陳明生 （山東省諸城市畜牧獸醫(yī)管理局 262200)

兩種獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)的差異比較

陳明生 （山東省諸城市畜牧獸醫(yī)管理局 262200)

面對(duì)從出不窮的食品安全問(wèn)題和溯源管理難等問(wèn)題，快速檢測(cè)技術(shù)和儀器及試劑的研究具有特殊的意義，應(yīng)從我國(guó)實(shí)際出發(fā)，盡快形成 “快速篩查方法”和 “確證檢測(cè)方法”相結(jié)合的檢測(cè)方法體系。借鑒和采用國(guó)內(nèi)外先進(jìn)技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)，研究并實(shí)施動(dòng)物性產(chǎn)品中獸藥殘留的快速檢測(cè)技術(shù)，目前快速檢測(cè)技術(shù)主要有酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)、膠體金免疫層技術(shù)、微生物抑制法檢測(cè)技術(shù)、化學(xué)發(fā)光酶免疫檢測(cè)技術(shù)等，也是未來(lái)快速檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)，上述快速檢測(cè)技術(shù)可以滿足大量樣品檢測(cè)，縮短檢測(cè)周期、降低檢測(cè)費(fèi)用。

下面就將獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)的研究工作得出的成功經(jīng)驗(yàn)做一個(gè)簡(jiǎn)單介紹。比對(duì)液相—串聯(lián)質(zhì)譜法中內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法，確定內(nèi)標(biāo)法為最佳確證法，經(jīng)確證酶聯(lián)免疫檢測(cè)法和膠體金免疫層析法是最適合基層工作的最佳快速檢測(cè)技術(shù)方法，為實(shí)驗(yàn)室及現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法的實(shí)施提供參考。

以鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇為例，比對(duì)檢測(cè)樣品前處理的內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果，確定內(nèi)標(biāo)法的準(zhǔn)確度和精密度更高，是最佳的確定方法。

內(nèi)標(biāo)法：是色譜分析中一種比較準(zhǔn)確的定量方法，其方法是將一定質(zhì)量的內(nèi)標(biāo)物加到一定量的被分析樣品混合物中，然后對(duì)含有內(nèi)標(biāo)物的樣品進(jìn)行色譜分析，分別測(cè)定內(nèi)標(biāo)物和待測(cè)組分的峰面積 （或峰高）及相對(duì)校正因子，按公式和方法即可求出被測(cè)組分在樣品中的百分含量。

外標(biāo)法：是以待測(cè)成分的對(duì)照品作為對(duì)照物質(zhì)，相對(duì)比較以求得供試品的含量。是以待測(cè)成分的對(duì)照品作為對(duì)照物質(zhì)，相對(duì)比較已求得供食品的含量。

準(zhǔn)確度：指在一定條件下多次測(cè)定的平均值與真值相符合的程度，以誤差來(lái)表示。用來(lái)表示系統(tǒng)誤差大小。在實(shí)際工作中，通常用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，在無(wú)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或標(biāo)準(zhǔn)方法時(shí)，常用加入被測(cè)定組分的純物質(zhì)進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)來(lái)估計(jì)和確定準(zhǔn)確度。

精確度：是在規(guī)定條件下，獨(dú)立測(cè)量結(jié)果間的一致程度分析時(shí)，常用RSD表示精確度。

內(nèi)標(biāo)物：將一個(gè)已知質(zhì)量，樣品中不含有雜質(zhì)的純物質(zhì)加入到待測(cè)樣品溶液中，以此純物質(zhì)的量為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)比測(cè)定待測(cè)組分的含量，該純物質(zhì)稱為內(nèi)標(biāo)物。

1 內(nèi)標(biāo)法

1.1 原理

試料中的殘留藥物經(jīng)酶解，用高氯酸調(diào)pH值后高速離心沉淀蛋白，上清液調(diào)PH值后分別用乙酸乙酯和叔丁基甲醚 （TBME）提取，再用MCX固相萃取柱凈化，液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定。

1.2 檢測(cè)步驟

（1）樣品的制備：取適量新鮮或冷凍的豬肉組織絞碎并勻質(zhì)；取適量新鮮或冷凍的牛奶混合均勻；取適量新鮮或冷凍的雞蛋去殼后混合均勻。

將制備的豬肉、牛奶和雞蛋樣品儲(chǔ)存于-20℃以下備用。

（2）制備試料：取勻質(zhì)的供試料品作為供試試料；取勻質(zhì)的空白樣品作為空白試料；取勻質(zhì)的空白樣品添加適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液作為空白添加試料；在所有的供試試料、空白試料、空白添加試料中都加入等量適宜濃度的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)工作。

（3）酶解：準(zhǔn)確稱取均勻樣品2g（精致到0.01g）于50ml離心管內(nèi)加入0.2mol/L乙酸銨溶液 （pH值5.2）8ml，再加入β—鹽酸葡萄糖醛苷酶40μL渦旋混勻，于37℃下避光恒溫振蕩16h。

（4）提?。好附夂蠓胖弥潦覝兀瑴u旋混勻10000r/min高速離心10min，轉(zhuǎn)移上清液于另一50ml離心管中，加入高氯酸溶液5ml，渦旋混勻，用高氯酸調(diào)pH至1.0±0.2，10000r/min高速離心10min，轉(zhuǎn)移上清液于另一50ml離心管中，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至9.5±0.2，加入乙酸乙酯15ml渦旋混勻，振蕩10min，5000r/min高速離心5min，取上層有機(jī)相至另一離心管中，再在下層水相中加入叔丁基甲醚10ml，渦旋混勻振蕩10min，5000r/min高速離心5min合并有機(jī)相，50℃平行蒸發(fā)至干，用甲酸水溶液5ml溶解備用。

