劉 浩，朱維寧，張大鵬，張林生

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100； 2.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710069)

?

小麥脫水素基因 WDHN1-2的克隆及其表達(dá)分析

劉 浩1，朱維寧2，張大鵬1，張林生1

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100； 2.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710069)

為進(jìn)一步明確小麥脫水素基因 WDHN1-2在逆境條件下的功能，以傘穗山羊草 DHN1基因?yàn)樘结?，通過電子克隆及RT-PCR技術(shù)獲得 WDHN1-2基因后對(duì)其序列特征進(jìn)行分析，同時(shí)利用基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)及半定量RT-PCR技術(shù)對(duì)該基因的表達(dá)模式進(jìn)行解析。結(jié)果表明， WDHN1-2基因編碼區(qū)(CDS)長(zhǎng)為548 bp，編碼的氨基酸具有脫水素保守序列K、Y和S片段，與山羊草脫水素EMT25371親緣關(guān)系最近。WDHN1-2蛋白屬于穩(wěn)定且高度親水蛋白，二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主；該蛋白在亞細(xì)胞中定位的可能性：過氧化物酶體>細(xì)胞核>線粒體基質(zhì)，可能行使轉(zhuǎn)錄調(diào)控的功能。表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)， WDHN1-2基因在小麥開花后22 d的胚乳中表達(dá)量最高，在ABA、PEG、NaCl及4 ℃低溫脅迫下表達(dá)量均先上升后下降。

小麥；電子克??；脫水素；生物信息學(xué)分析；半定量RT-PCR

脫水素，即胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白第二家族蛋白，能夠在植物胚胎發(fā)育晚期以及逆境脅迫(如低溫、干旱和高鹽等)下表達(dá)，部分脫水素的表達(dá)受到脫落酸 (ABA) 的誘導(dǎo)[1]。脫水素一般由85～574個(gè)氨基酸殘基組成，其分子量從9.6～200 kDa不等[2-3]。脫水素富含極性氨基酸和親水性氨基酸(甘氨酸和賴氨酸)，缺乏疏水性氨基酸(色氨酸和半胱氨酸)，具有高度親水性和熱穩(wěn)定性，在90 ℃的水浴中仍可保持活性[4-5]。

根據(jù)脫水素中Y、S 和K 保守片段的組成，將其分為5種亞型：YnSKn、Kn、SKn、YnKn和KnS型[6-8]。其中，富含賴氨酸的K 片段是所有脫水素共有的，由15個(gè)氨基酸殘基(EKKGIME/DKIKEKLPG)組成，一般有1～11個(gè)拷貝，位于蛋白質(zhì)C端。這些K片段可以形成兩親性的α-螺旋，通過疏水作用與細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)或蛋白的變性位點(diǎn)結(jié)合，阻止細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞及蛋白質(zhì)變性[9-11]。多數(shù)脫水素的Y 片段位于其N端，其保守序列為(V/T)D(E/Q)YGNP，通常有1～3個(gè)拷貝，該片段與一些植物和細(xì)菌的分子伴侶的核酸結(jié)合位點(diǎn)具有同源性，但是Y 片段是否與核酸結(jié)合還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證[12]。S片段由成串的絲氨酸組成，可被蛋白激酶磷酸化，使脫水素在信號(hào)肽的引導(dǎo)下定位在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核[13-14]。

電子克隆是隨著基因組計(jì)劃和EST計(jì)劃的實(shí)施而發(fā)展起來的，利用生物信息學(xué)手段獲得基因部分或全長(zhǎng)cDNA序列，并通過PCR技術(shù)進(jìn)行基因的克隆及驗(yàn)證[15]。它具有投入低、速度快、針對(duì)性強(qiáng)、技術(shù)要求低等優(yōu)點(diǎn)[16]。因此，電子克隆技術(shù)已成為植物基因工程中獲得新基因的重要手段[17]。本研究以傘穗山羊草脫水素 DHN1基因?yàn)樘结樞蛄?，通過電子克隆及RT-PCR技術(shù)獲得 WDHN1-2基因后對(duì)其序列特征進(jìn)行分析，同時(shí)利用基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)及半定量RT-PCR技術(shù)對(duì)該基因的表達(dá)模式進(jìn)行解析，以期為后續(xù) WDHN1-2基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及其處理

