陳達(dá)++++++廖州偉++++++馬篤軍++++++王立新++++++彭力平

[摘要] 目的 比較牛膝醇提物（AEAB）與硫酸氨基葡萄糖和雙醋瑞因?qū)τ谕霉顷P(guān)節(jié)炎（OA）的療效。 方法 將35只實(shí)驗(yàn)兔采用隨機(jī)區(qū)組分組法分為正常組、模型組、AEAB組、硫酸氨基葡萄糖組和雙醋瑞因組，每組7只。石膏固定制動(dòng)6周制備OA模型，造模后，分別以蒸餾水、AEAB、硫酸氨基葡萄糖及雙醋瑞因灌胃，正常組不予處理，6周后處死實(shí)驗(yàn)兔，取軟骨標(biāo)本進(jìn)行大體觀察、Pelletier評(píng)分、Mankin評(píng)分，用免疫組化測(cè)定軟骨Ⅱ型膠原蛋白含量，用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法檢測(cè)血清和關(guān)節(jié)液中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）以及基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）的含量。 結(jié)果 AEAB組、硫酸氨基葡萄糖組和雙醋瑞因組Pelletier評(píng)分、Mankin評(píng)分、Ⅱ型膠原蛋白含量、血清和關(guān)節(jié)液中TNF-α、IL-1β以及MMP-3的含量分別與正常組、模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）；AEAB組與硫酸氨基葡萄糖組及雙醋瑞因組比較，上述指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P > 0.05）。 結(jié)論 AEAB可以促進(jìn)兔OA模型的軟骨修復(fù)，其療效與硫酸氨基葡萄糖及雙醋瑞因相當(dāng)，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

[關(guān)鍵詞] 牛膝醇提物；骨關(guān)節(jié)炎；硫酸氨基葡萄糖；雙醋瑞因；療效

[中圖分類(lèi)號(hào)] R684.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2016）09（a）-0021-04

[Abstract] Objective To compare the effects of alcohol extract of Achyranthis Bidentatae Radix （AEAB）， glucosamine sulfate and Diacerein in the treatment of rabbits with osteoarthritis （OA）. Methods With blocked randomization， thirty-five experimental rabbits were divided into normal group， model group， AEAB group， glucosamine sulfate group， Diacerein group， with 7 rabbits in each group. The OA models were established by immobilizing rabbits， knees with plaster cast for 6 weeks， and distilled water， AEAB， glucosamine sulfate， Diacerein were respectively given by lavage after modeling. Normal group was not treated. The experimental rabbits were killed six weeks later， and the cartilage samples were taken to perform gross observation， Pelletier score， Mankin score， and the type Ⅱ collagen was measured by immunohistochemistry method and the tumor necrosis factor alpha （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β） and matrix metallo-proteinase-3 （MMP-3） in serum and joint fluid were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） method. Results There were all statistically significant differences of Pelletier score， Mankin score， content of type Ⅱ collagen， TNF-α， IL-1β and MMP-3 in AEAB group， glucosamine sulfate group， Diacerein group compared with normal group and model group respectively （P < 0.05 or P < 0.01）， while there were no statistically significant differences in aforementioned indexes among AEAB group， glucosamine sulfate group and Diacerein group respectively （all P > 0.05）. Conclusion AEAB can promote the cartilage repair in rabbits with OA， and it has equivalent effects with glucosamine sulfate and Diacerein， so it has high value in clinical application.

[Key words] Alcohol extract of Achyranthis Bidentatae Radix； Osteoarthritis； Glucosamine sulfate； Diacerein； Effects

骨關(guān)節(jié)炎（OA）是以關(guān)節(jié)軟骨退行性變?yōu)楹诵牟±砀淖兊穆躁P(guān)節(jié)疾病，硫酸氨基葡萄糖和雙醋瑞因作為治療OA的西藥代表，可以預(yù)防OA的進(jìn)一步發(fā)展和促進(jìn)軟骨修復(fù)[1-2]。目前有研究證實(shí)[3]，部分中藥也有促進(jìn)軟骨修復(fù)的作用。本課題組前期實(shí)驗(yàn)表明，牛膝醇提物（AEAB）能增加兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖[4-5]。本研究進(jìn)一步探討了AEAB促進(jìn)軟骨修復(fù)的機(jī)制，并比較了其與硫酸氨基葡萄糖和雙醋瑞因?qū)A的療效，希望為臨床應(yīng)用AEAB治療OA提供依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康新西蘭兔35只，兔齡2～3個(gè)月，體重（1.86±0.52）kg，雌雄不限，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（粵）2014-0035；動(dòng)物飼料許可證號(hào)：SCXK（粵）2013-0002。本研究遵循了單位、地區(qū)以及國(guó)家所制訂的有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用的指南，并經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑

