張 芳，唐 密，王建輝

(湖南省婦幼保健院，湖南 長(zhǎng)沙 410008)

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Skp2和PTEN在上皮性卵巢腫瘤組織中的表達(dá)及臨床意義

張 芳，唐 密，王建輝

(湖南省婦幼保健院，湖南 長(zhǎng)沙 410008)

目的 研究S期激酶相關(guān)蛋白2(Skp2)和PTEN蛋白在上皮性卵巢腫瘤組織中表達(dá)，探討其臨床病理學(xué)意義及在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用。方法 收集129例上皮性卵巢腫瘤石蠟標(biāo)本(良性35例、交界性32例、惡性62例)，免疫組化法檢測(cè)Skp2 及PTEN蛋白的表達(dá)水平，分析兩者表達(dá)、臨床病理參數(shù)關(guān)系及其相互關(guān)系。結(jié)果 ①Skp2在良性及交界性腫瘤中表達(dá)陰性，分別為(0/35，0/32)，在卵巢癌中陽性率40.32%(25/62)，其在卵巢癌表達(dá)水平明顯高于良性和交界性腫瘤(χ2值分別為8.25、6.72，均P<0.05)；②PTEN蛋白在良性及交界性腫瘤陽性率分別為82.86%(29/35)、59.38%(19/32)，在卵巢癌陽性率40.32%(25/62)，明顯低于良性和交界性腫瘤(χ2值分別為11.15、9.23，均P<0.05)；③Skp2、PTEN蛋白在卵巢癌的表達(dá)在不同年齡、是否絕經(jīng)及不同組織學(xué)類型中無顯著性差異(χ2值分別為1.01、0.04、0.21，P>0.05)。Skp2在卵巢癌Ⅲ～Ⅳ期、中低分化組及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組表達(dá)明顯高于Ⅰ～Ⅱ期、高分化組及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(χ2值分別為10.05、11.21、8.54，均P<0.05)，PTEN在卵巢癌Ⅲ～Ⅳ期、中低分化組及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組表達(dá)低于Ⅰ～Ⅱ期、高分化組及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(χ2值分別為8.23、12.15、7.65，均P<0.05)；④Skp2和PTEN蛋白在卵巢癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.321，P<0.05)。結(jié)論 Skp2表達(dá)上調(diào)與PTEN下調(diào)可能在上皮性卵巢腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。檢測(cè)Skp2和PTEN表達(dá)水平可能對(duì)卵巢癌預(yù)后分析有一定指導(dǎo)意義。

S期激酶相關(guān)蛋白2；PTEN蛋白；上皮性卵巢癌組織；免疫組化

卵巢惡性腫瘤是女性生殖器官最常見腫瘤之一，由于病因不明，缺乏早期癥狀及特異性腫瘤標(biāo)志物，故難以早發(fā)現(xiàn)、早治療，死亡率一直高居?jì)D科惡性腫瘤之首。近年隨著腫瘤分子遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)基因變異、蛋白表達(dá)異常是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化方法研究S期激酶相關(guān)蛋白2(s.phaseklnase-associatedprotein-2，Skp2)和PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosometen，PTEN)蛋白在卵巢上皮性腫瘤(良性、交界性、惡性)的表達(dá)，分析其表達(dá)水平與卵巢癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，探討兩者在上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用及相互間關(guān)系。

1材料與方法

1.1臨床資料

選取湖南省婦幼保健院2008年1月至2013年9月上皮性卵巢腫瘤標(biāo)本存檔蠟塊129例，患者年齡21～71歲，中位年齡54歲，術(shù)前未行化療、放療，術(shù)后經(jīng)病理確診。其中良性腫瘤35例(漿液性囊腺瘤21例，粘液性囊腺瘤14例)，交界性腫瘤32例(交界性漿液性囊腺瘤23例，交界性粘液性囊腺瘤9例)，上皮性卵巢癌62例。按國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(international fedration of gynecology and obstetrics，F(xiàn)IGO)分期世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)分化標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期9例，Ⅱ期10例，Ⅲ期36例，Ⅳ期7例，其中漿液性囊腺癌39例(G1：19例，G2：16例，G3或G 4： 4例)，粘液性囊腺癌10例(G1：4例，G2：4例，G3或G 4：2例)，子宮內(nèi)膜樣癌7例(G1：2例，G2：3例，G3或G 4： 2例)， 透明細(xì)胞癌6例(G1：2例，G2：3例，G3或G 4：1例)，常規(guī)固定、包埋，行蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)和免疫組織化學(xué)染色。

