程敬偉， 王 瑤， 侯 欣， 周夢蘭， 徐志鵬， 謝秀麗， 徐英春

·論著·

5種抗菌藥物體外抗厭氧菌活性研究

程敬偉， 王 瑤， 侯 欣， 周夢蘭， 徐志鵬， 謝秀麗， 徐英春

目的 研究氨芐西林-舒巴坦、阿莫西林-克拉維酸、厄他培南、甲硝唑和克林霉素對臨床多中心標(biāo)本分離厭氧菌的抗菌活性。方法 對179株厭氧菌進(jìn)行16S rRNA基因測序鑒定。藥敏試驗參考CLSI M11-A8文件，采用瓊脂稀釋法測定5種抗菌藥物對179株臨床分離厭氧菌的最低抑菌濃度（MIC）。結(jié)果 77株革蘭陰性厭氧桿菌中，56株擬桿菌屬細(xì)菌對厄他培南敏感率最高，為96.4 %，對克林霉素敏感率為39.3 %；21株革蘭陰性厭氧桿菌對氨芐西林-舒巴坦全敏感。43株革蘭陽性厭氧桿菌和54株革蘭陽性厭氧球菌，對氨芐西林-舒巴坦和厄他培南的敏感率較高（＞87.5 %），對克林霉素的耐藥率較高。結(jié)論 氨芐西林-舒巴坦、阿莫西林-克拉維酸、厄他培南對臨床常見厭氧菌保持較高的抗菌活性，不同菌屬細(xì)菌對甲硝唑耐藥率差異較大，對克林霉素耐藥率較高。

厭氧菌； 最低抑菌濃度； 耐藥性

厭氧菌在自然界廣泛分布，與人類有關(guān)的大多數(shù)厭氧菌為正常定值菌群或條件致病菌。機(jī)體深部組織損傷和免疫力低下是形成厭氧菌感染的重要原因。在感染性疾病中，厭氧菌感染占有很大比例，尤其是深部感染，嚴(yán)重者可危及生命[1]。厭氧菌常與需氧菌或兼性厭氧菌共同引起混合感染。厭氧菌感染既往多以經(jīng)驗用藥為主，隨著抗菌藥物的廣泛使用，厭氧菌的藥敏譜不斷變遷，耐藥率逐年增加，厭氧菌耐藥的問題在歐洲、美國、加拿大和新西蘭均有報道[2-4]，但我國目前尚缺乏大規(guī)模的流行病學(xué)資料。了解引起感染的厭氧菌耐藥性，對合理使用抗菌藥物及制定防治策略非常重要。

厭氧菌標(biāo)本的采集、運(yùn)輸、培養(yǎng)條件要求較高，且藥敏試驗操作復(fù)雜，制約了其在臨床微生物實驗室的常規(guī)開展。美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）僅推薦對導(dǎo)致重度感染如菌血癥、腦膿腫、心內(nèi)膜炎、骨髓炎及關(guān)節(jié)感染等厭氧菌或分離自無菌體液及經(jīng)驗治療失敗的菌株檢測藥敏。臨床治療厭氧菌感染通常經(jīng)驗性使用廣譜抗菌藥物，主要包括β內(nèi)酰胺類、β內(nèi)酰胺類-β內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合制劑、甲硝唑、氯霉素、克林霉素、大環(huán)內(nèi)脂類、四環(huán)素和喹諾酮類等[5]。本研究旨在通過多中心收集的厭氧菌檢測臨床常用的5種抗菌藥物包括氨芐西林-舒巴坦、厄他培南、克林霉素、阿莫西林-克拉維酸和甲硝唑的體外藥敏結(jié)果。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗菌株及來源 ①2010年6月－2011年9月收集10所醫(yī)院分離的146株厭氧菌，來源于外科腹腔感染和婦科盆腔感染患者感染部位標(biāo)本，所有標(biāo)本使用運(yùn)輸拭子（意大利COPAN公司）運(yùn)送至北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科細(xì)菌室，進(jìn)行厭氧菌培養(yǎng)。②2013年10月－2014年3月收集北京協(xié)和醫(yī)院血培養(yǎng)分離的厭氧菌33株。所有菌株均凍存于-80 ℃冰箱。179株厭氧菌中，包括13個菌屬，37個菌種。其中北京協(xié)和醫(yī)院52株，河北省人民醫(yī)院45株，北京世紀(jì)壇醫(yī)院26株，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院17株，北京大學(xué)人民醫(yī)院12株，天津市人民醫(yī)院9株，包頭市中心醫(yī)院7株，天津市南開醫(yī)院6株，第四軍醫(yī)大學(xué)附屬唐都醫(yī)院3株，山西醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院2株。質(zhì)控菌株為脆弱擬桿菌ATCC 25285和大腸埃希菌ATCC 25922。

