劉 芳，張東泉，許興興，鄒春平，胡祖良，柳月珍，趙 建，4，丁日高，4

（1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京100850；2.中央軍委聯(lián)合參謀部信息通信局門(mén)診部，北京100840；3.浙江省衢州市衢化醫(yī)院，浙江衢州324004；4.毒理學(xué)與抗毒藥物研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100850）

低劑量全氟異丁烯致大鼠急性肺損傷及清開(kāi)靈早期治療長(zhǎng)期效果觀察

劉 芳1，2，張東泉3，許興興1，鄒春平3，胡祖良3，柳月珍3，趙 建1，4，丁日高1，4

（1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京100850；2.中央軍委聯(lián)合參謀部信息通信局門(mén)診部，北京100840；3.浙江省衢州市衢化醫(yī)院，浙江衢州324004；4.毒理學(xué)與抗毒藥物研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100850）

目的觀察低劑量全氟異丁烯（PFIB）單次暴露誘發(fā)大鼠急性肺損傷（ALI）及清開(kāi)靈注射液早期救治的長(zhǎng)期效應(yīng)。方法雄性Wistar大鼠224只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（空氣暴露后ip給予生理鹽水10 mL·kg-1）、清開(kāi)靈對(duì)照組（空氣暴露后ip給予清開(kāi)靈注射液10 mL·kg-1）、PFIB染毒組（PFIB 280 mg·m-3，染毒5 min，1 h后ip給予生理鹽水10 mL·kg-1）和清開(kāi)靈救治組（PFIB染毒后1 h ip給予清開(kāi)靈注射液10 mL·kg-1），分別于染毒后24 h和3，6，12，24，36和48周隨機(jī)處死8只，檢測(cè)動(dòng)脈血?dú)?、肺功能、肺系?shù)、支氣管肺泡灌洗液（BALF）中蛋白含量、肺組織和血漿中羥脯氨酸（HYP）含量等。結(jié)果與正常對(duì)照組相比，PFIB中毒組大鼠染毒后24 h肺系數(shù)和BALF中蛋白含量顯著升高（P＜0.01），動(dòng)脈血氧分壓PaO2（P＜0.01）和氧飽和度SaO2顯著降低（P＜0.05），吸氣時(shí)間、呼氣時(shí)間、潮氣量（TV）、呼氣量（EV）、呼氣末停頓和弛豫時(shí)間顯著降低（P＜0.01）；上述指標(biāo)從3周開(kāi)始逐漸恢復(fù)至正常水平；至48周時(shí)，TV、EV和呼氣峰流量（PEF）與正常對(duì)照組相比顯著降低（P＜0.05）。肺組織中HYP含量在染毒后24 h與正常對(duì)照組相比降低（P＜0.05），之后至6周時(shí)顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.05），12周后恢復(fù)至正常水平。血漿中HYP含量在染毒后24 h與正常對(duì)照組相比升高（P＜0.05），之后逐漸恢復(fù)至正常水平。清開(kāi)靈治療組大鼠染毒后24 h BALF中蛋白含量顯著低于PFIB中毒組（P＜0.01）；染毒后24 h至24周，TV、EV、吸氣峰流量和PEF值與PFIB中毒組均無(wú)顯著性差異，至48周時(shí)TV和EV均顯著高于PFIB中毒組（P＜0.05），恢復(fù)至正常對(duì)照組水平。結(jié)論低劑量PFIB致大鼠ALI的長(zhǎng)期修復(fù)過(guò)程中，肺組織損傷得到代償性修復(fù)，但肺容量和肺通氣功能有所降低。清開(kāi)靈早期救治可抑制PFIB-ALI急性期BALF中蛋白滲漏，并對(duì)后期肺功能恢復(fù)起到一定的作用。

