張?zhí)戽?楊慧杰，2?,孫世峰

(1.遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心,遼寧 沈陽 110000; 2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,遼寧 沈陽 110866; 3.遼寧省沈陽市動物衛(wèi)生監(jiān)督所,遼寧 沈陽 110000)

飼料中4種四環(huán)素類藥物的檢測
——高效液相色譜法

張?zhí)戽?,楊慧杰1，2?,孫世峰3

(1.遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心,遼寧 沈陽 110000; 2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,遼寧 沈陽 110866; 3.遼寧省沈陽市動物衛(wèi)生監(jiān)督所,遼寧 沈陽 110000)

本研究建立了高效液相色譜法同時測定飼料中土霉素、金霉素、四環(huán)素、強力霉素4種四環(huán)素類藥物。結(jié)果顯示,4種藥物在1～100 g/m L范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)均達到0.999以上;土霉素和四環(huán)素的檢出限為0.25 g/g,金霉素和強力霉素的檢出限為0.5 g/g;土霉素和四環(huán)素的定量限為2 g/g,金霉素和強力霉素的定量限為4 g/g;回收率達到74.1%～98.8%。本方法適用于濃縮飼料、配合飼料、預(yù)混合飼料中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強力霉素4種四環(huán)素類抗生素的檢測。

高效液相色譜法;土霉素;金霉素;四環(huán)素;強力霉素

四環(huán)素類抗生素是一類廣譜抗生素,對革蘭氏陽性菌和陰性菌都有很好的抑制作用,因此在養(yǎng)的應(yīng)用,經(jīng)常以亞治療劑量添加于動物飼料中,用于預(yù)防動物疾病和促生長。長期的使用導(dǎo)致動物食品中該類藥物的殘留富集,不僅會有耐藥菌株的出現(xiàn)［1],降低該藥物的治療效果,四環(huán)素還會與骨骼中的鈣結(jié)合,抑制牙齒和骨骼的發(fā)育,引起人的蕁麻疹等［2]。由此可見畜產(chǎn)品質(zhì)量安全直接關(guān)系到人類的健康,而控制畜產(chǎn)品質(zhì)量需從源頭把關(guān),特別是嚴(yán)把飼料質(zhì)量關(guān)。

目前,已報道的四環(huán)素類藥物檢測方法主要有微生物法、薄層色譜法、酶聯(lián)免疫法、分光光度計法、熒光法和色譜法［3-5],色譜法具有靈敏度高、快速等特點,已經(jīng)被我國2000年版藥典采用［6]。本研究以四環(huán)素類抗生素為研究對象,采用高效液相色譜法,建立了一種高效、簡便、快速、靈敏的測定飼料中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強力霉素的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備美國Waters公司2695型高效液相色譜儀(配紫外檢測器);高速冷凍離心機(美國賽默飛世爾科技公司生產(chǎn));O asisRHLB固相萃取小柱(美國沃特世公司生產(chǎn));圣德利純水系統(tǒng)(重慶市澳凱龍醫(yī)療器械研究有限公司);氮吹儀(N-EVAP型,美國Organomation公司生產(chǎn))。

1.2 試劑和材料土霉素對照品、四環(huán)素對照品、鹽酸金霉素對照品(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所),強力霉素對照品(Dr.Ehrenstor fer公司),色譜純甲醇(Fisher公司),色譜純乙腈(Fisher公司),三氯乙酸(國藥集團化學(xué)試劑有限公司),試驗用水均為超純水。

1.3 方法

1.3.1 對照品的配制標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制:稱量土霉素、鹽酸金霉素、鹽酸四環(huán)素和強力霉素的對照品各約25 m g(精確至0.000 01 g),分別置于25 m L棕色容量瓶中,用甲醇稀釋成濃度均約為1 m g/m L的溶液,作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

標(biāo)準(zhǔn)工作液配制:量取標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量,用甲醇稀釋成含土霉素、鹽酸金霉素、鹽酸四環(huán)素和強力霉素濃度為10～20μg/m L的標(biāo)準(zhǔn)工作液?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 樣品處理和提取稱取5.0 g樣品(精確至0.000 1 g),至于具塞錐形瓶中,加入50 mL MCI-Vaine-Na2EDTA緩沖液,5 mL 20%三氯乙酸溶液,震蕩提取30 min,10000 r/min離心5 min,取5 m L上清液過經(jīng)3 mL甲醇,3 mL水潤洗的HLB固相萃取小柱。固相萃取小柱經(jīng)3 mL水,3 mL 5%甲醇淋洗后,用3 mL甲醇洗脫,洗脫液經(jīng)60℃氮氣吹干后,用1.0 mL流動相復(fù)溶,復(fù)溶液渦旋后過0.22μm濾膜,上機測定。

