屬的響應(yīng)評(píng)述 ［J］. 中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)， 2011，41（5）：100-109.

［13］ Cossu C， Doyotte A， Jacquin M C， et al. Glutathione reductase，selenium-dependent glutathione peroxidase， glutathione levels，and lipid peroxidation in freshwater bivalves， Unio tumidus， as biomarkers of aquatic contamination in field studies ［J］. Ecotoxicology and Environmental Safety， 1997，38（2）：122-131.

［14］ Richardson B J， Mak E， De Luca-Abbott S B， et al. Antioxidant responses to polycyclic aromatic hydrocarbons and organochlorine pesticides in green-lipped mussels （Perna viridis）：do mussels “integrate” biomarker responses？［J］. Marine Pollution Bulletin， 2008，57（6）：503-514.

［15］ Pena-Llopis S， Ferrando M D， Pena J B. Impaired glutathione redox status is associated with decreased survival in two organophosphate-poisoned marine bivalves ［J］. Chemosphere，2002，47（5）：485-497.

［16］ Regoli F， Gorbi S， Frenzilli G， et al. Oxidative stress in ecotoxicology： from the analysis of individual antioxidants to a more integrated approach ［J］. Marine Environmental Research，2002，54（3）：419-423.

［17］ Jing G， Li Y， Xie L， et al. Metal accumulation and enzyme activities in gills and digestive gland of pearl oyster （Pinctada fucata） exposed to copper ［J］. Comparative Biochemistry and Physiology Part C： Toxicology & Pharmacology， 2006，144（2）：184-190.

［18］ Taylor A M， Maher W A. Exposure—dose—response of Anadara trapezia to metal contaminated estuarine sediments. 2. Lead spiked sediments ［J］. Aquatic Toxicology， 2012，116：79-89.

［19］ Lowe D M， Foeeato V U， Depledge M H. Contaminant-induced lysosomal membrane damage in blood cells of mussels Mytilus galloprovincialis from the Venice Lagoon： an in vitro study ［J］. Marine Ecology Progress Series 1995，129：189-196.

［20］ Lowe D M， Soverchiab C， Moore M N. Lysosomal membrane responses in the blood and digestive cells of mussels experimentally exposed to fluoranthene ［J］. Aquatic Toxicology，1995，33：105-112.

［21］ 王曉宇，楊紅生，邢 坤，等.鎘和汞脅迫對(duì)四角蛤蜊（Mactra veneriformis）血細(xì)胞的毒性損傷研究 ［J］. 海洋與湖沼，2011，42（6）：850-856.

［22］ 王 清.幾種重金屬和有機(jī)污染物對(duì)文蛤 Meretirx meretrix生態(tài)毒理效應(yīng)的研究 ［D］. 青島：中國(guó)科學(xué)院研究生院（海洋研究所）， 2010.

［23］ Brooks S， Harman C， Zaldibar B， et al. Integrated biomarker assessment of the effects exerted by treated produced water from an onshore natural gas Processing Plant in the North Sea on the mussel Mytilus edulis ［J］. Marine Pollution Bulletin， 2011，62（2）：327-339.

［24］ UNEP. Report of the meeting of experts to review the MEDPOL biomonitoring programme ［R］. UNEP-（OCA）/MED WG， Athens，Greece， 1997，132/7.

［25］ de Almeida E A， Miyamoto S， Bainy A C D， et al. Protective effect of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase（PHGPx） against lipid peroxidation in mussels Perna perna exposed to different metals ［J］. Marine Pollution Bulletin， 2004，49（5）：386-392.

［26］ Peters L D， Porte C， Livingstone D R. Variation of antioxidant enzyme activities of Sprat （Sprattus sprattus） larvae and organic contaminant levels in mixed zooplankton from the Southern North Sea ［J］. Marine Pollution Bulletin， 2001，42（11）：1087-1095.

［27］ de Lafontaine Y， Gagné F， Blaise C， et al. Biomarkers in zebra mussels （Dreissena polymorpha） for the assessment and monitoring of water quality of the St Lawrence River （Canada） ［J］. Aquatic Toxicology， 2000，50（1）：51-71.