全氟異丁烯；急性肺損傷；清開(kāi)靈；肺功能；長(zhǎng)期毒性

全氟異丁烯（perfluoroisobutylene，PFIB）是一種窒息性氣體，列于《禁止化學(xué)武器公約》禁控化合物的二級(jí)清單中，毒性比光氣強(qiáng)約10倍；作為聚氟工業(yè)生產(chǎn)和加工過(guò)程中的副產(chǎn)物，每年有上千噸的產(chǎn)量。吸入少量PFIB可誘發(fā)急性肺損傷（acute lung injury，ALI），嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。本課題組近年來(lái)對(duì)PFIB引起的急性反應(yīng)做了大量深入的研究，初步找到了對(duì)PFIB中毒特異性強(qiáng)的防治藥物和干預(yù)措施［1-5］，發(fā)現(xiàn)了可用于臨床早期診斷的特異性方法［6］，對(duì)其中毒機(jī)制的了解強(qiáng)調(diào)了從直接損傷與過(guò)度炎癥反應(yīng)兩方面著手的重要性［7-9］。但對(duì)PFIB染毒后的長(zhǎng)期效應(yīng)所知甚少。清開(kāi)靈注射液是以“安宮牛黃丸”為基礎(chǔ)研制的一種純中藥制劑，主要成分為牛黃、水牛角、珍珠母、黃芩、金銀花、梔子和板藍(lán)根等，具有活血化瘀、清熱化痰和涼血開(kāi)竅的功效［10］。課題組前期以PFIB-ALI動(dòng)物模型進(jìn)行了“對(duì)抗肺水腫中藥篩選研究”，發(fā)現(xiàn)清開(kāi)靈對(duì)PFIBALI具有明顯的治療效果和劑量效應(yīng)關(guān)系［11］。PFIB染毒后1 h ip給予清開(kāi)靈10 mL·kg-1可明顯改善PFIB-ALI大鼠的中毒癥狀［12］。進(jìn)一步分析治療成分和作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)清開(kāi)靈對(duì)抗PFIB所致肺水腫的有效成分為總膽酸，清開(kāi)靈具有非激素樣的獨(dú)特作用機(jī)制可能與其表面活性作用有關(guān)［11］。本研究通過(guò)低劑量PFIB單次暴露誘發(fā)大鼠ALI后連續(xù)48周的長(zhǎng)期效應(yīng)及清開(kāi)靈早期治療效果長(zhǎng)期觀察，闡明PFIB-ALI修復(fù)的規(guī)律性變化和清開(kāi)靈早期治療的長(zhǎng)期效果，為窒息性毒劑肺損傷毒理學(xué)和抗毒藥物防治及臨床PFIB染毒患者急性期后的長(zhǎng)期康復(fù)治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)雄性Wistar大鼠224只，體質(zhì)量180～200 g。北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供〔許可證號(hào)SCXK（京）2012-0001〕。大鼠自由攝食、飲水。

1.2 試劑和儀器

PFIB，純度為98%，購(gòu)自上海有機(jī)氟材料研究所；清開(kāi)靈注射液（每支10 mL），河北神威藥業(yè)有限公司，批號(hào)130416C2；Bradford法蛋白含量測(cè)定試劑盒，北京普利萊基因技術(shù)有限公司。北分SP-3420型氣相色譜儀，北京北分瑞利分析儀器有限公司；雷度ABL80系列血?dú)鈨x，美國(guó)RADIOMETER公司；Universal16R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Hettucg公司；680型酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Rad公司；Vent2型全身體積描記系統(tǒng)及iox2V2.2數(shù)據(jù)采集和分析系統(tǒng)，法國(guó)Emka公司。

1.3 PFIB染毒劑量的確定

低劑量PFIB染毒劑量的確定主要考慮兩點(diǎn)，一是染毒大鼠的死亡率要低，以保證觀察期大鼠標(biāo)本的數(shù)量；二是要出現(xiàn)顯著的肺水腫和肺組織病理變化?；谝陨弦?，確定了以下3個(gè)觀察指標(biāo)，即染毒后24 h各組死亡大鼠數(shù)＜1/10；染毒后24 h大鼠出現(xiàn)明顯的肺水腫，即肺系數(shù)有顯著改變；染毒后24 h大鼠肺組織出現(xiàn)明顯的蛋白滲漏，即BALF中蛋白含量出現(xiàn)顯著增高。通過(guò)整理以往實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，在280 mg·m-3染毒5 min條件下大鼠可達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在280 mg·m-3染毒5 min條件下，染毒大鼠24 h的死亡率＜1/10，肺系數(shù)和BALF中蛋白含量與正常組相比均出現(xiàn)顯著變化。因此，低劑量PFIB染毒劑量確定為280 mg·m-3染毒5 min。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

