多里坤·努爾沙發(fā)，阿曼古力·馬木提，米吉提·莫合他爾汗

（新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆 烏魯木齊 830011）

實(shí)驗(yàn)研究

不同的病原菌檢測(cè)方法比較評(píng)價(jià)可疑布魯氏菌

多里坤·努爾沙發(fā)，阿曼古力·馬木提，米吉提·莫合他爾汗*

（新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆 烏魯木齊 830011）

目的：尋找布魯氏菌病病原學(xué)檢測(cè)工作的一種便利、快速、特異及敏感性較高的快速診斷方法。方法：收集247份病料，并經(jīng)細(xì)菌學(xué)方法分離方法得到26株可疑家畜布魯氏菌株，接著用分子生物學(xué)VirB8-PCR和AMOS-PCR方法對(duì)這批可疑菌株進(jìn)行確診鑒定，并對(duì)不同對(duì)比試驗(yàn)方法結(jié)果及應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果：細(xì)菌學(xué)分離方法與VirB-PCR及AMOS-PCR方法結(jié)果一致。AMOS-PCR方法結(jié)果同時(shí)還顯示26株可疑家畜布魯氏菌株包括19株菌為羊種布魯氏菌和7株菌為牛種布魯氏菌。結(jié)論：細(xì)菌學(xué)分離方法所需時(shí)間較長(zhǎng)、繁瑣有感染風(fēng)險(xiǎn)，且不能確定被檢可疑布魯氏菌的屬性；VirB-PCR方法雖然快速、敏感、比較安全等，但是只能確定布魯氏菌，而不能鑒別菌株屬性；AMOS-PCR方法快捷、經(jīng)濟(jì)、安全、便利、特異，敏感，且能鑒別菌株屬性。

家畜布魯氏菌株；細(xì)菌學(xué)分離；VirB8-PCR；AMOS-PCR；檢測(cè)方法比較

布魯氏菌病原學(xué)快速鑒別診斷方法的成功應(yīng)用，在布病防制工作中的早發(fā)現(xiàn)疫情，及時(shí)追蹤溯源，減少損失、成功實(shí)施防疫措施的關(guān)鍵性保障技術(shù)。對(duì)一些細(xì)菌分離培養(yǎng)得到非典型布魯氏病菌株和變異可疑菌株，不能用傳統(tǒng)方法快速、安全、特異、敏感的進(jìn)行鑒別診斷，但是PCR方法在布病檢測(cè)領(lǐng)域的成功利用，一定程度上滿足了上述傳統(tǒng)方法不能達(dá)到的檢測(cè)所求。據(jù)筆者了解，對(duì)布病不同的PCR檢測(cè)方法研究報(bào)道的較多見，但是在日常病原學(xué)檢測(cè)中應(yīng)用這些方法、并對(duì)這些方法應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行比較、評(píng)價(jià)的報(bào)道少見。為了尋找適合布病病原學(xué)檢測(cè)，并具備快速、特異、敏感、便利等特點(diǎn)診斷方法，本課題組采用了上述特點(diǎn)具備的VirB8-PCR及AMOS-PCR方法、對(duì)細(xì)菌學(xué)分離得到可疑布魯氏菌株進(jìn)行檢測(cè)確定種屬，同時(shí)對(duì)上述三種檢測(cè)方法的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行評(píng)估，確定優(yōu)先方法，便于日后檢測(cè)工作順利進(jìn)行。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 在南北疆設(shè)2個(gè)采樣點(diǎn)共收集病原學(xué)組織（牛、羊流產(chǎn)胎兒）病料247份，其中羊流產(chǎn)胎兒187份，牛流產(chǎn)胎兒60份。

1.1.3 儀器耗材生物培養(yǎng)箱；玻璃干燥缸；PCR儀；電泳儀；圖像分析儀；一次性培養(yǎng)皿；蠟燭；移液槍頭；微量加樣器等。

1.2 方法

1.2.1 布魯氏菌細(xì)菌學(xué)分離方法根據(jù)布魯氏菌病實(shí)驗(yàn)室研究技術(shù)進(jìn)行，不進(jìn)行生化試驗(yàn)。

1.2.2 VirB8-PCR和AMOS-PCR方法分別根據(jù)其說明書進(jìn)行，并且不同方法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 可疑菌株的分離

共分離的26株可疑菌，其中從60份牛流產(chǎn)胎兒經(jīng)厭氧培養(yǎng)分離得7株菌，需氧培養(yǎng)未能分離到可疑菌株，從187份羊病料經(jīng)需氧培養(yǎng)檢出19株菌，該兩株菌的生長(zhǎng)特性符合牛種和羊種布魯氏菌的生長(zhǎng)特點(diǎn)。

2.2 兩種PCR方法檢測(cè)結(jié)果及與細(xì)菌分離方法的對(duì)比評(píng)價(jià)