供試材料為普通六倍體小麥品種“中國(guó)春”，由西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。挑選籽粒飽滿的小麥種子，蒸餾水沖洗3次后用75%的乙醇浸泡3～5 min，然后用去離子水沖洗乙醇，并浸泡24 h。取出種子置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿上，加入適量水濕潤(rùn)，于人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(光暗周期為16 h/8 h，晝夜溫度為25 ℃/18 ℃，相對(duì)濕度為80%)。培養(yǎng)7 d后的小麥幼苗分別于4 ℃、20%PEG6000、800 mmol·L-1NaCl及100 μmol·L-1ABA條件下進(jìn)行脅迫，并收集脅迫處理0、12、24、36、48、60 h后的小麥葉片，液氮速凍后，置于-80 ℃保存。

1.2 小麥葉片總RNA的提取及cDNA第一條鏈的合成

采用Invitrogen公司RNA提取試劑盒提取小麥葉片總RNA，并以此為模版，使用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒，去除基因組DNA，合成單鏈cDNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 小麥基因組DNA的提取

采用Tiangen公司植物基因組DNA提取試劑盒提取小麥基因組DNA。

1.4 小麥脫水素 WDHN1-2基因的克隆

以傘穗山羊草 (Aegilopsumbellulata) 脫水素 DHN1基因 (GenBank: AM180925) 為探針，在小麥EST數(shù)據(jù)庫(kù)中Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，下載相似度較高的EST序列，采用 DNAMAN進(jìn)行序列拼接。通過NCBI提供的ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)在線軟件，對(duì)電子克隆得到的基因序列進(jìn)行開放式閱讀框分析，初步確定所拼接序列為小麥 DHN1基因。利用小麥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Inde) 對(duì)接接序列進(jìn)行Blast分析，并通過Fgenesh軟件 (http://linux1.softberry.com/berry.phtml) 進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，確保基因序列的準(zhǔn)確性。

利用Primer 5.0對(duì)電子克隆獲得的序列進(jìn)行特異引物設(shè)計(jì)(上游引物5′-AGTAAGAGGCA AAGATGGAGTT-3′；下游引物5′-AAGCAGC CAGCCGAAGC-3′)，再分別以小麥基因組 DNA和 cDNA 第一條鏈為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物回收純化并連接到 pMD18-T載體，陽性克隆送上海生工生物公司進(jìn)行測(cè)序。最后，將測(cè)序得到的cDNA序列與電子克隆得到的ORF序列比對(duì)，根據(jù)序列相擬度確定擴(kuò)增序列是否為小麥 DHN1基因序列。

1.5 生物信息學(xué)分析

利用ExPASy服務(wù)器(http://www.expasy.org/resource)中的ProtParam和ProtScale軟件預(yù)測(cè)蛋白的理化性質(zhì)；通過DNAMAN V7和MEGA 5.0軟件進(jìn)行氨基酸的多序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建；利用Psort在線軟件(http://psort.hgc.jp/form.html)對(duì)WDHN1-2蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；通過Phyre 2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre2/html/page.cgi?id=index)同源建模軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)；通過ProtFun軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/)分析WDHN1-2蛋白的功能；通過PLEXdb基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.plexdb.org/index.php) Blast搜索 WDHN1-2基因所對(duì)應(yīng)的探針，獲得探針的表達(dá)量信息，并通過芯片數(shù)據(jù)在線分析軟件鑒定小麥 WDHN1-2基因在發(fā)育過程中于不同器官中的表達(dá)模式。

1.6 WDHN1-2基因的半定量RT-PCR分析

以不同脅迫處理的小麥葉片cDNA為模板，以小麥18s rRNA基因作為內(nèi)參(上游引物： 5′-CAGCACCGCCAGTGAATAG-3′；下游引物：5′-TGTAGGTGGCAAAGGTCTC-3′)，通過TaKaRa公司的rTaq聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì) WDHN1-2基因進(jìn)行半定量RT-PCR分析。 WDHN1-2半定量 RT-PCR引物與基因擴(kuò)增引物一致。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥 WDHN1-2基因的克隆結(jié)果