大鼠稱(chēng)重，標(biāo)記，以體質(zhì)量分組因素隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組（空氣暴露后腹腔注射生理鹽水10 mL·kg-1）、清開(kāi)靈對(duì)照組（空氣暴露后腹腔注射清開(kāi)靈注射液10 mL·kg-1）、PFIB染毒組（采用自制的大鼠全身暴露動(dòng)態(tài)吸入染毒系統(tǒng)［7］，染毒后1 h腹腔注射生理鹽水10 mL·kg-1）和清開(kāi)靈治療組（PFIB染毒后1 h腹腔注射清開(kāi)靈注射液10 mL·kg-1）。每組56只大鼠，分別于染毒后24 h，3，6，12，24，36和48周各取8只大鼠，麻醉后經(jīng)腹主動(dòng)脈采集血液樣本（肝素鈉抗凝），用于動(dòng)脈血?dú)夥治龊脱獫{制備，然后放血處死，采集支氣管肺泡灌洗液（bron?choalveolar lavage fluid，BALF）和肺組織標(biāo)本。

1.5 肺系數(shù)測(cè)定

大鼠處死后，打開(kāi)胸腔，取右前葉肺測(cè)定肺系數(shù)。小心剔除肺外組織，生理鹽水漂洗，濾紙吸干后，稱(chēng)肺濕重。然后將標(biāo)本置80℃烘烤24 h至恒重后，稱(chēng)肺干重，按下列公式計(jì)算肺系數(shù)：肺濕干比=濕肺凈重/干肺凈重；濕肺體比=濕肺凈重/體質(zhì)量× 10 000；干肺體比=干肺凈重/體質(zhì)量×10 000；肺含水量（%）=（濕肺凈重-干肺凈重）/濕肺凈重× 100%。

1.6 BALF的制備和蛋白質(zhì)含量檢測(cè)

用止血鉗夾住右側(cè)4葉肺，氣管插管后，以5 mL生理鹽水反復(fù)灌洗左肺3～5次，每次在肺中停留5 s。然后將灌洗液置于10 mL離心管中離心（4℃，765×g，10 min），采用Bradford法蛋白含量測(cè)定試劑盒測(cè)定BALF中蛋白質(zhì)含量。

1.7 肺功能檢測(cè)

利用法國(guó)Emka公司Vent2型全身體積描記系統(tǒng)及iox2V2.2數(shù)據(jù)采集和分析系統(tǒng)，采集大鼠PFIB暴露前后不同時(shí)間的呼吸參數(shù)［13］，并進(jìn)行分析。

1.8 血?dú)夥治?/p>

利用雷度ABL80系列血?dú)鈨x，測(cè)定PFIB染毒后不同時(shí)間點(diǎn)受試大鼠的動(dòng)脈血氧分壓（PaO2）、動(dòng)脈血氧飽和度（SaO2）、動(dòng)脈血二氧化碳分壓（PaCO2）及pH值等參數(shù)。

1.9 肺組織和血漿羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）含量檢測(cè)

采用HYP測(cè)定試劑盒，分別檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)大鼠肺組織和血漿中HYP含量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 染毒PFIB對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響

大鼠PFIB染毒后48周體質(zhì)量變化如圖1所示，各組大鼠體質(zhì)量均逐漸遞增，無(wú)顯著性差異。

Fig.1 Change of body mass of rats within 48 weeks after perfluoroisobutylene（PFIB）exposure.Exposure to PFIB 280 mg·m-3lasted 5 min；Qingkailing（QKL）10 mL·kg-1was ip given 1 h after PFIB exposure.