26株可疑菌經(jīng)VirB8-PCR檢測(cè)、均為布魯氏菌，該方法只能鑒別屬，不能鑒別種。而經(jīng)AMOS-PCR方法鑒定，牛胎兒分離7株菌，均為牛種布魯氏菌，羊胎兒分離19株菌，均為羊種布魯氏菌。三種試驗(yàn)對(duì)比結(jié)果分析詳見表1。

表1 三種試驗(yàn)對(duì)比結(jié)果分析

3 討論

3.1 經(jīng)細(xì)菌學(xué)分離方法分離得到26株可疑菌株。此方法的分離過程較長(zhǎng)，需要5～20d，試驗(yàn)前后所需準(zhǔn)備和消毒處理的器材較多、培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)條件要求較高，對(duì)操作條件及操作人員要求苛刻，有一定的感染風(fēng)險(xiǎn),該方法分離得到菌株的最終確診還的借助其它檢測(cè)方法來實(shí)現(xiàn)。分離株在胰蛋白示固體培養(yǎng)基上呈無色、透明、圓形、光滑，以肉眼容易辨別的菌落，菌種的培養(yǎng)、生長(zhǎng)特性，顯微鏡下菌體形態(tài)均符合布魯氏菌的初步判定標(biāo)準(zhǔn)，為下一步試驗(yàn)提供了有一定參考價(jià)值的科學(xué)依據(jù)，尤其是該方法與AMOS-PCR方法的結(jié)合鑒定，使AMOS-PCR檢測(cè)結(jié)果有了可比性參照對(duì)象，對(duì)AMOS-PCR方法的準(zhǔn)確率和可信度等主要標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)評(píng)價(jià)有了試驗(yàn)依據(jù)。

3.2 VirB-PCR方法與細(xì)菌分離方法對(duì)布魯氏菌屬的鑒定符合率為100%、檢測(cè)結(jié)果均為布魯氏菌。這與張付賢等所指出的結(jié)果完全吻合。該方法不但能在1d之內(nèi)可撿出鑒定結(jié)果，而且有操作簡(jiǎn)便、相對(duì)安全、成本較低、敏感，便利等特點(diǎn)，但是該方法只能鑒別布魯氏菌的屬，而不能鑒定種。

3.3 AMOS-PCR方法與細(xì)菌分離方法方對(duì)布魯氏菌屬的鑒定符合率完全一致。該方法能鑒別不同菌種，而且檢查結(jié)果與傳統(tǒng)方法符合率較高等相關(guān)研究基本一致。該方法基本性能與VirB-PCR相同，但該方法能夠鑒定菌種，在確診疫情、追蹤溯源、實(shí)施防控措施等工作中，可以作為布病病原學(xué)檢測(cè)方法中優(yōu)先考慮方法之一。

3.4 PCR方法雖然具備上述比較優(yōu)越性能、但是該方法需PCR儀、圖像分析儀等儀器，沒有一個(gè)統(tǒng)一的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，PCR的準(zhǔn)確性作出評(píng)估等原因，因此在一定程度上影響其應(yīng)用。

綜上所述，布魯氏菌診斷所用以上細(xì)菌學(xué)分離方法、VirB-PCR方法及AMOS-PCR方法等方法中，AMOS-PCR方法值得推廣。還應(yīng)該需要說明此次檢測(cè)的菌株數(shù)量較少,只牽扯引起牛羊發(fā)病的部分菌株，家畜和菌株種類都較少，可比范圍有一定的局限性，不能說所有布魯氏菌種都特異，鑒別診斷確診率高，而且對(duì)家畜布病流行情況的分析及PCR方法準(zhǔn)確性作出評(píng)估都有具有一定的局限性。需在今后的工作中不斷摸索完善。

［1］李長(zhǎng)友，等.動(dòng)物布魯氏菌病防治指導(dǎo)手冊(cè)［M］.中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社出版2012，第一版，第二章，第一節(jié).

［2］李堅(jiān)，等.用PCR法對(duì)布魯氏菌進(jìn)行篩查及分型鑒定的研究［J］.中國(guó)地方病防治雜志，2009，24（4）:302.

［3］布魯氏菌病實(shí)驗(yàn)室研究技術(shù)［M］.1983,第一章，第一節(jié).

［4］張付賢，等.布魯菌鑒別診斷方法的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)生物制品學(xué)雜志.2008，21（11）:1026.

［5］姜海，等.AMOS-PCR對(duì)布魯氏菌種型鑒定的應(yīng)用［J］.中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào).2009，25（2）:109.

［6］毛景東，等.布魯氏菌病的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī). 2011，38（1）:225.

［7］人畜共患病培訓(xùn)教材.第二章,第五節(jié).農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心編.

10．3969/J.ISSN．1671-6027．2016．01.005

新疆少數(shù)民族科技人才特殊培養(yǎng)計(jì)劃科研基金項(xiàng)目（No：201123109）

★通訊作者：米吉提·莫合他爾汗（1972～），哈薩克族，高級(jí)獸醫(yī)師，研究方向：布病防制

多里坤·努爾沙發(fā)（1969～），哈薩克族，本科，高級(jí)獸醫(yī)師，主要從事家畜布病防制工作