1.2主要試劑

一抗Skp2鼠抗人單克隆抗體(濃度為1：50)購自美國Zymed公司， PTEN鼠抗人單克隆抗體(濃度為1：100)、DAB顯色液購自上海瑞奇生物科技有限公司。

1.3方法

采用S-P 免疫組化，操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。陰性對(duì)照以PBS代替一抗作空白對(duì)照，陽性對(duì)照用己知陽性片為對(duì)照。判斷標(biāo)準(zhǔn)為Skp2和PTEN均以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色或黃褐色顆粒為陽性。病變處隨機(jī)選取至少5；(+)：陽性細(xì)胞數(shù)5%～49%；(++)：陽性細(xì)胞數(shù)≥50%，由兩位有經(jīng)驗(yàn)病理醫(yī)師雙盲法進(jìn)行評(píng)估。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。率的比較采用χ2檢驗(yàn)和Fisher精確概率法，相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1S期激酶相關(guān)蛋白2、PTEN蛋白在良性、交界性、上皮性卵巢癌組織中表達(dá)

Skp2在良性及交界性腫瘤中表達(dá)陰性，在卵巢癌中陽性率40.32%(25/62)，表達(dá)水平顯著高于良性(χ2=8.25，P<0.05)和交界性腫瘤(χ2=6.72，P<0.05)。良性、交界性及卵巢癌組中PTEN蛋白陽性表達(dá)率分別為82.86%(29/35)、59.38%(19/32)和40.32%(25/62)?？ǚ綑z驗(yàn)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.626，P=0.00)，見圖1、圖2和表1。

組織類型例數(shù) Skp2 陰性陽性陽性率(%)P PTEN 陰性陽性陽性率(%)P良性3535000.169①62982.860.008①交界性3232000.041②131959.380.029②惡性62372540.30.035③372540.320.041③

注：①表示良性卵巢腫瘤與交界性上皮性卵巢腫瘤比較；②表示交界性上皮性卵巢腫瘤和卵巢上皮性癌比較；③表示卵巢上皮性癌與良性卵巢腫瘤比較。

2.2 S期激酶相關(guān)蛋白2、PTEN蛋白表達(dá)與上皮性卵巢癌臨床病理關(guān)系

Skp2、PTEN在卵巢癌中表達(dá)與患者年齡、是否絕經(jīng)及組織類型無明顯關(guān)系(χ2值分別為1.01、0.04、0.21，均P>0.05)，而與分期、組織分化程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性(χ2值分別為12.05、9.65、7.98，均P<0.05)，Skp2在Ⅲ～Ⅳ期、中低分化組及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性率分別(55.81%，74.29%，68.75%)，明顯高于I～I(xiàn)I期、高分化組及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(21.05%，37.03%，47.73%)(χ2值分別為10.05、11.21、8.54，均P<0.05)。而PTEN則相反，在Ⅲ～Ⅳ期、中低分化組及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性率(39.53%，31.43%，43.75%)明顯低于Ⅰ～Ⅱ期、高分化組及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(68.42%，44.44%，59.09%)(χ2值分別為8.23、12.15、7.65，均P<0.05)，見表2。

表2 Skp2 PTEN蛋白表達(dá)與上皮性卵巢癌臨床病理的關(guān)系(n)

Table 2 Expressions of Skp2 and PTEN and their clinicopathologic relationship with epithelial ovarian cancer(n)

臨床指標(biāo)例數(shù) Skp2 陰性陽性陽性率(%)P PTEN 陰性陽性陽性率(%)P年齡(歲)0.0610.070 ≥5042202252.38231945.24 <502011945.0091155.00是否絕經(jīng)0.0580.052 是44242045.45271738.64 否1810844.4412633.33臨床分期0.0340.039 Ⅰ～Ⅱ期1915421.0561368.42 Ⅲ～Ⅳ期43192455.81261739.53組織學(xué)類型0.0580.062 漿液性囊腺癌39192048.72192048.72 粘液性囊腺癌105550.006440.00 子宮內(nèi)膜樣癌74342.863457.14 透明細(xì)胞癌64233.333350.00組織分化0.0260.036 高分化27171037.03151244.44 中低分化3592674.29241131.43淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.0380.029 無44232147.73182659.09 有1651168.759743.75

2.3 S期激酶相關(guān)蛋白2、PTEN蛋白表達(dá)在卵巢上皮性癌中的相關(guān)性

對(duì)62例卵巢上皮性癌中Skp2和PTEN的表達(dá)率進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果顯示Skp2與PTEN的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.321，P<0.05)。

3討論

隨著分子生物學(xué)、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的深入研究，認(rèn)為腫瘤發(fā)生均為細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制紊亂，細(xì)胞惡性克隆。本研究通過免疫組化方法，檢測(cè)卵巢上皮性腫瘤的Skp2和PTEN蛋白表達(dá)，分析兩者與臨床病理因素間關(guān)系及表達(dá)相關(guān)性，探討其在卵巢癌發(fā)生進(jìn)展過程中的作用。

