沈平華， 仉 英， 蔣曉飛

·論著·

肺炎克雷伯菌攜帶碳青霉烯酶KPC-2基因環(huán)境多態(tài)性研究

沈平華1， 仉 英2， 蔣曉飛1

目的 研究復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌廣泛播散初期攜帶blaKPC-2的完整基因結(jié)構(gòu)，獲得其播散的基因背景。方法 收集2006年8月―2009年12月連續(xù)不重復(fù)的碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌42株，進(jìn)行質(zhì)粒抽提、blaKPC-2篩選、多位點(diǎn)序列分型（MLST）；隨后設(shè)計(jì)一系列PCR引物，對(duì)blaKPC-2基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行完整測(cè)序。結(jié)果 MLST分型顯示：34株屬于ST11型，5株屬于ST423，2株屬于ST65，1株屬于ST977。主要發(fā)現(xiàn)兩種攜帶blaKPC-2基因結(jié)構(gòu)，A型（8/42）：Tn1721-blaKPC-2-Tn3；B型（34/42）：Tn1721-blaKPC-2-ΔTn3-IS26，且B型結(jié)構(gòu)的兩端序列存在差異。結(jié)論 該組中肺炎克雷伯菌攜帶blaKPC-2的基因結(jié)構(gòu)存在多態(tài)性，Tn1721-blaKPC-2-ΔTn3-IS26樣結(jié)構(gòu)占優(yōu)勢(shì)。研究獲得的攜帶blaKPC-2基因結(jié)構(gòu)及側(cè)翼的完整序列，為進(jìn)一步正確認(rèn)識(shí)和理解blaKPC-2的播散模式和機(jī)制提供了完整的基因背景。

肺炎克雷伯菌； 碳青霉烯類耐藥； KPC-2； 基因環(huán)境

碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌的全球蔓延，已經(jīng)成為臨床治療的巨大難題。KPC （Klebsiella pneumoniae carbapenemases）是導(dǎo)致肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類耐藥的主要原因[1-2]，而KPC-2是KPC中最常見(jiàn)的類型之一[3]。

2007年，中國(guó)浙江杭州地區(qū)出現(xiàn)了首個(gè)關(guān)于KPC-2的報(bào)道，該報(bào)道中blaKPC-2位于一株臨床肺炎克雷伯菌的質(zhì)粒pKP048（GenBank accession no： FJ628167.2）上[4]，通過(guò)全質(zhì)粒測(cè)序可知blaKPC-2位于一個(gè)完整的Tn1721樣轉(zhuǎn)座子中。此后，在上海地區(qū)的一株臨床肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒pKPHS2 （GenBank accession no： CP003224.1） 上Tn1721結(jié)構(gòu)被IS26在Tn3的tnpR處打斷，造成tnpATn3和IRL2Tn1721的丟失，形成了Tn1721-blaKPC-2-ΔTn3-IS26樣的新結(jié)構(gòu)[5]。

blaKPC-2的基因環(huán)境是了解blaKPC-2播散途徑的重要信息，是進(jìn)行有效醫(yī)院感染控制的基礎(chǔ)。本研究將華山醫(yī)院自第1株碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌的檢出到該耐藥細(xì)菌廣泛播散的這段時(shí)期內(nèi)耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌作為一個(gè)完整的樣本，應(yīng)用PCR及測(cè)序獲得攜帶blaKPC-2完整的基因結(jié)構(gòu)及側(cè)翼序列，希望為下一步深入研究該耐藥基因的播散機(jī)制提供全面的基因背景。

1　材料與方法

1.1菌株來(lái)源和藥敏試驗(yàn)

收集上海華山醫(yī)院2006年8月－2009年12月連續(xù)不重復(fù)的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌，共42株。全部菌株使用法國(guó)生物梅里埃公司VITEKAMS 60全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定菌種。肺炎克雷伯菌ATCC 700603和大腸埃希菌ATCC 25922購(gòu)自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。按照CLSI推薦的紙片擴(kuò)散法（K-B法）進(jìn)行抗菌藥物敏感性測(cè)試，根據(jù)CLSI 2014年版標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果。藥敏紙片均購(gòu)自英國(guó) OXOID公司。

