龔 俊, 劉玉配, 李媛媛,2

(1.華東師范大學(xué)生態(tài)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院浙江天童國家森林生態(tài)系統(tǒng)野外觀測研究站,上海 200241; 2.上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司,上海 200082)

煙葉表面微生物類群兩種檢測方法的比較研究

龔 俊1, 劉玉配1, 李媛媛1,2

(1.華東師范大學(xué)生態(tài)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院浙江天童國家森林生態(tài)系統(tǒng)野外觀測研究站,上海 200241; 2.上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司,上海 200082)

為研究克隆文庫法和高通量測序兩種方法對煙葉表面微生物類群的檢測效果,確定檢測煙葉表面微生物多樣性的最優(yōu)方法,檢測了基于細(xì)菌16S rDNA和真菌ITS區(qū)域的烤煙表面微生物類群的多樣性.結(jié)果顯示,高通量測序得到的序列數(shù)量比克隆文庫法多,兩種方法檢測到細(xì)菌的OTU數(shù)目相近,但高通量檢測的真菌OTU數(shù)目較多;稀疏曲線顯示高通量測序的數(shù)據(jù)飽和度更高;預(yù)計(jì)的群落多樣性(Chao1指數(shù)和Ace指數(shù))克隆文庫法均高于高通量測序法,實(shí)際的群落多樣性(Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù))表明克隆文庫法檢測的細(xì)菌多樣性略高,而高通量測序檢測的真菌多樣性略高;在檢測到的細(xì)菌和真菌種類上,高通量測序略多于克隆文庫法,兩種方法檢測的細(xì)菌優(yōu)勢類群基本一致,為假單胞菌屬、不動桿菌屬和鞘氨醇單胞菌屬,但真菌類群相差較大,且高通量測序檢測到大量新的真菌序列.總體上,高通量測序方法具有通量大、產(chǎn)出數(shù)據(jù)多的優(yōu)勢,可更全面、更準(zhǔn)確地反映煙葉表面微生物群落結(jié)構(gòu).

克隆文庫; 高通量測序; 細(xì)菌; 真菌; 煙葉

0 引 言

煙葉陳化是煙草加工過程中改善煙葉品質(zhì)的一個重要環(huán)節(jié),其實(shí)質(zhì)是在一定環(huán)境條件下,煙葉內(nèi)部理化特性發(fā)生緩慢而充分的變化.目前認(rèn)為煙葉發(fā)酵機(jī)理主要包括酶作用、微生物作用和化學(xué)作用三個方面[1].其中煙葉表面微生物不僅自身的生命活動作用于煙葉的整個陳化過程,還通過代謝產(chǎn)生的生物酶參與煙葉的生理生化反應(yīng),促進(jìn)煙葉生物大分子化合物的轉(zhuǎn)化及致香成分的產(chǎn)生和積累,同時降低煙草中的有害物質(zhì),使煙葉品質(zhì)得到提高[2].因此,對煙葉表面微生物類群的研究可客觀深入地了解煙葉化學(xué)成分的變化規(guī)律.

早期對煙葉發(fā)酵過程中微生物群落多樣性的研究主要通過平板分離并培養(yǎng)可培養(yǎng)微生物來確定優(yōu)勢菌群[3-4].但存在不同微生物的增殖差異問題,并且99%的微生物不能在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)出來[5-6],因而難以客觀反映煙葉表面微生物類群狀況.隨著分子生物學(xué)快速發(fā)展,利用變性梯度凝膠電泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DGGE)和限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)等分子技術(shù)鑒定煙葉發(fā)酵過程中微生物種類的研究也越來越多[6-7].然而,這些方法通過觀察挑選電泳條帶進(jìn)行測序分析,局限于條帶的濃度,得到的結(jié)果不完全[8],因此也不能充分反映煙葉表面的微生物種類.