1.3.3 色譜條件色譜柱:XBridgeTMC18 150 mm× 1.6 mm,粒徑5μm;檢測器:紫外檢測器,檢測波長360 nm;柱溫:30℃;流動相組成及比例為草酸(0.01 mol/L):甲醇:乙腈=75:12.5:12.5;流動相速度:1.0 mL/min;進樣量:10～20μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相的確定

2.1.1 流動相試劑的確定本試驗嘗試采用乙腈-水作為系統(tǒng)流動相,結(jié)果樣品峰型嚴(yán)重拖尾,分離度及對稱度均不理想。相關(guān)文獻記載［7]四環(huán)素類化合物多以陽離子的形式存在,可以和草酸根結(jié)合形成離子對,改善峰型,且峰型的改善程度與草酸溶液的濃度相關(guān)。本試驗經(jīng)過驗證,采用草酸-甲醇-乙腈作為系統(tǒng)流動相,色譜峰分離好且峰型標(biāo)準(zhǔn),草酸溶液濃度確定為0.01 mol/L。

2.1.2 流動相pH的選擇試驗表明流動相的p H變化對4種抗生素的分離度、對稱性和柱效都有不同程度的影響。試驗分別考察了流動相p H為1.75、2.0、3.0、4.0時色譜的系統(tǒng)適用性情況,結(jié)果表明流動相p H為2.0時,柱效、色譜峰分離度、峰型的對稱性都最佳,因此流動相的p H確定為2.0。

2.1.3 流動相比例的選擇流動相中有機相與水相的比例直接影響目標(biāo)物質(zhì)的出峰時間,一定范圍內(nèi),有機相比例越高,出峰時間越早。對于本試驗而言,結(jié)合四環(huán)素類抗生素的性質(zhì),經(jīng)過多次試驗選擇了流動相的比例為草酸(0.01 mol/L):甲醇:乙腈=75:12.5:12.5等度洗脫。

2.2 樣品前處理條件的優(yōu)化飼料樣品組成成分多、基質(zhì)復(fù)雜,其中又常含有大分子蛋白和金屬離子,為了保證結(jié)果的準(zhǔn)確性,在檢測時,首先要先將大分子量蛋白及飼料中常添加的金屬離子除去。常用的提純試劑有鹽酸、磷酸鹽、三氯乙酸、MCI-Vaine-Na2EDTA等［8-9],本試驗建立的高效液相色譜法測定飼料中的土霉素、金霉素、四環(huán)素、強力霉素的含量時,選用的提純試劑是MCI-Vaine-Na2EDTA緩沖液加三氯乙酸溶液,因為相同條件下,這兩種試劑的組合提取效果最好。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性考察取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進行測定,色譜圖見圖1,4種抗生素分離度良好,彼此無干擾。將6份空白飼料樣品5.0 g,按1.3.2操作,色譜圖見圖2,空白基質(zhì)無干擾。將一定體積的4種抗生素對照品溶液加入空白飼料樣品中,按1.3.2操作,色譜圖見圖3,空白飼料對4種抗生素?zé)o干擾,專屬性良好。

2.3.2 方法的線性范圍配置標(biāo)準(zhǔn)曲線,濃度分別為1、5、10、20、50、100μg/mL,每個濃度點制備2個平行試驗,用平均值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以待測物濃度為橫坐標(biāo)(X,μg/mL),待測物峰面積比值為縱坐標(biāo)(Y),進行回歸運算,求得直線回歸方程。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程見表1。由表1可見,在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi),各因子的響應(yīng)值與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。

圖1 土霉素(1)、四環(huán)素(2)、金霉素(3)、強力霉素(4)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.1 The mixed standard solution chromatogram of oxytetracycline，tetracycline，chlortetracycline and doxycycline

圖2 空白飼料樣品色譜圖Fig.2 Blank chromatogram of the feed

圖3 飼料樣品添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.3 The mixed standard solution chromatogram of adding feed sample