3.1 S期激酶相關(guān)蛋白2在卵巢上皮性癌中的表達(dá)及意義

F-box蛋白Skp2由zhang等1995年首次克隆，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)注射P45抗體或反義寡核酸能阻斷P45功能，阻止細(xì)胞進(jìn)入S期，因其可與細(xì)胞周期蛋白CyclinA相互作用，從而被命名為Skp2。Skp2基因定位于人5號(hào)染色體短臂上，由436個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。

細(xì)胞周期指細(xì)胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程，分為五期：即G0期(靜息期)，G1(DNA合成前期)，S(DNA合成期)，G2(DNA合成后期)，M(有絲分裂期)?？刂萍?xì)胞分裂過程主要有兩個(gè)限制點(diǎn)，即G1/S點(diǎn)(控制細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，)和G2/M點(diǎn)(細(xì)胞一分為二的控制點(diǎn))。Skp2正常表達(dá)時(shí)，細(xì)胞在分裂時(shí)的G1/S期CKI-P27kipl泛素化降解過程可正常進(jìn)行[1-2]。但若Skp2蛋白過度表達(dá)，則細(xì)胞無限制通過G1/S期“限制點(diǎn)”，導(dǎo)致細(xì)胞無限制分裂， 最終形成惡性克隆。因此，Skp2過度表達(dá)與癌發(fā)生密切相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示在卵巢良性、交界性腫瘤組中，Skp2表達(dá)均為陰性，而在惡性組中卻有不同程度的表達(dá)(25/62)，兩者比較有顯著差異。其次，Skp2表達(dá)與年齡、組織學(xué)分型無顯著性相關(guān)(P>0.05)，卻與卵巢癌的病理分級(jí)、臨床分期有密切關(guān)系。在不同臨床分期、組織分化及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中，Ⅲ～Ⅳ期、中低分化組及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組明顯高于Ⅰ～Ⅱ期、高分化組及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.05)。提示臨床期別越晚，組織分化越差，Skp2過度表達(dá)，細(xì)胞分裂無限制通過“限制點(diǎn)”，形成惡性增殖，最終促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生與進(jìn)展。

3.2PTEN在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及意義

Li等于1997年研究原發(fā)性乳腺癌第10q23染色體的同源性丟失區(qū)，分離得到一種新的基因，命名為PTEN。PTEN全長(zhǎng)約200kb，含有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子。研究發(fā)現(xiàn)PTEN可使PIP3脫3`磷酸，喪失PIP3第二信使作用，抑制PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路，使細(xì)胞有絲分裂阻滯在Gl期，因此與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展關(guān)系密切[3]。Schondorf等2003年對(duì)20例原發(fā)卵巢癌及復(fù)發(fā)病例進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，PTEN隨卵巢癌病理分級(jí)、臨床分期，表達(dá)水平逐漸下降，提示PTEN表達(dá)與細(xì)胞分化程度密切相關(guān)。Martins等[4]研究也得出同樣結(jié)論。本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定PTEN表達(dá)，發(fā)現(xiàn)正常卵巢組織中陽性表達(dá)率顯著高于癌組織。推測(cè)這種表達(dá)缺失可能是卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)顯示PTEN在Ⅲ～Ⅳ期、中低分化組及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性率(39.53%，31.43%，43.75%)明顯低于I～I(xiàn)I期、高分化組及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(68.42%，44.44%，59.09%)(P<0.05)，考慮與PTEN對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用有關(guān)，說明PTEN基因表達(dá)降低使其抑制細(xì)胞惡性克隆的能力下降，從而促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移卵巢癌組織中PTEN蛋白陽性表達(dá)率顯著降低，顯示PTEN表達(dá)水平下降與腫瘤細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移有關(guān)。

3.3卵巢上皮性癌中S期激酶相關(guān)蛋白2與PTEN蛋白表達(dá)的相關(guān)性

Lotan 等[5]對(duì)108例前列腺癌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)抑癌基因PTEN與Skp2明顯負(fù)相關(guān)，推測(cè)PTEN對(duì)Skp2表達(dá)有負(fù)調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)中卵巢癌Skp2與PTEN表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，研究結(jié)論與上述文獻(xiàn)一致，Skp2表達(dá)越高，則PTEN表達(dá)相應(yīng)降低，推測(cè)卵巢癌Skp2表達(dá)升高與PTEN表達(dá)缺失及突變有關(guān)，可能Skp2過度表達(dá)促進(jìn)了p27的泛素化降解，使p27表達(dá)降低，從而失去對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控，二者共同作用促進(jìn)了卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展。

