王云霞，劉文光，谷強(qiáng)

（1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子832000；2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科，新疆石河子832000）

論著

合并支原體感染的大葉性肺炎患兒肺泡灌洗液中常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢測(cè)及意義*

王云霞1，劉文光2，谷強(qiáng)2

（1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子832000；2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科，新疆石河子832000）

目的研究大葉性肺炎患兒支氣管肺泡灌洗液（BALF）中常規(guī)細(xì)胞學(xué)形態(tài)學(xué)檢測(cè)、肺炎支原體-DNA（MP-DNA）及細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-17（IL-17）水平，探討其臨床意義及相互關(guān)系。方法選取確診為大葉性肺炎并行支氣管肺泡灌洗術(shù)（BAL）的患兒87例，行BAL當(dāng)天對(duì)患兒行臨床肺部感染評(píng)分（CPIS）分為：重癥組27例，輕癥組60例；根據(jù)BALF免疫熒光定量MP-DNA結(jié)果，分為支原體感染73例：中拷貝組32例、高拷貝組41例，無(wú)支原體感染14例；ELISA法檢測(cè)BALF中IL-17水平，對(duì)BALF中細(xì)胞HE染色后放大100倍計(jì)數(shù)，比較各組間常規(guī)細(xì)胞學(xué)計(jì)數(shù)百分比差異。結(jié)果BALF中中性粒細(xì)胞百分比（NE%）、淋巴細(xì)胞百分比（LY%）與血清中NE%和LY%無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）；輕癥組患兒BALF中柱狀上皮細(xì)胞計(jì)數(shù)百分比高于重癥組，并且重癥組患兒BALF中巨噬細(xì)胞百分比高于輕癥組（P＜0.05）；高拷貝組NE%高于中拷貝組（P＜0.05），且NE%與BALF中IL-17水平及MP-DNA拷貝均呈正相關(guān)（r1=0.49，P=0.000，r2=0.48，P=0.000）。結(jié)論大葉性肺炎肺泡灌洗液中成分更能反應(yīng)大葉性肺炎局部炎癥情況；大葉性肺炎發(fā)生時(shí)柱狀上皮細(xì)胞受損脫落，同時(shí)巨噬細(xì)胞趨化聚集參與炎癥反應(yīng)；肺炎支原體感染時(shí)，IL-17通過(guò)中性粒細(xì)胞募集作用發(fā)揮抗感染能力，BALF中NE%可間接反映患兒局部感染支原體拷貝數(shù)。

大葉性肺炎；支原體感染；支氣管肺泡灌洗液；常規(guī)細(xì)胞染色；白細(xì)胞介素-17；兒童

大葉性肺炎是常見(jiàn)的社區(qū)獲得性肺炎之一，具有起病急、病情重和病程長(zhǎng)等特點(diǎn)［1］。近年來(lái)大葉性肺炎患兒肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae，MP）感染率逐年上升，不但呼吸系統(tǒng)受累，還引起多系統(tǒng)損害，并且重癥病例逐漸增多，嚴(yán)重時(shí)甚至引起死亡，引起廣泛關(guān)注［2］。支氣管肺泡灌洗術(shù)（bronchoalveolar lavage，BAL）是大葉性肺炎診治的一種重要技術(shù)，可獲得肺泡上皮表層液體中細(xì)胞成分和可溶性成分，其對(duì)于肺部疾病的機(jī)制研究及其診治有重要的意義。研究大葉性肺炎患兒支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中常規(guī)細(xì)胞學(xué)形態(tài)學(xué)檢測(cè)、肺炎支原體-DNA（mycoplasma pneumoniae deoxyribonucleic acid，MP-DNA）滴度及細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-17（interleukin-17，IL-17）水平，可深入探討大葉性肺炎免疫學(xué)機(jī)制，有利于疾病的診治。