2.2 染毒PFIB對(duì)大鼠肺系數(shù)的影響

大鼠PFIB染毒后不同時(shí)間點(diǎn)肺系數(shù)變化如圖2所示。在染毒后24 h，PFIB中毒組大鼠肺濕干比、濕肺體比、干肺體比和肺含水量等各項(xiàng)肺系數(shù)均較正常對(duì)照組顯著升高；清開(kāi)靈對(duì)照組大鼠的各項(xiàng)肺系數(shù)均與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異；清開(kāi)靈治療組大鼠的各項(xiàng)肺系數(shù)與PFIB中毒組相比無(wú)顯著差異，但均有改善趨勢(shì)。PFIB染毒后3～48周，各組大鼠肺系數(shù)均恢復(fù)至正常水平。

2.3 染毒PFIB對(duì)大鼠BALF中蛋白質(zhì)含量的影響

大鼠PFIB染毒后不同時(shí)間點(diǎn)BALF中蛋白質(zhì)含量變化如圖3所示。在染毒后24 h，PFIB中毒組大鼠BALF中蛋白質(zhì)含量較正常對(duì)照組顯著升高（P＜0.01）；清開(kāi)靈對(duì)照組大鼠BALF中蛋白質(zhì)含量與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異；清開(kāi)靈治療組大鼠BALF中蛋白質(zhì)含量較PFIB中毒組顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。PFIB染毒后3～48周，各組BALF中蛋白質(zhì)含量均恢復(fù)至正常水平。

Fig.2 Change of lung coefficients of rats within 48weeks after PFIB exposure.See Fig.1 for the rat treatment. *P＜0.05，**P＜0.01，compared with normalcontrolgroup.

Fig.3 Change of protein contents in BALF of rats within 48 weeks after PFIB exposure.See Fig.1 for the rat treatment.**P＜0.01，compared with normalcontrolgroup；##P＜0.01，compared with PFIB group.

2.4 染毒PFIB對(duì)大鼠血?dú)獾挠绊?/p>

大鼠PFIB染毒后不同時(shí)間點(diǎn)血?dú)庵笜?biāo)變化如圖4所示。在染毒后24 h～3周，PFIB中毒組大鼠血?dú)釶aO2值（P＜0.01）和SaO2值（P＜0.05）較正常對(duì)照組顯著下降。清開(kāi)靈治療組大鼠PaO2值和SaO2值與正常對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異，與PFIB中毒組相比有改善趨勢(shì)。PFIB染毒后6～48周，各組血?dú)庵笜?biāo)均恢復(fù)至正常水平。

2.5 染毒PFIB對(duì)大鼠肺功能的影響

大鼠PFIB染毒后不同時(shí)間點(diǎn)肺功能變化如圖5所示。在染毒后24 h，PFIB中毒組大鼠的吸氣時(shí)間（Ti）、呼氣時(shí)間（Te）、潮氣量（TV）、呼氣量（EV）、呼氣末停頓（EEP）和弛豫時(shí)間（RT）較正常對(duì)照組顯著降低（P＜0.01）；從3周開(kāi)始以上指標(biāo)逐漸恢復(fù)至正常水平。吸氣峰流量（PIF）、呼氣峰流量（PEF）與正常對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異；但至48周時(shí)，TV，EV和PEF較正常對(duì)照組顯著降低（P＜0.01）。清開(kāi)靈對(duì)照組大鼠的各項(xiàng)肺功能指標(biāo)與正常對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異。在染毒后24 h，清開(kāi)靈治療組大鼠與正常對(duì)照組相比，Ti，Te，TV，EV，EEP和RT顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），呼吸頻率（f）顯著升高（P＜0.01），PIF和PEF無(wú)顯著性差異，各項(xiàng)指標(biāo)與PFIB中毒組相比均無(wú)顯著性差異；從3周起，各項(xiàng)指標(biāo)均逐漸恢復(fù)至正常水平，其中TV，EV和PIF值在48周時(shí)顯著高于PFIB染毒組（P＜0.05）。