通過傘穗山羊草脫水素 DHN1基因在NCBI中Blast得到20條相似度較高的小麥EST序列，利用DNAMAN軟件將這些序列拼接，得到長(zhǎng)為1 151 bp的conting。ORF Finder預(yù)測(cè)可知，該Conting存在長(zhǎng)為459 bp的ORF序列，初步明確該基因序列為小麥 DHN1基因。在小麥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)可能的新基因進(jìn)行Blsat分析，并通過Fgenesh軟件進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，獲得準(zhǔn)確的基因序列。再以小麥cDNA第一條鏈和基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到1條約500 bp和 550 bp的條帶(圖1)，測(cè)序結(jié)果表明， WDHN1-2基因的cDNA 全長(zhǎng)465 bp，DNA全長(zhǎng)548 bp。將測(cè)序得到的cDNA序列與電子克隆得到的ORF序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)序列相似度為100%，說明擴(kuò)增得到的序列為小麥 DHN1基因序列，故命名為 WDHN1-2基因。 WDHN1-2基因編碼區(qū)序列(CDS)總長(zhǎng)548 bp，含2個(gè)外顯子(1～189 bp,273～548 bp)和1個(gè)內(nèi)含子(190～272 bp)，編碼154個(gè)氨基酸殘基(圖2)。

2.2 WDHN1-2蛋白的生物信息學(xué)分析

2.2.1 WDHN1-2蛋白的理化性質(zhì)

WDHN1-2蛋白分子式為C649H1033N213O220S7，分子量為15 564.00 kDa，理論等電點(diǎn)( pI )為9.52。脂肪族氨基酸指數(shù)為31.17，不穩(wěn)定系數(shù)為25.34，為穩(wěn)定蛋白。親水性氨基酸(甘氨酸和賴氨酸)含量較高，缺乏疏水性氨基酸(色氨酸和半胱氨酸)，總平均親水性值 (GRAVY) 為-1.026，為高度親水性蛋白(圖3、圖4)。

2.2.2 WDHN1-2蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)WDHN1-2蛋白的氨基酸序列進(jìn)行BlastP分析，并通過DNAMAN軟件對(duì)其進(jìn)行多重序列比對(duì)，結(jié)果表明，WDHN1與EMT25371 (山羊草，Aegilopstauschii)、CAJ56059 (圓錐小麥，Triticumturgidum)、AAF01697 (大麥，Hordeumvulgare)、ABO14410 (大麥，Hordeumvulgare)、EMS59889 (烏拉爾圖小麥，Triticumurartu)、CAJ56055 (傘穗山羊草，Aegilopsumbellulata)和EMS58299 (烏拉爾圖小麥，Triticumurartu) 的相似性分別為98.70%、96.64%、95.21%、94.52%、91.89%和96.00%，主要存在4個(gè)保守區(qū)域，即1個(gè)Y片段、1個(gè)S片段和2個(gè)K片段(圖2、圖5)。根據(jù)序列比對(duì)結(jié)果，利用MEGA 5.0對(duì)親緣遠(yuǎn)近不同的脫水素序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析(圖6)，結(jié)果表明，小麥WDHN1蛋白與山羊草EMT25371脫水素的親緣關(guān)系最近。

M: DL2000 marker; 1: cDNA; 2: DNA

2.2.3 WDHN1-2蛋白的二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)

WDHN1-2蛋白由3種二級(jí)結(jié)構(gòu)組成，其中α-螺旋、β-折疊及無規(guī)則卷曲分別占18%、3%和82%，即α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)，且α-螺旋的位置主要位于蛋白的K片段保守區(qū)域(圖7)，這與三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果(WDHN1-2蛋白含有2 個(gè)以K片段為核心的α-螺旋，其余序列為無規(guī)則卷曲)(圖8)相吻合。

圖2 WDHN1-2基因核酸序列及所編碼蛋白的氨基酸序列分析

圖3 WDHN1-2蛋白的氨基酸組成及含量分析

圖4 WDHN1-2蛋白的氨基酸序列親/疏水性預(yù)測(cè)