1.1.2培養(yǎng)基 厭氧菌藥敏使用含有5 %（v/v）脫纖維羊血、氯化血紅素（5 mg/L）和維生素K1（1 mg/L）的強(qiáng)化布氏瓊脂培養(yǎng)基。布氏培養(yǎng)基為英國OXOID公司產(chǎn)品，血紅素和維生素K1為西格瑪奧德里奇公司產(chǎn)品；脫纖維羊血從萬峰動物飼養(yǎng)場購買。

1.1.3抗菌藥物 氨芐西林、舒巴坦、阿莫西林、克拉維酸、厄他培南、克林霉素購于中國食品藥品檢定研究院，甲硝唑購于德國Dr. Ehrenstorfer公司。其中氨芐西林-舒巴坦、阿莫西林-克拉維酸配比為2∶1。

1.2方法

1.2.1菌株鑒定 所有菌株采用16S rRNA基因測序技術(shù)進(jìn)行鑒定。擴(kuò)增引物為5F （5’ -TTGGA GAGTTTGATCCTGGCTC-3’）和1194R（5’ -ACGT CATCCCCACCTTCCTC-3’）。測序引物使用5F和810R（5’ -GGCGTGGACTTCCAGGGTATCT-3’），具體操作參考文獻(xiàn)報道[6]。

1.2.2MIC測定 參考CLSI 2012年版M11-A8[7]推薦的瓊脂稀釋法，對179株厭氧菌進(jìn)行藥敏試驗。使用日本Sakuma多點接種儀接種。藥敏平皿自然干燥后置于35 ℃孵箱厭氧培養(yǎng)48 h，觀察結(jié)果，質(zhì)控菌株同時參與試驗，所有厭氧菌同步進(jìn)行耐氧試驗。

1.2.3結(jié)果判讀及統(tǒng)計分析 藥敏結(jié)果判讀參考CLSI M11-A8文件標(biāo)準(zhǔn)[7]。折點參考2015年版M100-S25文件標(biāo)準(zhǔn)[8]。采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對藥敏結(jié)果進(jìn)行分析。

2　結(jié)果

2.1革蘭陰性厭氧菌

56株擬桿菌屬細(xì)菌對厄他培南敏感率最高，為96.4 %，對阿莫西林-克拉維酸和甲硝唑也保持著較高的敏感率，分別89.3 %和87.5 %，對克林霉素敏感率僅為39.3 %。10株普雷沃菌屬對氨芐西林-舒巴坦、阿莫西林-克拉維酸和厄他培南均敏感。6株不解糖卟啉單胞菌中2株對克林霉素耐藥，對其余4種藥物保持較高的敏感性，而5株柯氏動彎桿菌均對克林霉素耐藥。5株小韋榮球菌中，4株對甲硝唑耐藥。見表1。

2.2革蘭陽性厭氧桿菌

18株乳桿菌屬細(xì)菌對氨芐西林-舒巴坦、阿莫西林-克拉維酸完全敏感，僅1株對厄他培南耐藥，但全部對甲硝唑耐藥，對克林霉素的敏感率也僅為27.8 %。11株梭菌屬細(xì)菌對氨芐西林-舒巴坦、阿莫西林-克拉維酸、厄他培南和甲硝唑的敏感率均在90 %以上，對克林霉素的敏感率僅為45.5 %。8株痤瘡丙酸桿菌對氨芐西林-舒巴坦、阿莫西林 -克拉維酸、厄他培南保持較高的敏感率，但均對甲硝唑耐藥。見表1。

2.3革蘭陽性厭氧球菌

54株革蘭陽性厭氧球菌均對氨芐西林-舒巴坦敏感，對厄他培南的敏感率在90 %以上，對阿莫西林-克拉維酸的敏感率為77.8 %～92 %。對甲硝唑的敏感率為55.6 %～77.8 %。對克林霉素的耐藥率較高，其中嗜胨菌屬、消化鏈球菌屬及大芬格爾德菌耐藥率超過65 %。見表1。

表1　5種抗菌藥物對179株臨床厭氧菌的抗菌活性Table 1 In vitro activity of fi ve antimicrobial agents against 179 strains of anaerobic bacteria

表1?。ɡm(xù)）Table 1（continued）

3　討論

與人類有關(guān)的大多數(shù)厭氧菌為正常定值菌群或條件致病菌。腦膿腫、肝膿腫，以及接受免疫抑制劑等引起的內(nèi)源性厭氧菌感染和長期慢性消耗性疾病誘發(fā)的繼發(fā)性厭氧菌感染臨床上較為常見[9]。傳統(tǒng)認(rèn)為的“無菌性”感染通常是未檢測厭氧菌而得出的錯誤認(rèn)識。厭氧菌感染既往多以經(jīng)驗用藥為主，但隨著抗菌藥物的廣泛使用，厭氧菌的耐藥譜不斷變遷，耐藥率逐年增高[10]。了解臨床常見厭氧菌感染的病原譜和藥敏譜對抗感染治療十分重要。

