劉倍吟 魏程科 李應(yīng)東

摘要：目的 觀察當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)高血壓模型大鼠血壓和相關(guān)炎癥因子的影響，探討其降壓的作用機(jī)制。方法 采用N-硝基-L-精氨酸灌胃建立高血壓大鼠模型。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽(yáng)性藥組和當(dāng)歸揮發(fā)油高、低劑量組，每組5只。各給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃，連續(xù)8周。采用無(wú)創(chuàng)血壓檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)給藥前后大鼠尾動(dòng)脈收縮壓；ELISA檢測(cè)大鼠血清內(nèi)皮素-1（ET-1）、血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）、超敏C反應(yīng)蛋白（CRP）水平；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)心臟組織CRP mRNA表達(dá)。結(jié)果 與正常組比較，模型組收縮壓、ET-1、VCAM-1、CRP水平及其mRNA表達(dá)明顯升高（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，各給藥組ET-1、VCAM-1、CRP水平及其mRNA表達(dá)明顯降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論 當(dāng)歸揮發(fā)油可能通過(guò)抑制血管炎癥反應(yīng)起到降壓作用。

關(guān)鍵詞：當(dāng)歸揮發(fā)油；高血壓；炎癥細(xì)胞因子；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.11.017

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）11-0071-04

Abstract： Objective To observe the effects of volatile oil of Angelicae Sinensis Radix on blood pressure and related inflammatory cytokines of hypertensive rat models； To investigate the action mechanism of regulating the blood pressure. Methods Wistar male rats were fed with L-NNA to establish hypertensive rat models. Hypertensive rats were randomly divided into normal control group， model group， positive medicine group， volatile oil of Angelicae Sinensis Radix high- and low-dose groups， with 5 rats in each group. Each medication group was given relative medicine for gavage for 8 weeks. Non-invasive blood pressure measurement system was used to observe the systolic pressure of tail artery of rats before and after medication； the levels of ET-1， CRP， and VCAM-1 in serum were detected by the method of ELISA； RT-PCR was used to measure CRP mRNA of heart. Results The levels of systolic blood pressure， ET-1， VCAM-1， CRP and CRP mRNA in model group were significantly higher than those of normal group （P<0.05， P<0.01）； Compared with model group， the levels of ET-1， VCAM-1， CRP and CRP mRNA in model group significantly decreased （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Volatile oil of Angelicae Sinensis Radix can inhibit vascular inflammatory response and then realize the effects of regulating blood pressure.

Key words： volatile oil of Angelicae Sinensis Radix； hypertension； inflammatory cytokines； rats

血管內(nèi)皮功能障礙是高血壓的重要病理機(jī)制，其與血管炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[1]。已有研究表明，當(dāng)歸具有減輕炎癥反應(yīng)、抗氧化、抗血小板凝集、延緩衰老、增強(qiáng)免疫力等藥理作用[2]。當(dāng)歸揮發(fā)油是當(dāng)歸的脂溶性成分，主要含有藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞等，可降低兔胸主動(dòng)脈平滑肌的張力、擴(kuò)張血管[3]，減輕炎癥反應(yīng)[4]，而對(duì)高血壓發(fā)病過(guò)程中血管內(nèi)皮功能及血管炎癥反應(yīng)的作用，目前尚未見相關(guān)報(bào)道。據(jù)此，我們采用N-硝基-L-精氨酸（L-NNA）灌胃建立高血壓大鼠模型，觀察當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)大鼠血清內(nèi)皮素-1（ET-1）、血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）、超敏C反應(yīng)蛋白（CRP）水平及其mRNA表達(dá)的影響，揭示其對(duì)血壓和炎癥因子的干預(yù)作用，探討其降壓的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

雄性13周齡Wistar大鼠30只，體質(zhì)量（240±20）g，SPF級(jí)，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)SCXK（甘）2011-0001。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，室溫（23±2）℃、濕度45%～55%，自由飲水進(jìn)食。

1.2 藥物

當(dāng)歸揮發(fā)油（含藁本內(nèi)酯>75%），甘肅岷縣康達(dá)藥業(yè)開發(fā)有限責(zé)任公司，超臨界CO2萃取，1%吐溫-80助溶，加蒸餾水配成所需濃度；卡托普利片，上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號(hào)141005；L-NNA，上海源葉生物有限公司，批號(hào)YY10014-100g。