1　資料與方法

1.1一般資料

參照《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》兒童大葉性肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］，選取石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科2014年3月-2015年7月以大葉性肺炎收住并行BAL的患兒，共87例。其中，男48例，女39例，年齡3～14歲，平均（8.20±3.88）歲。操作過(guò)程中留取灌洗液。所有患兒入院均行血常規(guī)、胸片和肺部CT等檢查，所獲取BALF均進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)、免疫熒光MP-DNA及HE染色細(xì)胞學(xué)等檢查。所選患兒行BAL前均未使用糖皮質(zhì)激素或丙球蛋白等免疫調(diào)節(jié)藥物。行BAL當(dāng)天對(duì)患兒行臨床肺部感染評(píng)分（clinical pulmonary infection score，CPIS），CPIS≥6分（27例）為重癥組：年齡（8.22±4.35）歲，男17例，女10例；CPIS＜6分（60例）為輕癥組：年齡（8.27±3.67）歲，男31例，女29例。CPIS是綜合臨床、影像和微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的評(píng)分系統(tǒng)，可用來(lái)評(píng)價(jià)大葉性肺炎的嚴(yán)重程度，大葉性肺炎評(píng)分≥6分為重度大葉性肺炎［4］。根據(jù)BALF免疫熒光定量MP-DNA結(jié)果，分為支原體感染組73例，其中：中拷貝組（MP-DNA：103～106）：32例，年齡（8.20±3.46）歲；高拷貝組（MP-DNA：106～）41例，年齡（8.38±3.03）歲；無(wú)支原體感染14例，年齡（8.39±3.54）歲。采用ELISA法對(duì)其中的1～79例患兒檢測(cè)BALF IL-17水平，對(duì)BALF中細(xì)胞HE染色后放大100倍計(jì)數(shù)，比較各組間常規(guī)細(xì)胞學(xué)計(jì)數(shù)百分比（中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和柱狀上皮細(xì)胞等）差異。各組間性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2方法

1.2.1BALF采集所有患兒術(shù)前6 h禁食水，行BAL術(shù)前均由家長(zhǎng)簽訂有創(chuàng)操作知情同意書(shū)，靜脈鎮(zhèn)靜加2%利多卡因咽喉部局部麻醉，采用纖維支氣管鏡經(jīng)鼻、咽喉、聲門進(jìn)入氣道，檢查各段支氣管無(wú)新生物和其他病變后，結(jié)合術(shù)前胸片及肺CT的定位結(jié)果，尋找病變部位的支氣管開(kāi)口，37℃生理鹽水灌洗受累的肺段，1.0ml/kg至少灌洗3次，總量不超過(guò)1.0～2.0ml/kg，隨即負(fù)壓吸引，至少30%灌輸液被回收，留取肺泡灌洗液標(biāo)本，緩慢拔出纖維支氣管鏡。獲取新鮮BALF標(biāo)本立即送往實(shí)驗(yàn)室行細(xì)胞學(xué)、MP-DNA和細(xì)菌培養(yǎng)等檢查，留取標(biāo)本3ml儲(chǔ)存在-80℃冰箱，等待測(cè)定IL-17水平。

1.2.2實(shí)驗(yàn)測(cè)定MP-DNA：PCR試劑盒（PCR熒光探針?lè)ǎ┯芍猩酱髮W(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供，PCR儀為美國(guó)ABIPrism7300基因擴(kuò)增儀；BALF細(xì)胞檢查：通過(guò)離心作用將一定數(shù)量的BALF細(xì)胞平鋪于載玻片上，冷風(fēng)吹干，無(wú)水乙醇中固定30min后進(jìn)行HE染色，100倍光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞分類計(jì)數(shù)；IL-17測(cè)定：雙抗體夾心ELISA法測(cè)定，試劑盒由武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司提供。以上操作步驟均嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位間距）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)；雙變量符合正態(tài)性檢驗(yàn)用Pearson相關(guān)分析，不符合則用Spearman相關(guān)，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1患兒BALF中相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性