克隆文庫法通過構(gòu)建文庫并選擇一定數(shù)量的克隆進(jìn)行測序,一定程度上彌補(bǔ)了無法鑒定不可培養(yǎng)微生物的缺陷,近年來已較多地用于煙葉表面微生物類群鑒定[9-11].隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展,一種新的研究環(huán)境微生物群落多樣性的方法——宏基因組學(xué)應(yīng)運(yùn)而生,基于高通量測序?qū)Νh(huán)境微生物群落多樣性進(jìn)行研究,可直接對從環(huán)境中獲得基因組樣品進(jìn)行測序分析,具有通量大、產(chǎn)出數(shù)據(jù)多、更為高效的優(yōu)勢[12],但目前鮮見應(yīng)用于煙葉表面微生物的檢測.本研究應(yīng)用克隆文庫法和高通量測序兩種方法檢測烤煙煙葉表面微生物類群多樣性,比較兩種方法檢測結(jié)果的差異,篩選優(yōu)勢環(huán)境微生物鑒定方法,為后續(xù)環(huán)境微生物區(qū)系及動態(tài)變化研究提供基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2013年10月采集產(chǎn)地為福建、等級為C/挑的烤煙煙葉樣品,裝入無菌自封袋中于-72℃保存,以備提取煙葉表面微生物DNA.

1.2 微生物收集

參考Zhao等[6]和Su等[9]的方法收集煙葉表面微生物,具體步驟為：稱取40 g煙葉樣品剪碎,置于裝有500 mL滅菌的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中,于27℃、210 r/ min的搖床上振蕩30 min,然后用單層紗布過濾,可得懸浮在磷酸緩沖液內(nèi)的葉表面大部分微生物.濾液用大容量離心機(jī)10 000×g離心30 min,收集沉淀即為煙葉表面微生物.

1.3 微生物總DNA提取

采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)(TIANGEN公司)進(jìn)行煙葉表面微生物總DNA的提取,即可得到煙葉表面細(xì)菌和真菌的總DNA.

1.4 克隆文庫法鑒定微生物類群

1.4.1 PCR擴(kuò)增

細(xì)菌16S rDNA序列擴(kuò)增采用引物799F(5′-GGTAGTCCACGCCGTAAACGATG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′),擴(kuò)增片段長度約715 bp;真菌的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS序列的擴(kuò)增采用引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′),擴(kuò)增片段長度約500 bp.PCR反應(yīng)體系如下, 150 ng模板DNA,1.25U Ex Taq聚合酶(Takara公司),1×Ex Taq Buffer(Mg2+plus), 200μmol/L dNTP Mixture,0.2μmol/L引物,補(bǔ)加滅菌ddH2O至50μL.PCR反應(yīng)程序如下,94℃5 min;(94℃1 min,Tm 45 s,72℃1 min)30個循環(huán);72℃8 min.其中擴(kuò)增16S r DNA序列的退火溫度為53℃,ITS序列為56℃.

1.4.2 克隆文庫構(gòu)建和測序

PCR產(chǎn)物采用多功能DNA純化回收試劑盒(離心柱型)(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)純化回收.將PCR純化產(chǎn)物與p MD19-TVector(Takara公司)連接后轉(zhuǎn)入TOP10感受態(tài)細(xì)胞中(TIANGEN公司),在氨節(jié)平板上37℃培養(yǎng).挑選白色菌落用M13F和M13R載體引物擴(kuò)增驗(yàn)證陽性克隆后,在上海生工生物工程有限公司進(jìn)行雙向測序.

1.5 高通量測序分析微生物類群

高通量測序在上海美吉生物工程有限公司進(jìn)行.細(xì)菌16S rDNA和真菌ITS測序均在Roche 454 GS FLX+測序平臺上進(jìn)行.細(xì)菌和真菌測序區(qū)域均與克隆文庫法相同,細(xì)菌測序引物是799F和1492R,真菌測序引物是ITS4和ITS5.

1.6 數(shù)據(jù)處理

克隆文庫法測序得到的序列去載體、拼接、比對,采用B2C2[13]檢測并去除嵌合體序列后得到用于后續(xù)分析使用的優(yōu)化序列,采用mothur軟件[14]對優(yōu)化序列進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)聚類,以97%相似性為閡值,得到OTU代表序列.高通量測序得到的序列用Qiime v1.17[15]去雜過濾得到有效序列后用uchime-ref方法[16]去除嵌合體序列后得到優(yōu)化序列,在Usearch v7.1中調(diào)用uparse方法[17]對優(yōu)化序列按相似度97%進(jìn)行聚類,得到OTU代表序列.計(jì)算兩種方法測序數(shù)據(jù)的文庫覆蓋率(Coverage),文庫覆蓋率是計(jì)算測序深度的指標(biāo)[23],值越高表示樣品中序列被測出來的概率越大,計(jì)算公式為：

其中,n1為只含有一條序列的OTU數(shù),N為樣品中的優(yōu)化序列的數(shù)目.