1.3 主要試劑與儀器

ET-1、CRP、VCAM-1 ELISA試劑盒，上海源葉生物科技有限公司；Trizol RNA提取試劑，Invitrogen公司；Reverse Transcription System、qPCR Master Mix試劑盒，Promega公司；TMC203型BP-98A動(dòng)物無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)定系統(tǒng)，日本東芝公司；多功能酶標(biāo)儀，瑞士Tecan Infinite；超微量紫外可見分光光度計(jì)，美國(guó)Quawell；Sorvall Fresco低溫高速離心機(jī)，美國(guó)索福公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國(guó)BIO-RAD公司；JY600電泳儀，北京君意東方電子設(shè)備有限公司；Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)BIO-RAD公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模

30只雄性Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，于第6日14：00測(cè)定收縮壓，每只大鼠測(cè)量3次，取平均值。隨機(jī)取5只大鼠作為正常對(duì)照組，其余25只大鼠第7日10：00每日灌胃L-NNA 490 mg/kg，連續(xù)28 d，于第7、14、21、28日14：00測(cè)量收縮壓，每只大鼠測(cè)量3次，取平均值，以平均收縮壓≥180 mm Hg為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。停藥后正常飼養(yǎng)5 d，14：00測(cè)定收縮壓，每只大鼠測(cè)量3次，取其平均值，結(jié)果20只大鼠造模成功。

2.2 分組及給藥

造模前隨機(jī)選取5只Wistar大鼠作為正常組；造模后將成模大鼠按體質(zhì)量、收縮壓分為模型組、陽(yáng)性藥組、當(dāng)歸揮發(fā)油高劑量組（中藥高劑量組）、當(dāng)歸揮發(fā)油低劑量組（中藥低劑量組），每組5只。陽(yáng)性藥組每日予卡托普利藥液25 mg/kg灌胃，相當(dāng)于臨床成人日用量的10倍；中藥高劑量組每日予含當(dāng)歸揮發(fā)油10%當(dāng)歸揮發(fā)油乳劑15 mL/kg灌胃，相當(dāng)于成人日用當(dāng)歸原藥材30 g的20倍；中藥低劑量組每日予含當(dāng)歸揮發(fā)油5%當(dāng)歸揮發(fā)油乳劑15 mL/kg灌胃，相當(dāng)于成人日用當(dāng)歸原藥材30 g的10倍；模型組和正常組予等容量生理鹽水灌胃。每日1次，連續(xù)8周。

2.3 大鼠血壓觀察

用BP-98A動(dòng)物無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量系統(tǒng)測(cè)定安靜狀態(tài)下大鼠尾動(dòng)脈收縮壓，于給藥第0、5、15、25、35、45、55、60日14：00測(cè)量血壓，每只大鼠測(cè)量3次，取其平均值。

2.4 標(biāo)本采集

第61日乙醚麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血10 mL，靜置30 min，4000 r/min離心10 min，分離血清；取心臟組織，液氮冷凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 ELISA檢測(cè)血清內(nèi)皮素-1、血管細(xì)胞黏附分子-1、超敏C反應(yīng)蛋白水平

按試劑盒說(shuō)明設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，每組3個(gè)復(fù)孔，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成5個(gè)梯度（濃度為0的標(biāo)準(zhǔn)品S0號(hào)視為空白孔），每孔50 μL；樣本孔先加待測(cè)樣本10 μL，后加樣本稀釋液40 μL；除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL，封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃水浴60 min；棄液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次；每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min；每孔加入終止液50 μL，15 min內(nèi)，于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔OD值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值，各樣本濃度×5即為樣本實(shí)際濃度。

2.6 RT-PCR檢測(cè)心臟組織超敏C反應(yīng)蛋白基因表達(dá)

2.6.1 提取總RNA 稱取心臟組織1.8 g，置于4 mL無(wú)酶EP管內(nèi)，各加1.5 mL預(yù)冷PBS，用組織勻漿器勻漿；4 ℃、3000 r/min離心10 min，棄上清液；各加1 mL Trizol，混勻；轉(zhuǎn)移到1.5 mL無(wú)菌管中，冰上靜置5 min；各加0.2 mL氯仿，劇烈振蕩15 s，冰上靜置2 min，4 ℃、13 500 r/min離心15 min，取上清液至新的離心管中；各加入等體積異丙醇，輕輕混勻，冰上靜置10 min，4 ℃、13 500 r/min 離心10 min，棄上清液；向沉淀中緩慢輕輕加入-20 ℃預(yù)冷的75%乙醇1 mL，小心清洗沉淀；4 ℃、13 500 r/min離心10 min；棄上清液，室溫干燥5 min，各加40 μL 1‰DEPC水溶解沉淀；紫外分光光度法測(cè)定總RNA，用1‰DEPC水調(diào)整總RNA至相同濃度500 ng/μL。