2.2.4 WDHN1-2蛋白的亞細(xì)胞定位及功能分析

蛋白在特定亞細(xì)胞位置才能行使其相應(yīng)的功能，因此蛋白功能與其亞細(xì)胞定位緊密相關(guān)，蛋白的亞細(xì)胞定位也從一定程度反映了蛋白的功能。通過Psort軟件對(duì)WDHN1-2進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，該蛋白亞細(xì)胞定位的可能性：過氧化物酶體(0.635)> 細(xì)胞核(0.300)> 線粒體基質(zhì)(0.100)。通過ProtFun軟件對(duì)WDHN1-2的功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果(表1)表明，WDHN1-2蛋白主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、生長(zhǎng)因子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能，推測(cè)WDHN1-2蛋白可能為轉(zhuǎn)錄因子。

2.2.5 不同器官中 WDHN1-2基因的表達(dá)情況

通過PLEXdb基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)Blast搜索 WDHN1-2 基因所對(duì)應(yīng)的探針TaAffx.46097.1.S1_at，并在基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù) (GEO accession:GSE12508)[19]中獲得探針的表達(dá)量。結(jié)果(圖9)表明， WDHN1-2 基因分別在小麥種子萌發(fā)期的根、幼苗期的葉、開花之前的雌蕊、開花后22 d的胚芽等器官中表達(dá)量均較高，其中，開花后22 d的胚芽中基因表達(dá)量最高。

2.3 逆境脅迫下葉片中 WDHN1-2基因的半定量RT-PCR分析結(jié)果

采用半定量RT-PCR對(duì) WDHN1-2基因在非生物脅迫下于小麥葉片中的表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果(圖10)表明，在 ABA、PEG、NaCl及4 ℃脅迫下 WDHN1-2基因表達(dá)量均先上升后下降。ABA、PEG和NaCl脅迫下，其表達(dá)量在24 h達(dá)到最高；低溫脅迫下，12 h表達(dá)量達(dá)到最高。

圖5 WDHN1-2蛋白與其他植物脫水素氨基酸序列的多重序列比對(duì)結(jié)果

圖6 WDHN1-2蛋白與其他植物脫水素蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

波浪線：α-螺旋；箭頭：β-折疊；問號(hào)：無規(guī)則卷曲。

Wavy line: Alpha helix; Arrow: Beta strand; Interrogation mark: Random coil.

圖7 WDHN1-2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

Fig.7 Predicted secondary structure of WDHN1-2 protein

圖8 WDHN1-2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

表1 WDHN1-2蛋白的主要功能預(yù)測(cè)

圖9 基因芯片分析不同器官中 WDHN1-2基因表達(dá)模式

3 討 論

電子克隆是依托于生物信息學(xué)克隆基因的一種技術(shù)，隨著基因組計(jì)劃和 EST 計(jì)劃的實(shí)施而逐漸興起，它具有投入低、速度快、針對(duì)性強(qiáng)和技術(shù)要求低等優(yōu)點(diǎn)[17]。但由于某些基因剪切方式的多樣性及生物大分子結(jié)構(gòu)和功能的復(fù)雜性，分析軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果通常存在較大偏差，因此通過電子克隆獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果只能作為參考，必須進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證。

圖10 不同非生物脅迫下 WDHN1-2基因的表達(dá)模式

WDHN1-2蛋白分子量為15.56 kDa，其氨基酸序列中親水性氨基酸(甘氨酸和賴氨酸)含量最高，缺乏疏水性氨基酸(色氨酸和半胱氨酸)，總平均親水性值 (GRAVY) 為-1.026，表明WDHN1-2蛋白為高度親水蛋白。序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，WDHN1-2蛋白具有和脫水素家族一致的高度保守區(qū)域 (K、Y 和S 片段)，其中K片段保守域還可以形成兩親性的α-螺旋，并且與山羊草 EMT25371脫水素的親緣關(guān)系最近，由此推斷WDHN1-2蛋白與山羊草EMT25371脫水素具有相似的生物功能。以上特征均表明 WDHN1-2屬于YSK2型脫水素。