1.2方法

1.2.1質(zhì)粒抽提與耐藥基因blaKPC-2的篩選 采用Qiagen Plasmid Midi kit （Qiagen公司， 德國(guó)）抽提野生株質(zhì)粒，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的DNA模板。Taq DNA聚合酶購(gòu)自美國(guó)Promega公司。采用引物KPCFOR：5'-TCGCTAAACTCGAACAGG-3' 和 KPCREV：5'-TTACTGCCCGTTGACGCCCAATCC-3'[6]，以抽提的質(zhì)粒為模板，對(duì)42株細(xì)菌進(jìn)行PCR，將PCR產(chǎn)物送上海邁浦生物科技有限公司純化后正反雙向測(cè)序。

1.2.2多為點(diǎn)序列分型（MLST） 擴(kuò)增肺炎克雷伯菌基因組上的7個(gè)管家基因：gapA、 infB、 mdh、pgi、 phoE、 rpoB、 tonB，將PCR產(chǎn)物送上海邁浦生物科技有限公司純化后測(cè)序。參照肺炎克雷伯菌MLST分型網(wǎng)站（http：//www.pasteur.fr/recherche/ genopole/PF8/mlst/Kpneumoniae.html）提供的步驟進(jìn)行分型。

1.2.3攜帶blaKPC-2的基因環(huán)境分析 根據(jù)pKP048和pKPHS2的序列，設(shè)計(jì)了一系列PCR引物（圖 1和表1）進(jìn)行擴(kuò)增與測(cè)序，分別用于檢測(cè)本批菌株中是否存在與上述已經(jīng)報(bào)道的blaKPC-2基因環(huán)境相同的結(jié)構(gòu)。Junction PCR的引物主要用于確定攜帶blaKPC-2基因結(jié)構(gòu)的界限和區(qū)分pKP048和pKPHS2上結(jié)構(gòu)差異的關(guān)鍵序列，Mapping PCR主要用于擴(kuò)增攜帶blaKPC-2基因結(jié)構(gòu)的主干部分，包括M1、M2、 M3、 M4、 M5和M6，見(jiàn)圖1。結(jié)合后續(xù)的Crossing PCR可以覆蓋整個(gè)基因環(huán)境的序列。PCR陽(yáng)性產(chǎn)物純化后測(cè)序。

根據(jù)Junction PCR和Mapping PCR的結(jié)果，當(dāng)出現(xiàn)區(qū)別于以上兩種結(jié)構(gòu)的新結(jié)構(gòu)時(shí)，擬采用代表性質(zhì)粒測(cè)序及以純質(zhì)粒為模板進(jìn)行 PCR 步移測(cè)序等，獲得整個(gè)新結(jié)構(gòu)的完整基因環(huán)境的序列。引物均由北京六合華大基因科技有限公司（上海分公司）合成。

2　結(jié)果

2.1菌株情況和藥敏結(jié)果

共收集到42株不重復(fù)的碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌：2006年1株，2007年3株，2008年6株，2009年32株。其中13株來(lái)源于尿液，27株來(lái)源于痰液，2株來(lái)源于血液。所有菌株均對(duì)亞胺培南和美羅培南等碳青霉烯類藥物耐藥。

2.2blablaKPC-2KPC-2的篩選和MLST分型LST

對(duì)抽提質(zhì)粒，采用blaKPC特異性引物進(jìn)行PCR及測(cè)序，結(jié)果顯示質(zhì)粒上均攜帶有blaKPC-2基因。42株耐藥肺炎克雷伯菌 （MLST）分型顯示：34株為ST11型，5株屬于ST423，2株為ST65，1株為ST977。主要的流行型別為ST11型，這與QI等[7]報(bào)道一致。

2.3攜帶 blablaKPC-2KPC-2的基因環(huán)境分析

Junction PCR和Mapping PCR結(jié)果見(jiàn)表2，圖2展示了所有菌株攜帶blaKPC-2的基因結(jié)構(gòu)及該結(jié)構(gòu)兩側(cè)的序列。本批菌株檢測(cè)到了與pKP048和pKPHS2不同的blaKPC-2的基因環(huán)境，存在多態(tài)性。