2.6 染毒PFIB對(duì)大鼠肺組織和血漿中羥脯氨酸含量的影響

大鼠PFIB染毒后不同時(shí)間點(diǎn)肺組織和血漿中HYP含量變化如圖6所示。與正常對(duì)照組相比，PFIB中毒組大鼠在染毒后24 h肺組織中HYP含量顯著降低（P＜0.05），而血漿中HYP含量顯著升高（P＜0.05）；染毒后3周，肺組織中HYP含量逐漸恢復(fù)至正常對(duì)照組水平，至6周時(shí)顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.05），之后至48周逐漸恢復(fù)至正常水平。清開(kāi)靈對(duì)照組大鼠肺組織和血漿中HYP含量與正常對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異。清開(kāi)靈治療組大鼠與PFIB中毒組大鼠變化相似，兩組相比無(wú)顯著性差異。

Fig.4 Change of arterial blood gases of rats within 48 weeks after PFIB exposure.See Fig.1 for the treatment.x±s，n=6.*P＜0.05，**P＜0.01，compared with normalcontrolgroup.

Fig.5 Change of pulmonary function of rats within 48 weeks after PFIB exposure.See Fig.1 for the rat treatment.Ti：inspiratory time；Te：expiratory time；f：frequency of breathing；TV：tidalvolume；EV：expired volume；MV：minute ventilation；EIP：peak inspiratory flow；EEP：peak expiratory flow；Penh：enhanced pause；RT：relaxation time；PIF：peak inspiratory flow；PEF：peak expiratory flow；EF50：50%of expiratory flow.*P＜0.05，**P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with PFIB group.

Fig.6 Change of hydroxyproline contents in lung tissue（A）and plasma（B）of rats within 48 weeks after PFIB exposure.See Fig.1 for the rat treatment.**P＜0.01，compared with normalcontrolgroup.

3 討論

3.1 PFIB-ALI長(zhǎng)期效應(yīng)觀察

在整個(gè)48周觀察過(guò)程中，各組大鼠的體質(zhì)量均呈逐漸上升趨勢(shì)，且各組體質(zhì)量增長(zhǎng)無(wú)顯著差異，提示觀察期間大鼠均處于青壯年期，單次低劑量PFIB暴露對(duì)大鼠一般健康狀況無(wú)明顯影響。

PFIB染毒后24 h，中毒組大鼠的肺系數(shù)和BALF中蛋白含量均較正常對(duì)照組顯著升高，血?dú)庵蠵aO2和SaO2指標(biāo)較正常對(duì)照組顯著降低，肺功能也發(fā)生了顯著變化。各項(xiàng)指標(biāo)顯示，大鼠在PFIB染毒后24 h肺組織發(fā)生了急性肺水腫，致使肺的氣體交換功能和呼吸功能均有所降低，大鼠PFIB-ALI模型建立成功。

染毒后3～48周，PFIB中毒組大鼠的肺系數(shù)、BALF中蛋白含量及各項(xiàng)血?dú)庵笜?biāo)均逐漸恢復(fù)至正常水平。提示大鼠的急性炎癥反應(yīng)和肺組織損傷得到代償性修復(fù)。

在染毒后24 h，PFIB中毒組大鼠的Ti，Te，TV，EV，EEP和RT與正常對(duì)照組相比顯著降低，這些變化與ALI大鼠的肺功能特點(diǎn)一致［13］；PIF和PEF值與正常對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異。以上指標(biāo)從染毒后3周起逐漸恢復(fù)至正常水平。至染毒后48周，PFIB中毒組大鼠的TV，EV和PEF顯著降低。EV和TV是反映大鼠肺容量的重要指標(biāo)，而PEF是反映肺通氣功能的重要指標(biāo)。肺通氣功能正常與否受到呼吸中樞及其支配神經(jīng)通路、呼吸肌肉功能（主要為膈?。?、氣道通暢性、肺順應(yīng)性（肺泡可擴(kuò)張及可回縮性）和胸廓順應(yīng)性等因素的影響，任何一方面功能的下降都可導(dǎo)致通氣功能異常［14］。本研究結(jié)果提示，低劑量PFIB染毒大鼠ALI的長(zhǎng)期修復(fù)過(guò)程中，雖然肺組織損傷得到代償性修復(fù)，但肺容量和肺通氣功能較正常大鼠會(huì)有所降低，可能與ALI引起的小氣道病變損傷、呼吸肌功能降低及肺泡上皮細(xì)胞損傷引起的肺順應(yīng)性降低有關(guān)。