對97%相似水平的OTU代表序列采用RDP Classifier方法[18-19]進(jìn)行分類學(xué)分析,置信度閡值為95%.用mothur軟件對97%相似度的OTU做稀有度分析,利用SigmaPlot v12.5制作稀疏曲線圖.用mothur軟件計(jì)算4種多樣性指數(shù)：Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù).Chao1和Ace指數(shù)是利用現(xiàn)有結(jié)果對整個群落的OTU多樣性進(jìn)行預(yù)測的指標(biāo),其越大代表群落多樣性越高;Simpson和Shannon指數(shù)是對現(xiàn)有結(jié)果進(jìn)行OTU多樣性分析的指標(biāo),Simpson值越大說明群落多樣性越低,Shannon指數(shù)值越大說明群落多樣性越高.

Chao1指數(shù)[20]表示樣品中所含估計(jì)OTU的數(shù)目,計(jì)算公式為：

其中,SChao1為估計(jì)的OTU數(shù),Sobs為實(shí)際檢測到的OTU數(shù),n1為含有一條序列的OTU數(shù), n2為含有2條序列的OTU數(shù).

Ace指數(shù)[21-22]是用來估計(jì)群落中OTU數(shù)目的指數(shù),計(jì)算公式為：

ni為含有i條序列的OTU數(shù)目;Srare為含有或少于“abund”條序列的OTU數(shù)目;Sabund為多于“abund”條序列的OTU數(shù)目;abund為劃分優(yōu)勢OTU的序列數(shù)量閡值,默認(rèn)10.

2 結(jié) 果

2.1 序列優(yōu)化與OTU聚類

細(xì)菌16S rDNA：克隆文庫法獲得有效序列152條,優(yōu)化后序列共141條,以97%序列相似性為閡值,可聚類為79個OTUs;而高通量測序獲得有效序列高達(dá)10 017條,優(yōu)化后得到4 861條,可聚類為76個OTUs;兩種測序方法得到的序列應(yīng)用率分別為92.76%和48.53%(見表1).

真菌ITS：克隆文庫法獲得有效序列88條,優(yōu)化后共86條序列,以97%序列相似性為閡值,可聚類為18個OTUs;而高通量測序獲得ITS有效序列5 742條,優(yōu)化后得到4 754條,優(yōu)化序列可分為37個OTUs.兩種測序方法得到的序列應(yīng)用率分別為97.73%和82.78%(見表1).

表1 序列優(yōu)化及OTU聚類結(jié)果Tab.1 Results of trimmed sequences and OTU analysis

高通量測序法測得的細(xì)菌和真菌的覆蓋率都為100%.克隆文庫法細(xì)菌測序克隆數(shù)為163,其中測出序列152條,優(yōu)化序列的文庫覆蓋率為60.99%;真菌測序克隆數(shù)為91,其中測出序列88條,優(yōu)化序列的文庫覆蓋率為83.72%.

2.2 稀疏曲線

運(yùn)用兩種分析方法得到的細(xì)菌和真菌的稀疏曲線如圖1所示.高通量測序得到的不管是細(xì)菌還是真菌的稀疏曲線都呈現(xiàn)逐漸平緩的趨勢,說明數(shù)據(jù)飽和度較好;而克隆文庫法得到的細(xì)菌和真菌的稀疏曲線都呈陡峭的上升趨勢,表明數(shù)據(jù)飽和度不夠,但序列間差異大,鑒別OTUs的比例高.

2.3 多樣性分析

兩種測序方法得到的多樣性指數(shù)見表2.克隆文庫法得到的細(xì)菌的Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)和Shannon指數(shù)都較大,Simpson指數(shù)較小,說明克隆文庫法得到的細(xì)菌群落預(yù)計(jì)的和實(shí)際的多樣性都較高.克隆文庫法得到的真菌的Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)都較大,說明克隆文庫法得到真菌群落預(yù)計(jì)的多樣性較大,而Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)顯示高通量測序得到的真菌實(shí)際多樣性更高.