脫水素能夠在植物胚胎發(fā)育晚期以及逆境脅迫(如低溫、干旱和高鹽等)下大量表達(dá)。 WDHN1-2基因在ABA、PEG、NaCl及4 ℃表達(dá)量均上升。通過功能預(yù)測(cè)推斷，WDHN1-2蛋白可能行使轉(zhuǎn)錄調(diào)控的功能，調(diào)控下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及逆境響應(yīng)基因的表達(dá)，從而提高植物逆境脅迫下的耐受性[20]；同時(shí)，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明， WDHN1-2基因存在于細(xì)胞核的可能性較大，為此推論提供了間接的證據(jù)。部分YSK2型脫水素已被證明定位在細(xì)胞核，行使轉(zhuǎn)錄調(diào)控的功能，如RAB 15等[21]，但是具體的調(diào)控機(jī)制仍然不清楚。

基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)是目前最大的且完全開放的高通量分子豐度數(shù)據(jù)庫(kù)，主要存儲(chǔ)基因表達(dá)數(shù)據(jù)[22-23]。通過該數(shù)據(jù)庫(kù)Blast搜索 WDHN1-2基因發(fā)育過程中的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn) WDHN1-2基因在小麥開花后22 d的胚芽中表達(dá)量最高，這與脫水素胚胎發(fā)育晚期大量表達(dá)一致。

本研究對(duì)小麥脫水素基因 WDHN1-2的克隆及生物功能的挖掘，為進(jìn)一步提高小麥逆境耐受性及分子育種提供了新的線索和基礎(chǔ)。

[1]KOSOVA K,VITAMVAS P,PRASIL I T.Wheat and barley dehydrins under cold,drought,and salinity-what can LEA-II proteins tell us about plant stress response? [J].FrontiersinPlantScience,2014,5:343.

[2]LABHILILI M,JOUDRIER P,GAUTIER M F.Characterization of cDNAs encodingTriticumdurumdehydrins and their expression patterns in cultivars that differ in drought tolerance [J].PlantScience,1995,112(2):219.

[3]KIM E C,LEE H S,CHOI D W.Sequence variability and expression pattern of the dehydrin gene family inPopulustremula×Populusalbavar.glandulosa[J].PlantOmics,2012,5(2):122.

[4]BATTAGLIA M,OLVERA-CARRILLO Y,GARCIARRUBIO A,etal.The enigmatic LEA proteins and other hydrophilins [J].PlantPhysiology,2008,148(1):6.

[5]ALLAGULOVA CH R,GIMALOV F R,SHAKIROVA F M,etal.The plant dehydrins: structure and putative functions [J].BiochemistryBiokhimiia,2003,68(9):945.

[6]BAE E K,LEE H,LEE J S,etal.Differential expression of a poplar SK2-type dehydrin gene in response to various stresses [J].BMBReports,2009,42(7):439.

[7]BRINI F,YAMAMOTO A,JLAIEL L,etal.Pleiotropic effects of the wheat dehydrin DHN-5 on stress responses inArabidopsis[J].Plant&CellPhysiology,2011,52(4):676.

[8]CLOSE T J.Dehydrins: A commonalty in the response of plants to dehydration and low temperature [J].PhysiologiaPlantarum,1997,100:291.

[9]KOAG M C,WILKENS S,FENTON R D,etal.The K-segment of maize DHN1 mediates binding to anionic phospholipid vesicles and concomitant structural changes [J].PlantPhysiology,2009,150(3):1503.

[10]RAHMAN L N,MCKAY F,GIULIANI M,etal.Interactions ofThellungiellasalsugineadehydrins TsDHN-1 and TsDHN-2 with membranes at cold and ambient temperatures-surface morphology and single-molecule force measurements show phase separation,and reveal tertiary and quaternary associations [J].Bba-biomembranes,2013,1828(3):967.

[11]DRIRA M,SAIBI W,BRINI F,etal.The K-segments of the wheat dehydrin DHN-5 are essential for the protection of lactate dehydrogenase and beta-glucosidase activitiesinvitro[J].MolecularBiotechnology,2013,54(2):643.

[12]CLOSE T J.Dehydrins: Emergence of a biochemical role of a family of plant dehydration proteins [J].PhysiologyPlantarum,1996,97(4):795.

[13]ALSHEIKH M K,SVENSSON J T,RANDALL S K.Phosphorylation regulated ion-binding is a property shared by the acidic subclass dehydrins [J].Plant,Cell&Environment,2005,28(9):1114.