染毒后24 h，PFIB中毒組大鼠和清開(kāi)靈治療組大鼠肺組織中HYP含量顯著降低，而血漿中HYP含量顯著升高，此結(jié)果與課題組前期觀察結(jié)果一致［15］，提示ALI大鼠肺組織中的HYP可能會(huì)由于肺組織病理改變、肺氣血屏障通透性增加和蛋白滲漏等原因而到血液中。至6周時(shí)，中毒組大鼠肺組織中HYP含量顯著高于正常對(duì)照組，這一現(xiàn)象與PFIBALI后肺的代償性修復(fù)有關(guān)，一度引起肺泡上皮細(xì)胞的過(guò)度修復(fù)與成纖維細(xì)胞的過(guò)度激活。但這種修復(fù)在6周之后即恢復(fù)至正常對(duì)照組水平，可能是由于單次低劑量PFIB暴露，使這種肺泡上皮細(xì)胞的過(guò)度異常修復(fù)與成纖維細(xì)胞的過(guò)度激活不夠嚴(yán)重或不能持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間。HYP是組成機(jī)體膠原蛋白的一種特有氨基酸，除了彈性蛋白含有少量HYP（1%）外，幾乎所有HYP都存在于膠原中［16］。此結(jié)果提示大鼠PFIB-ALI的長(zhǎng)期修復(fù)過(guò)程中可能未發(fā)生肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）。原因可能有2個(gè)：①由于PFIB誘導(dǎo)的ALI與其他化學(xué)毒性物質(zhì)，如博萊霉素、野百合堿和百草枯等誘發(fā)的ALI發(fā)病機(jī)制有所不同，后者在2～4周后通常伴有PF的發(fā)生。PFIB誘導(dǎo)的ALI可能與組胺類(lèi)藥物中毒引起肺損傷病例相似，多表現(xiàn)為單純性肺水腫，常較易修復(fù)［17］，后期無(wú)PF的發(fā)生。②可能是由于單次低劑量PFIB暴露，不足以引起肺泡上皮細(xì)胞的過(guò)度異常修復(fù)與成纖維細(xì)胞的過(guò)度激活［18］。因此，有必要在后期研究中增大PFIB的染毒劑量，并通過(guò)增加組織病理學(xué)觀察及肺泡炎和纖維化評(píng)分等實(shí)驗(yàn)方法，進(jìn)一步觀察高劑量PFIB染毒后ALI的長(zhǎng)期修復(fù)過(guò)程中有無(wú)PF的生成。

3.2 清開(kāi)靈早期治療效果觀察

本研究觀察到清開(kāi)靈對(duì)PFIB-ALI大鼠的早期治療有幾以下幾方面效果。

第一，可改善低劑量PFIB-ALI引起的肺水腫并顯著抑制肺組織蛋白滲漏。在染毒后24 h，清開(kāi)靈治療組大鼠BALF中蛋白質(zhì)含量較PFIB中毒組顯著下降；各項(xiàng)肺系數(shù)與PFIB中毒組大鼠相比無(wú)顯著性差異，但均有下降趨勢(shì)，可能是PFIB染毒劑量較低，癥狀不嚴(yán)重，大鼠的個(gè)體差異較大所致。提示清開(kāi)靈早期治療可改善低劑量PFIB-ALI大鼠的肺水腫，抑制肺組織蛋白滲漏。本課題組前期研究結(jié)果表明，清開(kāi)靈對(duì)PFIB所致肺水腫和炎性滲出具有肯定的抑制作用，總膽酸是清開(kāi)靈對(duì)抗PFIBALI的有效成分，具體機(jī)制可能與其表面活性作用有關(guān)［10-12］。清開(kāi)靈治療組大鼠肺組織蛋白滲漏的減少，可能與該組大鼠后期肺功能幾無(wú)降低的結(jié)果密切相關(guān)。