硫酸氨基葡萄糖（信東生技股份有限公司提供，批號(hào)：7KB0102，國(guó)藥產(chǎn)品注冊(cè)證號(hào)：HC20120036）；雙醋瑞因（昆明積大制藥股份有限公司提供，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字J201000150，進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)：H20100350）；AEAB（深圳市中醫(yī)院提供，批號(hào)：20150731）；Rabbit腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）Kit（貨號(hào)：AE90301Rb）、Rabbit白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）ELISA Kit、（貨號(hào)：AE90731Rb）、Rabbit基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）ELISA Kit（貨號(hào)：3460）由AMEKO公司提供；免疫組化第一抗體Anti-Collagen Type Ⅱ由德國(guó)默克密理博公司提供（貨號(hào)：CP18-100UGCN）。

1.3 AEAB的制備

依據(jù)《中國(guó)藥典》[6]浸漬法制備：每毫升醇提液相當(dāng)于含原材料1 g。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組 健康新西蘭兔35只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后采用隨機(jī)區(qū)組分組法進(jìn)行分組，分為正常組、AEAB組、硫酸氨基葡萄糖組、雙醋瑞因組及模型組，每組各7只，一兔一籠進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)喂養(yǎng)，每天觀察實(shí)驗(yàn)兔的食量、大小便、活動(dòng)度、步態(tài)及精神狀況。

1.4.2 造模方法 參考曾俊華等[7]的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行造模：將兔右膝關(guān)節(jié)用棉墊包裹好后于伸直位管型石膏固定制動(dòng)6周，每天記錄實(shí)驗(yàn)兔肢端血液循環(huán)及石膏穩(wěn)定度情況，若發(fā)現(xiàn)石膏松動(dòng)脫落，立即重新打制石膏固定，若發(fā)現(xiàn)石膏過(guò)緊，肢端血液循環(huán)差、掉毛、皮膚壞死及潰瘍等情況，立即用石膏剪調(diào)整石膏松緊度。

1.4.3 藥物干預(yù) 參照藥理試驗(yàn)中動(dòng)物與人體間的等效劑量進(jìn)行換算：結(jié)合體重按相應(yīng)劑量用蒸餾水稀釋成10 mL后連續(xù)灌服6周：牛膝組：1 mg/（kg·d）；硫酸氨基葡萄糖組：77 mg/（kg·d）；雙醋瑞因：5.1 mg/（kg·d），每天灌胃2次，模型組：蒸餾水10 mL，每天灌胃2次；正常組不予處理。

1.4.4 ELISA法檢測(cè)血清和關(guān)節(jié)液中TNF-α、IL-1β以及MMP-3的含量 自兔耳緣靜脈取血10 mL，取血清。將兔麻醉，造模膝關(guān)節(jié)剪毛、消毒，用l mL生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔，抽出沖洗液，3000 r/min離心10 min，取上清液置于-20℃冰箱保存。待所有標(biāo)本均采集完畢后，采用ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-1β以及MMP-3的含量，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4.5 關(guān)節(jié)軟骨常規(guī)病理學(xué)檢測(cè) 灌胃6周后將全部實(shí)驗(yàn)兔以空氣栓塞法處死，將右膝關(guān)節(jié)上下1.0～1.5 cm處用銳器切斷，整塊取下股骨髁部和脛骨平臺(tái)，首先按Pelletier原則[8]進(jìn)行關(guān)節(jié)軟骨大體形態(tài)學(xué)觀察評(píng)分，分值越高說(shuō)明軟骨退變?cè)絿?yán)重；將一部分軟骨標(biāo)本處理后進(jìn)行免疫組化染色，測(cè)定Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)含量情況，用陽(yáng)性百分率表示；然后將另一部分軟骨標(biāo)本行HE染色，光鏡下觀察組織形態(tài)變化，采用改良Mankin法[9]對(duì)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞、染色以及潮線的完整性進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分越高說(shuō)明軟骨退變?cè)絿?yán)重。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間差異采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用成組設(shè)計(jì)的q檢驗(yàn)；組織病理學(xué)評(píng)分則采用Kruskal-Wallis法檢驗(yàn)組間差異；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物一般情況

實(shí)驗(yàn)期間有2只實(shí)驗(yàn)兔有腹瀉癥狀，予土霉素灌胃1～2 d后均好轉(zhuǎn)；其余實(shí)驗(yàn)兔健康狀況良好。