表2 細(xì)菌和真菌的多樣性指數(shù)Tab.2 Diversity indices in bacterial and fungal communities

2.4 群落分類情況

將測序得到的序列歸類到各分類水平后,統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表3所示.已知和未知種類總體上來看,克隆文庫法檢測到細(xì)菌共有3門6綱11目20科28屬,真菌共有3門6綱7目10科12屬.高通量測序共檢測到細(xì)菌有5門7綱16目30科44屬,真菌共有3門8綱13目15科19屬.從兩種方法檢測的比值來看,高通量測序檢測到的細(xì)菌和真菌種類都高于克隆文庫法,并且一般來說分類水平越低,檢測到的種類越多.

表3 兩種測序方法檢測到的細(xì)菌和真菌分類情況Tab.3 Taxon of bacteria and fungi detected by two different methods

2.5 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與優(yōu)勢菌群

兩種測序方法得到的細(xì)菌群落在門分類上的組成見圖2.克隆文庫法得到的細(xì)菌為3個門,分別為變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和放線菌門(Actinobacteria),還有部分序列不能被分類的歸為Unclassified;高通量測序得到的細(xì)菌可分為5個門,除包括克隆文庫法得到的3個門外還有藍(lán)藻門(Cyanobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes),以及不能分類的Unclassified,高通量測序鑒別的細(xì)菌門類多于克隆文庫法.兩種測序方法檢測細(xì)菌門類最多的都是變形菌門,分別占90.78%和81.32%,得到的優(yōu)勢菌門相同.克隆文庫法有部分細(xì)菌門如藍(lán)藻門和擬桿菌門沒有檢測到.

兩種方法得到的細(xì)菌群落在屬分類上的結(jié)構(gòu)見圖3.克隆文庫法檢測到的已知分類的屬為14個,高通量測序?yàn)?6個,其中有11個屬共同檢測到.克隆文庫法檢測到類群最多的3個屬分別是假單胞菌屬(Pseudomonas)、不動桿菌屬(Acinetobacter)和鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas),分別占9.22%、9.22%和6.38%;高通量測序檢測類群最多的屬分別是假單胞菌屬、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、不動桿菌屬和鞘氨醇單胞菌屬,分別占11.24%、7.66%、6.29%和6.00%.在屬的分類水平上,高通量測序可以檢測到的細(xì)菌屬種類更多,兩種測序方法得到的優(yōu)勢菌屬基本一致.

圖2 細(xì)菌群落在門分類水平的結(jié)構(gòu)Fig.2 Bacterial community structure on phylum level

圖3 細(xì)菌群落在屬分類水平的結(jié)構(gòu)Fig.3 Bacterial community structure on genus level

2.6 真菌群落結(jié)構(gòu)與優(yōu)勢菌群

兩種測序方法得到的真菌群落在門分類上的組成見圖4.真菌中擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、子囊菌門(Ascomycota)和接合菌門(Zygomycota)3個門在兩種方法中都鑒定出來,都有部分序列不能被分類的歸為Unclassified.其中擔(dān)子菌門種類最多,達(dá)60%以上,其次是子囊菌門,最少的是接合菌門.

兩種方法鑒定的真菌群落在屬分類上的組成見圖5.克隆文庫法鑒定了10個已知分類的真菌屬,高通量測序鑒定了11個已知分類真菌屬,但是兩種方法鑒定為相同的屬只有1個,為曲霉屬(Aspergillus).克隆文庫法獲得屬的比例都1%,其中比例最高的3個屬分別是紅酵母屬(Rhodotorula)、假絲酵母屬(Candida)和根霉屬(Rhizopus),分別占62.79%、19.77%和3.49%;高通量測序獲得的序列大部分都未能分到現(xiàn)有屬中(88.27%),比例1%的只有Meyerozyma屬、散囊菌屬(Eurotium)和翹抱霉屬(Emericella)3個屬,分別占5.37%、2.42%和2.13%.在屬分類水平上,兩種方法鑒定的真菌屬種類相差很大.