（5）凈化：MCX固相萃取柱依次甲醇、2%甲酸水各3ml活化，取備用液全部過(guò)柱，再依次用2%甲酸水、甲醇各3ml淋洗、抽干。用3%氨水甲醇溶液2.5ml洗脫，洗脫液在50℃下用氮?dú)獯蹈?，殘留物用甲醇?.1%甲醇溶液 （10+90，v/v）0.2ml溶解，渦旋混勻，樣液經(jīng)0.2μm針孔過(guò)濾器過(guò)濾后供液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定。

（6）液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法條件：色譜柱：BEHC18柱50mm×2.1mm （i.d.）粒度1.7μm。流動(dòng)相：A相0.1%甲酸乙腈溶液；B相0.1%甲酸水溶液。梯度洗脫：0～2min，維持4%A； 2～12min， 4%A 線性變化至 60%A； 12～12.1min， 60%A線性變化至4%A；12.1～16min，維持4%A。流速：0.3ml/min。進(jìn)樣量：10μl。柱溫：30℃。離子源：電噴霧ESI正離子。掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM，然后以30℃/min升至260℃，保持1min， 再以 20℃/min升至 280℃， 保持 2min，直至樣品的組分全部流出。

（7）監(jiān)測(cè)離子對(duì)：克倫特羅m/z277.1～202.8（定量離子）、 277.1～258.9； 萊克多巴胺m/z302.3～106.7 （定量離子）、302.3～163.8； 沙丁胺醇 m/z240.1～147.7 （定量離子）、 240.1～221.9；氘代克倫特羅m/z277.1～202.8（定量離子）；氘代萊克多巴胺 m/z302.3～106.7（定量離子）；氘代沙丁胺醇 m/z240.1～147.7 （定量離子）。

（8）質(zhì)譜分析：在上述工作條件下，通過(guò)儀器工作軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以色譜峰面積按內(nèi)標(biāo)法定量，克倫特羅氘代代克倫特羅為內(nèi)標(biāo)物計(jì)算，萊克多巴胺以氘代萊克多巴胺為內(nèi)標(biāo)物計(jì)算，沙丁胺醇以氘代沙丁胺醇為內(nèi)標(biāo)物計(jì)算。

（9）液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜確證：按上述工作條件測(cè)定樣品和標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別計(jì)算樣品和標(biāo)準(zhǔn)工作液中非定量離子與定量離子峰面積的比值，僅當(dāng)兩者數(shù)值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于25%時(shí)方可確定兩者為同一物質(zhì)。

（10）準(zhǔn)確度：本方法在0.25～26μg/kg添加濃度范圍內(nèi)，用空白添加校準(zhǔn)、校正，其回收率范圍80～110%。

（11）精密度：本方法批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤15%，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤15%。

（12）結(jié)果判定：“瘦肉精”β—受體激動(dòng)劑液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)法檢出限為0.25μg/kg、定量限為0.5μg/kg，判定檢測(cè)結(jié)果大于0.5μg/kg時(shí)為陽(yáng)性。

2 外標(biāo)法

2.1 原理

同內(nèi)標(biāo)法。

2.2 監(jiān)測(cè)步驟

（1）樣品的制備：同內(nèi)標(biāo)法。

（2）制備試料：取勻質(zhì)的供試料品作為供試試料；取勻質(zhì)的空白樣品作為空白試料；取勻質(zhì)的空白樣品添加適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液作為空白添加試樣。

（3） 酶解。

（4） 提取。

（5）凈化分別同內(nèi)標(biāo)法。

（6）色譜柱、流動(dòng)相、梯度洗脫、流速、進(jìn)樣量、柱溫、離子源、掃描方式分別同內(nèi)標(biāo)法，監(jiān)測(cè)離子對(duì)：克倫特羅m/z277.1～202.8（定量離子）、277.1～258.9；萊克多巴胺m/z302.3～106.7 （定量離子）、 302.3～163.8； 沙丁胺醇 m/z240.1～147.7 （定量離子）、 240.1～221.9。

（7）質(zhì)譜分析：在上述工作條件下，通過(guò)儀器工作軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以色譜峰面積定量。

（8）液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜確證同內(nèi)標(biāo)法。

（9）本方法在0.25～2μg/kg添加濃度范圍內(nèi)用空白添加校準(zhǔn)、校正，其回收率范圍為70～120%。

（10）精密度：本方法批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤20%，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤20%。

（11）結(jié)果判定：同內(nèi)標(biāo)法。

3 內(nèi)標(biāo)法于外標(biāo)法進(jìn)行比對(duì)

通過(guò)表1、表2可以看出內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法的衡量指標(biāo)的差別。

表1 內(nèi)標(biāo)法

表2 外標(biāo)法

4 結(jié)論

通過(guò)實(shí)驗(yàn)室多次實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法對(duì)比，證明內(nèi)標(biāo)法靈敏度高、定性準(zhǔn)確，確定內(nèi)標(biāo)法優(yōu)于外標(biāo)法，可作為動(dòng)物產(chǎn)品中 “瘦肉精”β—受體激動(dòng)劑殘留的最佳確證方法，面對(duì)大量動(dòng)物食品，為防止藥物殘留超標(biāo)，液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)法為動(dòng)物食品中藥物殘留快速檢測(cè) （酶聯(lián)免疫檢測(cè)法和膠體金免疫層析法—篩選法）結(jié)果提供了有效的確證。