2.2 軟骨組織大體觀察、Pelletier評(píng)分、HE染色、Mankin評(píng)分

正常組軟骨結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常，軟骨細(xì)胞數(shù)目正常，軟骨細(xì)胞呈圓形，散在分布，基質(zhì)染色呈淺紅色，潮線結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；模型組軟骨表面可見(jiàn)不規(guī)則裂隙達(dá)輻射層，軟骨細(xì)胞數(shù)目減少、結(jié)構(gòu)紊亂，伴炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)簇集樣細(xì)胞團(tuán)形成，局部基質(zhì)染色變淺，局部可見(jiàn)多重潮線；AEAB組、硫酸氨基葡萄糖組和雙醋瑞因組局部軟骨表面可見(jiàn)不規(guī)則裂隙達(dá)鈣化層，軟骨細(xì)胞數(shù)量增多，基質(zhì)染色呈淺紅色，潮線結(jié)構(gòu)稍正常（圖1）。Pelletier評(píng)分和Mankin評(píng)分在正常組與模型組，以及正常組、模型組分別與AEAB組、硫酸氨基葡萄糖組和雙醋瑞因組組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01或P < 0.05），在AEAB組與硫酸氨基葡萄糖組及雙醋瑞因組組間兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 免疫組化測(cè)定Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)含量

正常組Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)含量與模型組比較差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。AEAB組、硫酸氨基葡萄糖組和雙醋瑞因組提示Ⅱ型膠原表達(dá)量增加，結(jié)構(gòu)紋理清晰，三組與正常組及模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。三組兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P > 0.05）。見(jiàn)圖2（封三）、表2。

2.4 各組血清和關(guān)節(jié)液中TNF-α、IL-1β以及MMP-3的含量比較

正常組血清和關(guān)節(jié)液中TNF-α、IL-1β以及MMP-3的含量與模型組比較，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.01）；模型組分別與AEAB組、硫酸氨基葡萄糖組和雙醋瑞因組比較，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.01），表明三者對(duì)兔OA均有較好的治療效果；AEAB組與硫酸氨基葡萄糖組和雙醋瑞因組組間兩兩比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P > 0.05），表明AEAB的治療效果與硫酸氨基葡萄糖和雙醋瑞因相當(dāng)。見(jiàn)表3～4。

3 討論

目前OA的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，研究表明，軟骨破壞以Ⅱ型膠原和蛋白多糖破壞丟失最明顯[10]，而軟骨基質(zhì)中的主要成分Ⅱ型膠原對(duì)維持軟骨的生物力學(xué)起決定性作用[11]。相關(guān)研究表明各種炎性因子在OA發(fā)病過(guò)程中起到重要作用[12]。近年研究提示MMPs對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的損傷是OA發(fā)病的“共同通路”[13-14]。MMP-3是MMPs的主要成員之一，其不僅能降解多種基質(zhì)蛋白底物，更為重要的是MMP-3可激活MMP-1、MMP-9、MMP-13等酶原產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，加速軟骨破壞[15]。IL-1β和TNF-α是已經(jīng)被證實(shí)在OA的發(fā)病中起到重要介導(dǎo)作用的炎性因子[16-17]，具有抑制軟骨合成、加快關(guān)節(jié)軟骨降解的作用。

牛膝作為中藥治療OA中較為突出的一味，吸引了許多學(xué)者對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行研究。本課題組前期實(shí)驗(yàn)表明，牛膝能增加兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖，提高軟骨Ⅱ型膠原表達(dá)，促進(jìn)骨髓源成體干細(xì)胞軟骨分化[4-5]。李成付等[11]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)AEAB能降低軟骨CKIP-1、Caspase-3蛋白表達(dá)，提高Bcl-2/Bax/Akt蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)軟骨修復(fù)。

OA動(dòng)物模型構(gòu)建的方法有很多種，石膏固定制動(dòng)制備OA模型，具有簡(jiǎn)單易行、無(wú)創(chuàng)傷、成功率高等特點(diǎn)，重要的是此法沒(méi)有手術(shù)創(chuàng)傷的干擾，其病理改變更接近人類(lèi)OA的發(fā)病過(guò)程[18]，適用于研究藥物療效及藥物對(duì)關(guān)節(jié)軟骨成分、炎癥介質(zhì)表達(dá)等方面的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，AEAB組軟骨細(xì)胞數(shù)量及Ⅱ型膠原蛋白含量較模型組增多，Pelletier評(píng)分和改良Mankin評(píng)分明顯降低，軟骨基質(zhì)結(jié)構(gòu)紋理變整齊，同時(shí)發(fā)現(xiàn)AEAB能降低血清及關(guān)節(jié)液中MMP-3、IL-1β、TNF-α的含量，從而減輕其對(duì)關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的損害，直接或間接改善軟骨基質(zhì)代謝，促進(jìn)軟骨修復(fù)，其效果和硫酸氨基葡萄糖及雙醋瑞因無(wú)明顯差異，說(shuō)明AEAB與目前治療OA的西藥代表藥物療效相當(dāng)，可為其臨床使用提供參考及依據(jù)。但是，硫酸氨基葡萄糖與雙醋瑞因存在胃腸道、過(guò)敏甚至心血管系統(tǒng)、外周水腫等不良反應(yīng)[19-20]，而牛膝不但對(duì)OA有較好的治療效果，而且根據(jù)現(xiàn)代藥理研究[21]，牛膝還有增強(qiáng)免疫力、保肝、護(hù)肝、強(qiáng)心、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移等許多有益健康的作用，而其副作用目前尚無(wú)報(bào)道，因此本研究認(rèn)為AEAB具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)，其有效成分的篩選、中西藥聯(lián)合應(yīng)用的療效以及干預(yù)方式的優(yōu)化等尚待進(jìn)一步探索。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 楊旦紅，穆懷典，黃俊武.硫酸氨基葡萄糖治療膝骨關(guān)節(jié)炎的臨床分析[J].中國(guó)醫(yī)藥指南，2015，13（22）：112-113.