A型為Tn1721-blaKPC-2-Tn3樣結(jié)構(gòu)，顯示具備與pKP048相似的blaKPC-2的基因環(huán)境，但仍存在差異，表現(xiàn)為Tn1721的IRR上游序列為parA基因，而不是pKP048的ΔIS26；Tn3的IRL后直接連接一個(gè)DNA distortion protein 3-like基因，而不是Tn1721的IRL2。代表性質(zhì)粒為pHS062105-3（GenBank accession no： KF623109.1）。A型結(jié)構(gòu)，分別位于ST423、ST65、ST97型菌株中。

圖1　Junction PCR和 Mapping PCR引物設(shè)計(jì)示意圖Figure 1 Schematic map of primer annealing sites for Junction PCR and Mapping PCR

表1　用于本研究PCR的引物Table 1 Primers used in this study

表2　blaKPC-2陽(yáng)性肺炎克雷伯菌MLST分型與Junction和Mapping PCR結(jié)果Table 2 MLST genotyping of blaKPC-2-carrying K. pneumoniae isolates and the result of Junction PCR and Mapping PCR

圖2　A型與B1、B2結(jié)構(gòu)攜帶blaKPC-2基因結(jié)構(gòu)示意圖Figure 2 Schematic representations of blaKPC-2-bearing genetic elements

Genes are depicted as arrows according to the direction of transcription. blaKPC-2is indicated in dark gray. Inverted repeats are indicated by colorvariable， vertical bars shown in corresponding matching colors： Tn1721 （black）， Tn3 （white） and IS26 （gray）. Regions sharing identical or nearidentical sequence across plasmids are indicated by the gray shading between the representations of different plasmids.

B1型顯示具有與pKPHS2相同的blaKPC-2的基因環(huán)境，即Tn1721- blaKPC-2-ΔTn3-IS26。且該結(jié)構(gòu)外圍也具備相同的基因結(jié)構(gòu)，即Tn1721的IRR上游連接ΔIS26，IS26下游連接TniA基因。代表質(zhì)粒為pHS082416 （GenBank accession no：KF724507.1）。

B2型與B1型唯一的區(qū)別是J1陰性，以純質(zhì)粒為模板，應(yīng)用引物2R向一側(cè)步移測(cè)序。該型Tn1721的IRR上游序列與肺炎克雷伯菌JM45 plasmid p2 （GenBank accession no：CP006658.1）上的一個(gè)功能未知的蛋白序列高度一致，與ΔIS26無(wú)相似性。代表型質(zhì)粒為pHS092753 （GenBank accession no： KF826293.1）。B2和B1結(jié)構(gòu)中IS26的下游均連接著TniA基因。綜上，B1和B2存在相同的骨干結(jié)構(gòu)，且均位于ST11型菌株中。

3　討論

華山醫(yī)院分離的第1株碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌為ST423型，而廣泛播散時(shí)流行的菌株型別為ST11型，區(qū)別于國(guó)外流行的ST258型[8]，同時(shí)也提示碳青霉烯類耐藥性存在菌株間水平傳播。

華山醫(yī)院自碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌出現(xiàn)初期，即存在blaKPC-2基因環(huán)境的多態(tài)性，提示其blaKPC-2播散可能存在不同的來(lái)源，為blaKPC-2播散的流行病學(xué)調(diào)查提供了研究依據(jù)。A型首先被發(fā)現(xiàn)，并可以穩(wěn)定存在于不同ST型別的肺炎克雷伯菌中；B型出現(xiàn)晚于A型，推測(cè)可能是A型在結(jié)構(gòu)上發(fā)生變化而形成，也有可能是外源性侵入而在醫(yī)院內(nèi)廣泛播散。尤其B1與B2存在不同的側(cè)翼序列，推測(cè)該結(jié)構(gòu)是一種新型的嵌合型可移動(dòng)元件，可能具備水平轉(zhuǎn)移的能力，轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)生了不同位置的插入。