[14]RIERA M,PHILLIPS R L.Protein kinase CK2 modulates developmental functions of the abscisic acid responsive protein Rab17 from maize [J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2004,101(26):9879.

[15]胡 皝,蕭浪濤.生物信息學(xué)在新基因全長(zhǎng)cDNA電子克隆中的應(yīng)用[J].生物技術(shù)通報(bào),2007(4):93.

HU H,XIAO L T.Application of bioinformatics in full-length cDNA sequence in silicon cloning of novel genes [J].BiotechnologyBulletin,2007(4):93.

[16]黃 驥,張紅生,曹雅君,等.水稻功能基因的電子克隆策略 [J].中國(guó)水稻科學(xué),2002,16(4):295.

HUANG J,ZHANG H S,CAO Y J,etal.Strategy of in silico cloning of functional genes in rice (Oryzasativa) [J].ChineseJournalofRiceScience,2002,16(4):295.

[17]王冬冬,朱延明,李 勇,等.電子克隆技術(shù)及其在植物基因工程中的應(yīng)用[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,37(3):403.

WANG D D,ZHU Y M,LI Y,etal.Application of in silico cloning technique in plant gene engineering [J].JournalofNortheastAgriculturalUniversity,2006,37(3):403.

[18]KYTE J,DOOLITTLE R F.A simple method for displaying the hydropathic character of a protein [J].JournalofMolecularBiology,1982,157(1):105.

[19]SCHREIBER A W,SUTTON T,CALDO R A,etal.Comparative transcriptomics in the Triticeae [J].BMCGenomics,2009,10:285.

[20]HIRAYAMA T,SHINOZAKI K.Research on plant abiotic stress responses in the post-genome era: past,present and future [J].PlantJournal,2010,61(6):1041.

[21]THI V H P,HARTOMO T B,LEE M J,etal.Rab15 alternative splicing is altered in spheres of neuroblastoma cells [J].OncologyReports,2012,27(6):2045.

[22]余海浪,馬文麗,鄭文嶺.用于基因數(shù)據(jù)挖掘的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)GEO[J].中國(guó)生物工程雜志,2007,27(8):96.

YU H L,MA W L,ZHENG W L.Data mining procedures using GEO (Gene Expression Omnibus) [J].ChinaBiotechnology,2007,27(8):96.

[23]劉 華,馬文麗,鄭文嶺.GEO (Gene Expression Omnibus):高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2007,23(3):236.

LIU H,MA W L,ZHENG W L.GEO (Gene Expression Omnibus):High-throughput gene expression database [J].ChineseJournalofBiochemistryandMolecularBiology,2007,23(3):236.

Cloning and Expression Analysis of Dehydrin Gene WDHN1-2 in Wheat

LIU Hao1,ZHU Weining2,ZHANG Dapeng1,ZHANG Linsheng1

(1.College of Life Science,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China;2.College of Life Science,Northwest University,Xi’an,Shaanxi 710069,China)

To investigate the function of WDHN1-2 gene in wheat, WDHN1-2 was cloned from wheat in silico and analyzed by bioinformatics using DHN1 gene ofAegilopsumbellulataas the probe. The CDS of WDHN1-2 gene was 548 bp,and the transcript levels of WDHN1-2 reached the highest level at 22 DAP in embryo. Semi-quantitative RT-PCR analysis indicated that transcript accumulation was first increased and then decreased under low temperature,sodium chloride (NaCl),abscisic acid (ABA) and polyethylene glycol (PEG) treatments.WDHN1-2 protein belonged to hydrophilic protein,which had typical features of DHNs that contains one Y segment,one S segment and two K segments. The secondary structure of this protein was mainly composed of alpha helix and random coil. This protein was likely to be located in the peroxisome,nucleus,and mitochondrial matrix,may play a function of transcriptional regulation.

TriticumaestivumL.;Insilicocloning; Dehydrin; Bioinformatics analysis; Semi-quantitative RT-PCR

時(shí)間：2016-10-08

2016-04-09

2016-05-21

旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助課題(CSBA2015007)；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目(20120204110033)

E-mail：504885033@qq.com

張林生(E-mail:linszhang@nwsuaf.edu.cn)

S512.1；S332.2

A

1009-1041(2016)10-1291-08

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20161008.0932.006.html