[2] 黃進(jìn)賢，張會(huì)昌，尹志華，等.雙醋瑞因、硫酸氨基葡萄糖聯(lián)合玻璃酸鈉治療膝骨關(guān)節(jié)炎的療效[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2013，29（22）：3749-3751.

[3] 陳浩雄，徐寧達(dá)，彭力平，等.中藥治療膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨修復(fù)實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2014，23（25）：2843-2845.

[4] 彭力平，馬篤軍，林棟棟，等.牛膝醇提物體內(nèi)誘導(dǎo)兔骨關(guān)節(jié)炎模型軟骨修復(fù)的病理學(xué)觀察[J].湖南中醫(yī)雜志，2013，29（2）：126-129.

[5] 彭力平，馬篤軍，裴軍宇，等.牛膝醇提物對(duì)急性軟骨損傷兔軟骨的影響[J].中醫(yī)雜志，2013，54（17）：1504-1506.

[6] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[M].一部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

[7] 曾俊華，馬篤軍，彭力平，等.實(shí)驗(yàn)兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型的建立及鑒定[J].中國(guó)臨床研究，2016，29（5）：679-682.

[8] Pelletier JP，Jovanovic D，F(xiàn)ernandes JC，et al. Reduced progression of experimental osteoarthritis in vivo by selective inhibition of inducible nitric oxide synthase [J]. Arthritis Rheumatol，1998，41（7）：1275-1286.

[9] Mankin HJ，Dorfman H，Lippiello L，et al. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. Ⅱ. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data [J]. J Bone Joint Surg Am，1971，53（3）：523-537.

[10] 張猛，周嘉俊，羅宗平.軟骨損傷后Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)[J].中國(guó)組織工程研究，2014，18（51）：8305-8309.

[11] 李成付，王玖忠，邊瑜健，等.牛膝醇提物促進(jìn)兔骨關(guān)節(jié)炎軟骨修復(fù)的作用及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)臨床研究，2015，28（7）：844-847.

[12] 郭偉雄，魏波.炎癥細(xì)胞因子及通路在骨關(guān)節(jié)炎中的研究進(jìn)展[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2015，36（15）：2240-2241.

[13] 陽(yáng)樂(lè)，許鵬.促炎細(xì)胞因子與骨關(guān)節(jié)炎[J].中華骨與關(guān)節(jié)外科雜志，2015，8（5）：455-459.

[14] Pathak NN，Lingaraju MC，Balaganur V，et al. Anti-inflammatory and chondroprotective effects of atorvastatin in a cartilage explant model of osteoarthritis [J]. Inflammation Res，2015，64（3/4）：161-169.

[15] 賀占坤，沈杰威.MMP-2、MMP-3、MMP-9和TIMP-1評(píng)價(jià)膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的臨床研究[J].重慶醫(yī)學(xué)，2013， 42（32）：3872-3874.

[16] Ismail HM，Kazuhiro Y，Vincent TL，et al. Interleukin 1 acts via c-jun N-terminal kinase-2 signalling pathway to induce aggrecan degradation by human chondrocytes [J]. Arthritis Rheumatol，2015，67（7）：1826-1836.

[17] Osta B，Roux JP，Lavocat F，et al. Differential effects of IL-17A and TNF-α on osteoblastic differentiation of isolated synoviocytes and on bone explants from arthritis patients [J]. Front Immunol，2015，6：151.

[18] 陳志達(dá)，林瀚洋，余志毅，等.膝骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型研究進(jìn)展[J].風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2016，5（1）：67-70.

[19] 邱貴興，翁習(xí)生，張克，等.鹽酸/硫酸氨基葡萄糖治療骨關(guān)節(jié)炎的平行對(duì)照臨床研究[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2005， 85（43）：3067-3070.

[20] 瞿雷.雙醋瑞因治療骨關(guān)節(jié)炎的多中心臨床研究[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2015，13（35）：40-41.

[21] 田碩，苗明三.牛膝的化學(xué)、藥理及應(yīng)用特點(diǎn)探討[J].中醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，29（8）：1186-1188.