總之，Skp2高表達(dá)和PTEN的低表達(dá)在卵巢上皮性癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。PTEN和Skp2蛋白聯(lián)合檢測(cè)有助于臨床判斷卵巢癌惡性程度。但Skp2與PTEN的表達(dá)之間是否還存在分子細(xì)胞水平調(diào)控還有待深入研究。近年有學(xué)者提出，可將抑制Skp2、同時(shí)上調(diào)PTEN蛋白表達(dá)作為腫瘤治療的新靶點(diǎn)，但其能否有效用于臨床治療還有待于進(jìn)一步探索、研究。

[1]Chan C H,Morrow J K,Li,C F,etal.Pharmacological inactivation of Skp2 SCF ubiquitin ligase restricts cancer stem cell traits and cancer progression[J].Cell,2013,154(3):556-568.

[2]Nogueira V,Sundararajan D,Kwan J M,etal.Akt-dependent Skp2 mRNA translation is required for exiting contact inhibition,oncogenesis,and adipogenesis[J].EMBO J,2012,31(5):1 134-1 146.

[3]Wu K L,Wu C A,Wu C W,etal.Redox-sensitive oxidation and phosphorylation of PTEN contribute to enhanced activation of PI3K/Akt signaling in rostral ventrolateral medulla and neurogenic hypertension in spontaneously hypertensive rats[J].Antioxid Redox Signal,2013,18(1):36-50.

[4]Martins F C,Santiago Id, Trinh A,etal.Combined image and genomic analysis of high-grade serous ovarian cancer reveals PTEN loss as a common driver event and prognostic classifier[J].Genome Biol,2014,15(12): 526.

[5]Lotan T L, Gurel B, Sutcliffe S,etal.PTEN protein loss by immunostaining: analytic validation and prognostic indicator for a high risk surgical cohort of prostate cancer patients[J].Clin Cancer Res,2011,17(20):6563-6573.

[專業(yè)責(zé)任編輯：張冠軍]

Expressions of Skp2 and PTEN in epithelial ovarian tumors and their clinical significance

ZHANG Fang, TANG Mi, WANG Jian-hui

(Maternal and Child Health Hospital of Hunan Province, Hunan Changsha 410008, China)

Objective To investigate the expressions of Skp2 and PTEN in epithelial ovarian tumors and explore their clinicopathologic significance as well as the role in genesis of tumor. Methods Skp2 and PTEN protein expressions were examined by immunohistochemistry in 129 epithelial ovarian tumors (35 cases of adenomas, 32 cases of tumors of borderline, and 62 cases of denocarcinomas. The expressions of two, clinicopathologic parameters and their relationship were analyzed. Results Positive rate of Skp2 both in ovarian adenoma and borderline adenoma was 0 (0/35, 0/32), and the positive rate in ovarian adenocarcinoma was 40.32% (25/62), which was significantly higher than in ovarian adenoma and borderline adenoma (χ2value was 8.25 and 6.72, respectively, bothP<0.05). Positive rate of PTEN in ovarian adenoma and borderline adenoma was 82.86% (29/35) and 59.38% (19/32), respectively, and that in ovarian adenocarcinoma was 40.32% (25/62), which was significantly lower than in ovarian adenoma and borderline adenoma (χ2value was 11.15 and 9.23, respectively, bothP<0.05). The expression levels of Skp2 and PTEN were independent of age, menopause and histological type (χ2value was 1.01, 0.04 and 0.21, respectively, allP>0.05). The expression of Skp2 was remarkably higher in ovarian cancer at Ⅲ-Ⅳ stage, moderately and poorly differentiated group and lymph node metastasis group than in ovarian cancer at Ⅰ-Ⅱ stage, higher differentiated group and no lymph node metastasis group (χ2value was 10.05, 11.21 and 8.54, respectively, allP<0.05), but PTEN was lower (χ2value was 8.23, 12.15 and 7.65, respectively, allP<0.05). The expression of Skp2 was negatively correlated with that of PTEN (r=-0.321,P<0.05). Conclusion Up-regulation of Skp2 and down-regulation of PTEN may play an important role in the genesis and development of epithelial ovarian tumors. Detecting the expression levels of Skp2 and PTEN might have value on analyzing the prognosis of ovarian cancer.

s.phaseklnase-associatedprotein-2 (Skp2); phosphatase and tensin homolog deleted on chromosometen (PTEN); epithelial ovarian cancer; immunohistochemistry

2016-08-22

張 芳(1973-)，女，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事婦科臨床工作。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.10.017

R711.7

A

1673-5293(2016)10-1217-04