圖4 真菌群落在門分類水平的結(jié)構(gòu)Fig.4 Fungal community structure on phylum level

圖5 真菌群落在不同屬分類水平的結(jié)構(gòu)Fig.5 Fungal community structure on genus level

3 討 論

煙葉發(fā)酵過程微生物種類繁多,也起到了不同的作用.本研究采用克隆文庫法和高通量測序法對煙葉表面微生物種類進(jìn)行檢測,在序列數(shù)量和OTU種類上兩種方法差異都較大.克隆文庫法得到的序列數(shù)量與克隆的生長和測序數(shù)目有關(guān),獲得幾百條序列已屬大量,而高通量測序一次反應(yīng)則至少能獲得上千條序列,表明高通量測序具有通量大、產(chǎn)出數(shù)據(jù)多的優(yōu)勢[12].但細(xì)菌OTU劃分結(jié)果顯示兩種方法獲得的種類數(shù)量相差不多,分別為79(克隆文庫法)和76(高通量測序)個,真菌OTU劃分結(jié)果顯示高通量測序獲得的OTU種類(37個)多于克隆文庫法(18個).本研究中高通量的OTU的建立采用較新的UPARSE方法,該方法比其他如QIIME和mothur等聚類出OTU的數(shù)量少,但在與已知種類的序列匹配、誤差率和嵌合子(chimeric)出現(xiàn)的概率等方面都有優(yōu)勢[17].

從兩種測序方法得到的文庫覆蓋率可以看出高通量測序得到的文庫覆蓋率更高,從稀疏曲線中也可以看出高通量測序得到的數(shù)據(jù)飽和度高,而克隆文庫法鑒定的序列差異大,遠(yuǎn)未達(dá)到飽和,這一結(jié)果與UPARSE方法分析高通量數(shù)據(jù)時統(tǒng)計(jì)方法有關(guān).UPARSE進(jìn)行高通量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時,對測出的單拷貝序列(只出現(xiàn)1次的單獨(dú)1條序列,singleton)進(jìn)行了優(yōu)化去除[17],大大降低了序列的差異性,使得計(jì)算的文庫覆蓋率為100%,在稀疏曲線中也呈現(xiàn)飽和,增加了結(jié)果的保守性,而克隆文庫法由于單拷貝序列的大量出現(xiàn)導(dǎo)致文庫覆蓋率降低,稀疏曲線無限增加[24].這也反映在預(yù)計(jì)的群落多樣性指數(shù)(Chao1指數(shù)和Ace指數(shù))上,克隆文庫法鑒定的細(xì)菌和真菌的預(yù)計(jì)多樣性均高于高通量測序法,顯示了保守性.而實(shí)際的群落多樣性(Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù))克隆文庫法得到的細(xì)菌多樣性略高,真菌的多樣性高通量測序的略高(見表2).類似Chao1指數(shù)這類多樣性指標(biāo)較多地依賴于單拷貝序列的數(shù)目,在高通量測序數(shù)據(jù)的分析中受到質(zhì)疑[25].

從微生物組成情況可以看出,高通量測序檢測到的細(xì)菌和真菌的已知種類均多于克隆文庫法,且分類水平越低,檢測到的微生物種類越多,在門分類水平上兩種測序方法得到的細(xì)菌種類差異最小,在科、屬水平上差異最大(見表3).兩種方法檢測的細(xì)菌優(yōu)勢門相同,都為變形菌門(都占80%以上),其次是厚壁菌門,與Su等用克隆文庫法[9]、Huang等用RFLP法[7]檢測煙葉表面細(xì)菌的優(yōu)勢門一致.在屬分類水平上,本研究兩種方法得到的優(yōu)勢細(xì)菌類群基本一致,為假單胞菌屬、不動桿菌屬和鞘氨醇單胞菌屬,高通量測序還有甲基桿菌屬也屬優(yōu)勢類群.Su等[9]用克隆文庫法檢測到津巴布韋煙葉表面細(xì)菌可分為16個屬,其中有8個屬與本文檢測結(jié)果一致,優(yōu)勢菌屬為泛菌屬和假單胞菌屬,與本文檢測也基本一致.Huang等[7]采用RFLP法檢測到未陳化烤煙K326表面細(xì)菌可分為50種,優(yōu)勢菌屬為芽抱桿菌屬和假單胞菌屬.段焰青等[26]采用平板分離得到煙葉樣品中的細(xì)菌包括芽抱桿菌屬、類芽抱桿菌屬、腸桿菌屬和泛菌屬與本文檢測結(jié)果一致,另有檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)和歐文氏菌屬(Erwinia)未在本研究中發(fā)現(xiàn).