第二，可改善PFIB-ALI氣體交換功能。在染毒后24 h，PFIB中毒組大鼠和清開(kāi)靈治療組大鼠PaO2與正常組相比均顯著降低，但染毒后3周，PFIB中毒組大鼠PaO2依然顯著低于正常對(duì)照組，而清開(kāi)靈治療組大鼠PaO2已恢復(fù)至正常組水平。PFIB中毒組大鼠SaO2在染毒后24 h～3周均顯著低于正常對(duì)照組，而清開(kāi)靈治療組大鼠SaO2自染毒后24 h至觀察結(jié)束，均保持在正常水平。這一結(jié)果提示，早期清開(kāi)靈治療可顯著改善PFIB-ALI大鼠的氣體交換功能。

第三，對(duì)PFIB-ALI肺功能的恢復(fù)有一定的作用。在本研究中，染毒后24 h清開(kāi)靈治療組大鼠的TV，EV，PIF和PEF值與PFIB中毒組大鼠相比無(wú)顯著性差異，均顯著低于正常對(duì)照組；從染毒后3～48周，清開(kāi)靈治療組大鼠以上指標(biāo)均恢復(fù)至正常水平，而染毒后48周時(shí)PFIB中毒組大鼠上述指標(biāo)較正常對(duì)照組和清開(kāi)靈治療組顯著降低，提示清開(kāi)靈對(duì)PFIB-ALI大鼠的肺功能具有一定的保護(hù)作用，使其在急性反應(yīng)期后的修復(fù)過(guò)程中逐漸恢復(fù)至正常水平。這種作用可能與清開(kāi)靈早期治療能顯著對(duì)抗肺組織蛋白滲漏、改善肺水腫和氣體交換功能有關(guān)，具體的機(jī)制尚有待于后期的進(jìn)一步研究。

總之，清開(kāi)靈的PFIB-ALI的早期治療效果主要與清開(kāi)靈中的膽酸成分的表面活性作用有關(guān)。PFIB中毒早期，膽酸的表面活性作用可屏蔽肺組織蛋白的帶電基團(tuán)，抑制肺組織蛋白水解和蛋白磷酸化，保護(hù)氣血屏障的完整性，從而起到對(duì)抗PFIBALI的作用?；瘜W(xué)吸入性肺損傷具有獨(dú)特的臨床特點(diǎn)，一旦能安全度過(guò)急性期，即可進(jìn)入恢復(fù)期，很少有后遺癥。因此，在中毒早期進(jìn)行有效治療是化學(xué)吸入性肺損傷治療的關(guān)鍵。

本研究是窒息性氣體PFIB單次暴露誘發(fā)大鼠ALI長(zhǎng)期效應(yīng)觀察研究的一部分，研究結(jié)果對(duì)開(kāi)展高劑量PFIB單次暴露誘發(fā)大鼠ALI長(zhǎng)期效應(yīng)觀察奠定基礎(chǔ)，為進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并改進(jìn)實(shí)驗(yàn)條件提供了一定的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，也為臨床PFIB暴露后ALI患者急性期后的長(zhǎng)期康復(fù)治療提供參考。

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Long-term toxicity to respiratory system of rats by low-dose perfluoroisobutylene exposure once and possible beneficial effect of early intervention via Qingkailing injection