［28］ Mourgaud Y， Martinez E， Geffard A， et al. Metallothionein concentration in the mussel Mytilus galloprovincialis as a biomarker of response to metal contamination： validation in the field ［J］. Biomarkers， 2002，7：479-490.

［29］ Narbonne J F， Mora P， Michel X， et al. Biological markers of environmental contamination in marine ecosystems： Biomar Project coordinating group ［J］. Toxin Reviews， 1999，18（3/4）：205-220.

［30］ Kari K L， Doris S B， Angela K， et al. The BEEP project in the Baltic Sea： Overview of results and outline for a regional biological effects monitoring strategy ［J］. Marine Pollution Bulletin， 2006，53（8/9）：523-537.

［31］ Kamela N， Jebali J， Banni M， et al. Biochemical responses and metals levels in Ruditapes decussatus after exposure to treated municipal effluents ［J］. Ecotoxicology and Environmental Safety，2012，82：40—46.

［32］ Gagné F， Cejka P， André C， et al. Neurotoxicological effects of a primary and ozonated treated wastewater on freshwater mussels exposed to an experimental flow-through system ［J］. Comparative Biochemistry and Physiology Part C： Toxicology & Pharmacology， 2007，146（4）：460-470.

［33］ Raftopoulou E K， Dimitriadis V K. Assessment of the health status of mussels Mytilus galloprovincialis along Thermaikos Gulf （Northern Greece）： an integrative biomarker approach using ecosystem health indices ［J］. Ecotoxicology and Environmental Safety， 2010，73（7）：1580-1587.

［34］ Cravo A， Pereira C， Gomes T， et al. A multibiomarker approach in the clam Ruditapes decussatus to assess the impact of pollution in the ria formosa lagoon， south coast of portugal ［J］. Marine Environmental Research， 2012，75（4）：23-34.

［35］ Campillo J A， Albentosa M， Valdés N J， et al. Impact assessment of agricultural inputs into a Mediterranean coastal lagoon （Mar Menor， SE Spain） on transplanted clams （Ruditapes decussatus）by biochemical and physiological responses ［J］. Aquatic Toxicology， 2013，142：365-379.

Integrated assessment of pollution level in the effluent/seawater mixture based on the biomarker’s response in clam Meretrix meretrix.

LIN Yi-chen， MENG Fan-ping*， WAN Ru， DU Yong-xiang， WANG Yue-jie， CUI Hong-wu （Key Laboratory of Marine Environment and Ecology， Ministry of Education， Ocean University of China， Qingdao 266100，China）. China Environmental Science， 2016，36（9）：2774～2783

Bivalve Meretrix meretrix were exposed for 9days to mixture of Tuandao MSTP effluents and seawater （volume ratio ranged from 1% to 40%， resulted from dilution with natural seawater）. Biological effects of contaminant exposure on bivalves were evaluated by measuring nine biochemical parameters including superoxide dismutase-SOD， catalase-CAT，glutathione peroxidase-GPx， glutathione reductase-GR， reduced glutathione-GSH， thiobarbituric acid reactive substances-TBARs， acetylcholinesterase-AChE and metallothioneins-MTs in digestive gland， as well as hemocyte lysosomal membrane stability-LMS. All the biochemical parameters except SOD and CAT had sensitive responses to effluent exposure， Among which four biomarkers， namely LMS， GPx， MTs and AChE， were more effective for indicating effluent pollution because of the significant correlation with concentrations of effluents （P＜0.05 or P＜0.01）. The calculated IBR（integrated biomarker response） index value （0.61～2.65）， based on the responses of these biomarkers， increased with the rise of ratio of effluents， and a significant positive correlation between them was observed （P＜0.01）. The results proved the usefulness of integrated biological effects measurements and IBR index for the assessment of complicated chemical contamination in seawaters receiving MSTPs effluents.

effluent；municipal sewage treatment plants （MSTPs）；seawater；integrated assessment；bivalve； biomarkers

X835

A

1000-6923（2016）09-2774-10

2015-12-23

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41240040）

? 責(zé)任作者， 教授， mengfanping@ouc.edu.cn

林怡辰（1992-），女，山東招遠(yuǎn)人，中國(guó)海洋大學(xué)碩士研究生，主要從事海洋環(huán)境生物監(jiān)測(cè)研究.