BALF中中性粒細(xì)胞百分比（neutrophilicgranulocyte%，NE%）、淋巴細(xì)胞百分比（lymphocyte%，LY%）與血清中NE%、LY%未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

2.2重癥組患兒與輕癥組患兒相關(guān)指標(biāo)比較

重癥組患兒BALF中柱狀上皮細(xì)胞百分比低于輕癥組，并且重癥組BALF巨噬細(xì)胞百分比高于輕癥組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；NE%、LY%和組織細(xì)胞百分比在兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

2.3高拷貝組與中拷貝組相關(guān)指標(biāo)比較

高拷貝組NE%高于中拷貝組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），LY%、巨噬細(xì)胞百分比、柱狀上皮細(xì)胞百分比和組織細(xì)胞百分比在各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

2.4BALF中各指標(biāo)的相關(guān)性

BALF中NE%與BALF中IL-17水平及MP-DNA拷貝均呈正相關(guān)（r1=0.49，P=0.000，r2=0.48，P= 0.000）。見(jiàn)表4。

表1　患兒BALF中NE%、LY%與血清中NE%、LY%相關(guān)性分析

表2　重癥、輕癥大葉性肺炎患兒肺泡灌洗液常規(guī)細(xì)胞計(jì)數(shù)比較%

表3　高拷貝組、中拷貝組患兒肺泡灌洗液常規(guī)細(xì)胞計(jì)數(shù)比較%

表4　BALF中NE%與IL-17、MP-DNA拷貝相關(guān)性分析

3　討論

大葉性肺炎是兒童時(shí)期比較嚴(yán)重的下呼吸道感染性疾病，病原體感染時(shí)，肺局部抗感染能力較強(qiáng)，易出現(xiàn)較大炎癥病灶，局限在一葉或多葉。本研究發(fā)現(xiàn)BALF中NE%、LY%與血清中NE%、LY%無(wú)相關(guān)性（P＞0.05），表明大葉性肺炎發(fā)生時(shí)，肺部局部炎癥與全身炎癥反應(yīng)程度不平行，BALF中成分更能反應(yīng)大葉性肺炎局部炎癥情況。

正常人BALF細(xì)胞總數(shù)報(bào)道差別較大，約在9～26×106/ml，其中單核/巨噬細(xì)胞＞85%、淋巴細(xì)胞＜12%、中性粒細(xì)胞＜2%、嗜酸性粒細(xì)胞＜1%［5］。細(xì)胞總數(shù)和各組分比例改變可提示多種肺部疾病。假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮主要存在于呼吸道，其中柱狀細(xì)胞最多，主要分布于氣管、支氣管、肺泡的腔面，具有保護(hù)和分泌功能，急慢性炎癥可引起上皮細(xì)胞脫落并發(fā)生形態(tài)改變［6］。病原微生物感染可導(dǎo)致氣道上皮的完整性破壞或纖毛柱狀上皮細(xì)胞的鱗狀化生或持續(xù)氣道炎癥，氣道上皮被破壞越嚴(yán)重則病情越重。病菌侵入肺部呼吸道的第一道防線肺泡巨噬細(xì)胞大量趨化浸潤(rùn)，提呈抗原，吞噬脫落細(xì)胞，同時(shí)分泌促炎和抗炎細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)過(guò)程中既是啟動(dòng)細(xì)胞，也是炎癥因子作用的靶細(xì)胞［7］，對(duì)于控制病情有重要作用。BALF中巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)百分比升高可能提示大葉性肺炎病情較重。本文未對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)作進(jìn)一步描述，BALF中細(xì)胞形態(tài)學(xué)值得進(jìn)一步研究。