在歐美，導(dǎo)致KPC-2廣泛播散的原因是編碼該酶的基因blaKPC-2主要位于活躍的轉(zhuǎn)座子（Tn4401）上[9]。中國(guó)大陸地區(qū)至今還沒(méi)有一例關(guān)于Tn4401攜帶blaKPC-2的報(bào)道。與歐美截然不同的基因環(huán)境，提示該耐藥基因在中國(guó)可能存在不同的水平轉(zhuǎn)移機(jī)制。

本研究在方法上也有一定的創(chuàng)新：克服了采用全質(zhì)粒測(cè)序后獲得攜帶blaKPC-2基因環(huán)境費(fèi)時(shí)費(fèi)力及難以進(jìn)行大樣本分析的弊端；同時(shí)以往的研究中，通常只是分析blaKPC-2上下游的一小段序列[4，10-12]，而本研究完整展示了攜帶blaKPC-2基因環(huán)境，為進(jìn)一步分析該結(jié)構(gòu)可能的移動(dòng)模式和機(jī)制提供了有價(jià)值的基因背景。PCR結(jié)合測(cè)序獲取耐藥基因周圍環(huán)境的方法簡(jiǎn)單實(shí)用，可以推廣至其他耐藥基因周圍環(huán)境序列的檢測(cè)。

本研究的局限性在于只檢測(cè)了碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌廣泛播散初期2006－2009年攜帶blaKPC-2的基因環(huán)境，同時(shí)鑒于碳青霉烯類耐藥還廣泛存在于其他腸桿菌科細(xì)菌中的事實(shí)，下一步研究將在菌株收集的時(shí)間和種類上進(jìn)一步擴(kuò)展，以獲得華山醫(yī)院耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌攜帶blaKPC-2的基因環(huán)境，為控制醫(yī)院感染提供有價(jià)值的信息。

研究顯示，華山醫(yī)院碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌的主要流行株為ST11型，且臨床數(shù)據(jù)顯示攜帶耐藥基因blaKPC-2的基因環(huán)境存在多態(tài)性，提出該耐藥基因的水平播散可能存在不同的機(jī)制，為下一步研究該耐藥基因的水平播散模式和機(jī)制奠定了研究基礎(chǔ)。

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Diversity of genetic environment of carbapenem-hydrolyzing β-lactamase KPC-2 among Klebsiella pneumoniae

SHEN Pinghua, ZHANG Ying, JIANG Xiaofei. （Department of Laboratory Medicine, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China）

Objective This study was designed to determine the genetic structure bearing blaKPC-2, which prevailed in the clinical K. pneumoniae isolates recovered in Huashan Hospital, Fudan University, and examine the genetic background of blaKPC-2prevalence. Methods Forty-two consecutive and nonduplicate K. pneumoniae strains isolated during the period from August 2006 to December 2009 were included in this study. All strains were subjected to plasmid extraction, blaKPC-2detection, and multilocus sequence typing (MLST). A series of primers were designed to analyze the genetic environment of the blaKPC-2gene. Results MLST genotyping showed that 34 of the K. pneumoniae isolates belonged to ST11, five to ST423, two to ST65 and one to ST977. Two types of blaKPC-2-bearing genetic structures were identifi ed: type A (8/42): Tn1721-blaKPC-2-Tn3; type B (34/42): Tn1721-blaKPC-2-ΔTn3-IS26. The fl anking sequence of type B was distinct. Conclusions The genetic environment of blaKPC-2is diverse. Tn1721-blaKPC-2-ΔTn3-IS26 is the dominant chimeric structure bearing blaKPC-2in this set of clinical K. pneumoniae isolates. The complete genetic structure bearing blaKPC-2and the fl anking sequences characterized in this study will help to further understanding of the mode and mechanism of blaKPC-2dissemination.

Klebsiella pneumoniae; carbapenem resistance; KPC-2; genetic environment

R378.996

A

1009-7708 ( 2016 ) 06-0680-05

10.16718/j.1009-7708.2016.06.002

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81572031）。

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，上海 200040；2. 復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)科。

沈平華（1989—），女，碩士研究生，現(xiàn)在同濟(jì)大學(xué)附屬第一婦嬰保健院檢驗(yàn)科工作，主要從事腸桿菌科細(xì)菌耐藥機(jī)制研究。

蔣曉飛，E-mail：jiangxi2154@aliyun.com。

2016-01-06

2016-02-17