本課題為多中心參與的厭氧菌藥物敏感性研究。研究納入了179株臨床分離厭氧菌，共13個菌屬，37個菌種，覆蓋范圍廣，且所有菌株經(jīng)16S r RNA基因測序技術(shù)鑒定至種水平，參考CLSI推薦的瓊脂稀釋法進(jìn)行藥敏檢測，研究常見病原菌的藥敏譜。研究發(fā)現(xiàn)，最常見的厭氧菌感染為擬桿菌屬細(xì)菌，其對厄他培南敏感率最高，為96.4 %，與德國的一項多中心研究相似[11]；對克林霉素的耐藥率超過50 %，接近歐洲、韓國和中國臺灣的報道[2，12-13]，對阿莫西林-克拉維酸和甲硝唑的敏感率在80 %以上。小韋榮球菌對甲硝唑耐藥率較高，其他革蘭陰性厭氧菌對氨芐西林-舒巴坦、阿莫西林-克拉維酸、厄他培南保持較高的敏感性。革蘭陽性桿菌中，丙酸桿菌屬和乳桿菌屬細(xì)菌均對甲硝唑耐藥，其余厭氧菌對氨芐西林-舒巴坦、阿莫西林-克拉維酸、厄他培南和甲硝唑的敏感率較高，對克林霉素敏感率較低。克林霉素的應(yīng)用是誘發(fā)艱難梭菌感染的風(fēng)險因素[14]。革蘭陽性球菌中，對氨芐西林-舒巴坦、厄他培南的敏感率超過90 %，與美國和歐洲的報道相似[15]，對甲硝唑的敏感率僅為70 %左右，對克林霉素的耐藥率較高，顯著高于國外的報道（7 %～20 %）[10]。韓國和加拿大的2項研究表明克林霉素的敏感率在逐漸下降[16-17]，同樣，我們的研究發(fā)現(xiàn)厭氧菌對5種抗菌藥物中克林霉素的敏感率最低，這可能與克林霉素在中國的廣泛應(yīng)用相關(guān)[18]。

因此，臨床常見厭氧菌對氨芐西林-舒巴坦、阿莫西林-克拉維酸、厄他培南保持較高的敏感率，但對克林霉素的耐藥率較高。臨床微生物實驗室應(yīng)監(jiān)測厭氧菌耐藥性的變遷，并進(jìn)一步研究其耐藥機(jī)制，提高實驗室診斷能力，為臨床合理使用抗菌藥物提供有效的數(shù)據(jù)支撐。

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In vitro activity of fi ve antimicrobial agents against anaerobic bacteria

CHENG Jingwei, WANG Yao, HOU Xin, ZHOU Menglan, XU Zhipeng, XIE Xiuli, XU Yingchun. （Department of Clinical Laboratory, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100730, China）

Objective To determine the in vitro activity of ampicillin-sulbactam, amoxicillin-clavulanic acid, clindamycin, ertapenem and metronidazole against the anaerobes isolated from multi-center clinical specimens. Methods All the 179 anaerobic isolates were identifi ed by 16S rRNA gene sequencing. The MICs were determined by CLSI agar dilution method according CLSI document M11-A8. Results Ertapenem showed the highest susceptibility (96.4 %) against the 56 bacteroides group strains, while clindamycin showed the lowest activity (39.3 % susceptible). The remaining 21 strains of gram negative bacilli were all sensitive to ampicillin-sulbactam. In addition, ampicillin-sulbactam and ertapenem showed high activity against the 43 strains of gram positive bacilli and 54 strains of gram positive cocci (at least 87.5 % susceptible). The antimicrobial activity of clindamycin was much lower. Conclusions Ampicillin-sulbactam, amoxicillin-clavulanic acid, and ertapenem showed high activity against most of the clinical anaerobic strains. The activity of metronidazole differed much among different species. Clindamycin showed the lowest antianaerobic activity.

anaerobe; minimum inhibitory concentration; antibiotic resistance

R378；R978.1

A

1009-7708 ( 2016 ) 06-0755-06

10.16718/j.1009-7708.2016.06.014

國家衛(wèi)生計生委公益性行業(yè)科研專項（201402001）。

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730。

程敬偉（1989—），男，博士研究生，主要從事微生物鑒定及耐藥機(jī)制研究。

徐英春，E-mail：xycpumch@139.com。

2015-12-01

2016-03-23