肺炎支原體是介于細(xì)菌與病毒之間能獨(dú)立生存的最小微生物，無(wú)細(xì)胞壁。近年來(lái)，呈大葉性肺炎改變的支原體肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）有逐漸增多的趨勢(shì)。高拷貝組BALF中NE%高于中拷貝組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），并且NE%與MP-DNA拷貝呈正相關(guān)。肺炎支原體感染宿主后，巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞攝取并處理抗原引起炎癥反應(yīng)。肺炎支原體可對(duì)上皮細(xì)胞造成持續(xù)損傷，使病原體易于在上皮細(xì)胞內(nèi)定植并出現(xiàn)大量繁殖，BALF細(xì)胞學(xué)檢查中性粒細(xì)胞比例升高［8］。本研究還發(fā)現(xiàn)BALF的NE%與BALF中IL-17正相關(guān)。在肺炎支原體感染時(shí)，IL-17能夠刺激人支氣管上皮細(xì)胞、肺纖維原細(xì)胞產(chǎn)生中性粒細(xì)胞，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。支原體侵犯肺部細(xì)胞時(shí)，IL-17通過(guò)強(qiáng)大的嗜中性粒細(xì)胞募集作用來(lái)清除病原體［9］，同時(shí)也刺激多種細(xì)胞產(chǎn)生大量前炎癥因子，與之協(xié)同作用，放大炎癥效應(yīng)［10］。

綜上所述，大葉性肺炎患兒BALF中常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢測(cè)對(duì)病情判斷及支原體感染有重要意義：大葉性肺炎發(fā)生時(shí)柱狀上皮細(xì)胞受損脫落，巨噬細(xì)胞趨化聚集參與炎癥反應(yīng)；肺炎支原體感染時(shí)，IL-17通過(guò)中性粒細(xì)胞募集作用發(fā)揮抗感染能力，BALF的NE%越高則局部支原體感染拷貝數(shù)越高。

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（曾文軍編輯）

Cell suspension and level of IL-17 in bronchoalveolar lavage fluid（BALF）of children with labor pneumonia combined with mycoplasma pneumonia and its clinical significance*

Yun-xiaWang1，Wen-guang Liu2，Qiang Gu2
（1.Medical College of Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832000，China；2.Departmentof Pediatrics，the First Affiliated Hospital of Medical College of Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832000，China）

Objective To explore cell suspension and level of IL-17 in bronchoalveolar lavage fluid（BALF）of children with labor pneumonia combined with mycoplasma pneumonia and its clinical significance.Methods 87 children with labor pneumonia who had been done BAL were divided into CPIS≥6 group and CPIS＜6 group according to the clinical pneumonia infection score（CPIS）.Meanwhile，according to the results of MP-DNA，we grouped the children above into combined with mycoplasma pneumonia infection group and no mycoplasma pneumonia infection group，then combined with mycoplasma pneumonia infection group into group ofMP-DNA:103～106and group of MP-DNA:106～.ELISA method was used to detect IL-17 level，HE staining and microscopy to sort cells，PCR detect MP-DNA.Results The percentage of neutrophils and lymphocytes in BALF are not related to that in blood（P＞0.05）.The percentage of columnar epithelial cells in CPIS＜6 group were higher than CPIS≥6，how－ever，macrophagocyte was lower（P＜0.05）.The percentage of neutrophils are related with both MP-DNA（r=0.48，P=0.000）and IL-17（r=0.49，P=0.000）.Conclusions The composition of BALF is more appropriate to react the circumstance of lobar pneumonia.When lobar pneumonia occurs，columnar epithelial cells are damaged，macrophagocyte gathered to participate in the inflammatory response.In Mycoplasma pneumonia infection group，IL-17 raises neutrophils to resist infection，NE%in BALF can indirectly reflect the mycoplasma infection degree.

labor pneumonia；mycoplasma pneumonia infection；BALF；conventional cells staining；interleukin-17；children

R 563.11；R 725.6

A

10.3969/j.issn.1007-1989.2016.02.007

1007-1989（2016）02-0030-04

2015-11-10

兵團(tuán)科技支疆計(jì)劃項(xiàng)目（No：2013AB027）

谷強(qiáng)，E-mail：guqiang106@sina.com；Tel：18999538901