本研究兩種方法檢測的真菌優(yōu)勢門也一致,都為擔(dān)子菌門和子囊菌門.但屬的差異甚大,兩種方法只有一個共同屬,優(yōu)勢類群也不同.本文高通量測序得到的真菌屬與段焰青等[26]分離得到的曲霉菌屬和鐮刀菌屬一致,克隆文庫法得到的根霉屬在段焰青等[26]研究中也分離得到了,只有木霉屬(Trichoderma)與本文結(jié)果有差異.另外,在高通量測序方法中有大量的序列沒有歸并到已知分類的屬中(unclassified,88.27%),表明檢測到大量在數(shù)據(jù)庫中還未出現(xiàn)的真菌序列,這種情況在Edgar對真菌的檢測中也曾出現(xiàn)[17].

兩種測序方法得到的微生物多樣性存在一定差異,導(dǎo)致這種差異的原因主要有：①導(dǎo)入目標(biāo)DNA片段的大腸桿菌在培養(yǎng)基上成功生長存在隨機(jī)性,導(dǎo)致某些微生物種類沒有檢測到;②克隆文庫法存在文庫構(gòu)建和測序數(shù)量的限制導(dǎo)致獲得序列數(shù)不足,因而不如高通量測序法更能充分反映環(huán)境中微生物組成;③用于高通量的焦磷酸測序本身存在的固有測序誤差也會導(dǎo)致一些稀有微生物種類的出現(xiàn)[12],尤其是由于單核昔酸重復(fù)(均聚體)易出現(xiàn)而導(dǎo)致ITS序列在454測序中容易出錯[27].總體上,高通量測序具有通量大、產(chǎn)出數(shù)據(jù)多的優(yōu)勢,因而可以更全面、更準(zhǔn)確地反映煙葉表面微生物種類和結(jié)構(gòu)的特點(diǎn),且隨著高通量測序方法日趨成熟、測序成本不斷降低,該方法將有望成為今后研究烤煙微生物多樣性的一種常用技術(shù)手段.

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(責(zé)任編輯：張晶)

Comparative analysis of microbial communities on tobacco leaves between clone library and high-throughput sequencing

GONG Jun1, LIU Yu-pei1, LI Yuan-yuan1,2
(1.Tiantong National Eield Observation Station for Eorest Ecosystem,School of Ecological and Environmental Sciences,East China Normal University,Shanghai 200241,China; 2.Shanghai Tobacco Group Corporation,Shanghai 200082,China)

In order to compare the microbial communities on tobacco leaves between clone library method and high-throughput sequencing method,we analyzed the diversity of microbial communities based on bacterial 16S rDNA and fungal ITS on tobacco leaves collected from Fujian province in China.The results showed that more numbers of bacterial and fungal sequences were detected by high-throughput sequencing than clone library.The number of operational taxonomic units(OTUs)clustered from high-throughput sequencing method was almost the same as thatfrom clone library method in bacterial communities,while that was higher from high-throughput sequencing in fungal communities.The rarefaction curves drawn from high-throughput sequencing method tended to approach the saturation plateau.The expected community diversity indices (Chao1 and Ace)were higher in clone library method,whereas the observed community diversity indices(Simpson and Shannon)suggested that higher bacterial diversities were detected through clone library method and higher fungal diversities were detected through high-throughput sequencing method.There were more kinds of bacteria and fungi genera identified through high-throughput sequencing method.The dominant genera of bacteria were similar detected from both of the methods,including Pseudomonas,Acinetobacter and Sphingonomonas.However,the fungal genera detected through these two methods were significantly different.Overall,novel high-throughput sequencing methods outperform clone library approaches in terms of resolution and magnitude.They enable identification and relative quantification of community members of tobacco leaves and offer new insights into environmental microbiology.

clone library; high-throughput sequencing; bacteria; fungi; tobacco leaves

Q33

A

10.3969/j.issn.1000-5641.2016.03.011

1000-5641(2016)03-0092-10

2015-04

煙草行業(yè)卷煙煙氣重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金(SZBCW2013-00596)

龔 俊,女,碩士研究生,研究方向?yàn)榉肿由鷳B(tài)學(xué).E-mail：gongjun.2009163.com.

李媛媛,女,博士,副教授,研究方向?yàn)榉肿由鷳B(tài)學(xué).E-mail：yylides.ecnu.edu.cn.