LIU Fang1，2，ZHANG Dong-quan3，XU Xing-xing1，ZOU Chun-ping3，HU Zu-liang3，LIU Yue-zhen3，ZHAO Jian1，4，DING Ri-gao1，4
（1.Institute of Pharmacology and Toxicology，Academy of Military MedicalSciences，Beijing 100850，China；2.Clinic of the Information and Communication Bureau of Joint Staff Department，Central Military Commisson，Beijing 100840，China；3.Zhejiang Quhua Hospital，Quzhou 324004，China；4.State Key Laboratory of Toxicology and MedicalCountermeasures，Beijing 100850，China）

OBJECTIVE To clarify the long-term toxicity to the respiratory system in a rat model of acute lung injury（ALI）induced by a single low-dose of perfluoroisobutylene（PFIB）inhalation expo?sure，and observe the possible beneficial effect of early intervention via Qingkailing（QKL）injection. METHODS Totally 224 male Wistar rats were randomly divided into 4 groups：normalcontrolgroup in which air exposure was followed by a saline 10 mL·kg-1（ip），QKL control group in which QKL 10 mL·kg-1was ip given after air exposure，PFIB exposure group in which rats were exposed to PFIB 280 mg·m-3for 5 min only，and QKL treatmentgroup in which QKL 10 mL·kg-1was given ip at1 h after PFIB exposure. Lung functions of rats were measured at 24 h，3，6，12，24，36 and 48 weeks after exposure.Thearterialblood gas，lung coefficient，protein content in bronchoalveolar lavage fluid（BALF），hydroxy?proline（HYP）content in lung tissue and plasma，and other indicators were detected or analyzed. RESULTS Within 24 h after PFIB exposure，the lung coefficient and protein content in BALF were increased significantly（P＜0.01），whereas the PaO2（P＜0.01）and SaO2（P＜0.05）indices in arterial blood decreased significantly in PFIB group compared with normal control.The inhalation time，exhalation time，tidalvolume（TV），expired volume（EV）and relaxed time were reduced significantly（P＜0.01）.However，all the above indicators returned to normal in 3 weeks，but TV，EV and peak expiratory flow were significantly lower than in normalgroup at 48 weeks（P＜0.05）.HYP contents in lung tissues，compared with normalcontrol（P＜0.05），were reduced significantly within 24 h after PFIB exposure，increased significantly in 6 weeks（P＜0.05），then returned to normal in 12 weeks.HYP contents in plasma increased significantly compared with normal control（P＜0.05）within 24 h after PFIB exposure but returned to normal in 3 weeks.The protein contents in BALF of QKL treatment group were significantly lower than those in PFIB group（P＜0.01）within 24 h after PFIB exposure. From 24 h to 24 weeks after PFIB exposure，changes of pulmonary functions were similar to those in PFIB group.At 48 weeks，TV and EV in QKL treatment group were more significantly increased than those in PFIB group（P＜0.05）.CONCLUSION Rats with ALI induced by a single low dose of PFIB exposure undergo compensatory repair except for pulmonary capacity and pulmonary ventilation functions. Early treatment with QKL reduces protein content of BALF and alleviates pulmonary edema，and has some beneficialeffecton lung function recovery later.

perfluoroisobutylene；acute lung injury；Qingkailing injection；pulmonary function；long-term toxicity

The projectsupported by NaturalScience Foundation of Zhejiang Province（Y13H240001）

ZHAO Jian，Tel：（010）66931646，E-mail：jian_zhao@126.com；DING Ri-gao，Tel：（010）66874561，E-mail：dingrigao@bmi.ac.cn

R827.12，R285.5

A

1000-3002-（2016）05-0517-09

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.05.006

2015-08-06接受日期：2016-03-21）

（本文編輯：齊春會(huì)）

浙江省自然科學(xué)基金（Y13H240001）

劉芳，女，博士研究生，主管藥師，主要從事化學(xué)毒物毒理學(xué)和抗毒藥物藥理學(xué)研究，E-mail：liufangtxb@ 163.com

趙建，E-mail：jian_zhao@126.com，Tel：（010）66931646；丁日高，E-mail：dingrigao@bmi.ac.cn，Tel：（010）66874561