2.6.2 cDNA反轉(zhuǎn)錄 冰上配制10 μL反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系[2 μL MgCl2，2 μL 5×Reaction Buffer，1 μL PCR Nucleotide Mix，0.25 μL Oligo（dT）15 Primer，0.5 μL Go Script Reverse Transcriptase，0.25 μL Ribonuclease Inhibitor，3 μL RNase Free Water，1 μL總RNA樣本]，反應(yīng)條件：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃、60 min；CRP反應(yīng)引物、GAPDH內(nèi)參基因由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，見表1。

2.6.3 RT-PCR擴(kuò)增 冰上配制20 μL PCR反應(yīng)體系[12.5 μL qPCR Master Mix，0.25 μL CxR Reference Dye，4.25 μL Nuclease-Free Water，2 μL引物，1 μL模板DNA]，反應(yīng)條件：94 ℃、2 min，94 ℃、30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、1 min，72 ℃、5 min，35個(gè)循環(huán)，4 ℃保存。反應(yīng)及數(shù)據(jù)采集在CFX-96系統(tǒng)上進(jìn)行，記錄CRP與內(nèi)參基因GAPDH達(dá)到熒光設(shè)定值所需循環(huán)數(shù)（Ct值），每個(gè)樣品中CRP的相對(duì)mRNA表達(dá)采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

2.6.4 瓊脂糖凝膠電泳 1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用Bio-Rad Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)分析，確認(rèn)目的片段是否表達(dá)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)模型大鼠血壓的影響

與正常組比較，模型組大鼠收縮壓明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組相關(guān)時(shí)點(diǎn)收縮壓明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表2。

4.2 當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)模型大鼠血清內(nèi)皮素-1、血管細(xì)胞黏附分子-1及超敏C反應(yīng)水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清ET-1、VCAM-1及CRP水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清ET-1、VCAM-1及CRP水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見表3。

4.3 當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)模型大鼠心臟組織超敏C反應(yīng)蛋白基因表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠心臟組織CRP mRNA表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組CRP mRNA表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表4、圖1。

5 討論

高血壓是慢性血管炎癥反應(yīng)性疾病，血管功能障礙是高血壓的重要病理特征。研究表明，在高血壓發(fā)展過(guò)程中，循環(huán)系統(tǒng)促炎癥細(xì)胞因子增多，血管炎癥反應(yīng)與血管功能障礙密切相關(guān)[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給予L-NNA后，抑制一氧化氮（NO）合成，使血管內(nèi)皮收縮，增加血管張力，血壓升高，持續(xù)性引起NO合成減少，則會(huì)導(dǎo)致血壓持續(xù)升高。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇L-NNA建立高血壓模型。

CRP觸發(fā)炎癥反應(yīng)，可以誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子-α，并且受P38MAPK-Toll樣受體4（TLR4）信號(hào)通路調(diào)控。炎癥因子產(chǎn)生增多，可以破壞內(nèi)皮功能，引起收縮性因子分泌增多，同時(shí)血管內(nèi)皮功能紊亂后又可活化巨噬細(xì)胞表面TLR4，進(jìn)一步激活核因子-κB使炎癥因子增多。因此，高血壓血管內(nèi)皮損傷與炎癥反應(yīng)相互影響。通過(guò)干預(yù)炎癥反應(yīng)，可以減輕炎性因子對(duì)高血壓患者帶來(lái)的負(fù)效應(yīng)。

VCAM-1屬于免疫球蛋白超家族，在炎癥反應(yīng)、腫瘤發(fā)展及免疫損傷時(shí)，VCAM-1表達(dá)增多，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[6]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)探討當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)高血壓模型大鼠血壓的影響，結(jié)果顯示當(dāng)歸揮發(fā)油可以降低血壓，降低模型大鼠血清ET-1、CRP、VCAM-1的表達(dá)，RT-PCR結(jié)果顯示，CRP mRNA表達(dá)給藥后下調(diào)，進(jìn)一步明確當(dāng)歸揮發(fā)油可以降低高血壓炎癥因子的表達(dá)，抑制血管炎癥反應(yīng)，這可能是其降壓的潛在機(jī)制，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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