2.3.3 檢測限的確定以相當(dāng)于基線3倍信號(S/N≥3)相應(yīng)的濃度為檢測限,當(dāng)飼料中添加0.25μg/g土霉素和四環(huán)素,0.5μg/g金霉素和強力霉素時,信/噪(S/N)比均大于3,因此本方法土霉素和四環(huán)素檢測限為0.25μg/g,金霉素和強力霉素檢測限為0.5μg/g。

表1 HPLC法測定飼料中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強力霉素標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table1 The regression equation and correlation coefficient o f standard curve of oxytetracycline，tetracycline，chlortetracycline and doxycycline in feed determined by HPLC

表2 方法的回收率及精密度(n=6)Table2 Recovery and precision of the method

2.3.4 定量限的確定以相當(dāng)于基線10倍信號(S/ N≥10)相應(yīng)的濃度為檢測定量限,當(dāng)飼料中添加2μg/g土霉素和四環(huán)素,4μg/g金霉素和強力霉素時,信/噪(S/N)比均大于10,因此本方法的土霉素和四環(huán)素定量限為2μg/g,金霉素和強力霉素定量限為4μg/g。

2.3.5 方法回收率及精密度采用標(biāo)準(zhǔn)添加法,分別向空白飼料樣品中添加低、中、高3種不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液(添加濃度分別為20.0、50.0和100.0μg/m L),每一濃度制備6份樣品分析,平均回收率在76.2%～96.8%之間,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均＜5%,計算結(jié)果見表2。統(tǒng)計結(jié)果表明此方法穩(wěn)定性強,重現(xiàn)性好,能夠滿足配合飼料和濃縮飼料產(chǎn)品中土霉素、金霉素、四環(huán)素、強力霉素含量的測定。

3 結(jié)論

3.1 1 本試驗建立了應(yīng)用高效液相色譜法測定飼料中土霉素、金霉素、四環(huán)素、強力霉素4種四環(huán)素類抗生素的聯(lián)檢方法。應(yīng)用該方法測定,4種藥物在1～100μg/m L范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)均達到0.999以上;土霉素和四環(huán)素的檢出限為0.25μg/g,金霉素和強力霉素的檢出限為0.5μg/g;土霉素和四環(huán)素的定量限為2μg/g,金霉素和強力霉素的定量限為4μg/g;回收率達到74.1%～98.8%。

3.2 該方法適用于濃縮飼料、配合飼料、預(yù)混合飼料中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強力霉素4種四環(huán)素類抗生素的檢測,操作簡單,實用性強,為保障我國飼料質(zhì)量安全進而保障食品安全提供了重要的技術(shù)支撐。

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Simultaneous determination of 4 kinds of tetracycline in feed by high performance liquid chromatography

Zhang Tianshu1,Yang Hui jie1.2*,Sun Shifeng3
(1.Animal feed quality and safety of venterinary testing centre in Liaoning province,Liaoning Shenyang 110016; 2.College of Animal Science and Veterinary of shenyang Agricultural University,Liaoning Shenyang 110866; 3.Shenyang Animal Health Inspection Institute,Liaoning Shenyang 110000)

A HPLC method to Simultaneous Determination of oxytetracyline,etracycline,chlortetracycline,doxycycline in Feed stuff was established.The results showed that the calibration curves of 4 tetracyclinesexhibited good l inearity in th erange 1～100μg/mL with correlation coefficients greater than 0.999.The oxytetracyline and chlortetracycline detection limit was 0.25 μg/g.The etracycline and doxytetracyline detection limit was 0.5μg/g.The oxytetracyline and chlortetracycline limit of quantitation was 2μg/g.The etracycline and doxytetracyline limit of quantitation was 4μg/g.The average recovery rate reached 74.1%～98.8%.The method is applicable for detecting the content of oxytetracycline,tetracycline,chlortetracycline and doxycycline in the combinative feed,concentrated feed and premixed feed.

High Performance Liquid Chromatography;Oxytetracycline;Chlorotetracycline;Tetracycline;Doxycycline殖業(yè)中被廣泛用作飼料添加劑。近年來隨著養(yǎng)殖業(yè)的不斷集約化,四環(huán)素類抗生素得到了更廣泛

S859.84

B

1672-9692(2016)10-0016-05

2016-09-08

張?zhí)戽?1985-),女,碩士,主要從事飼料檢驗工作。

楊慧杰(1986-),女,本科,主要從事飼料檢驗工作。