胡 骕 彭 彪 羅冬冬 趙海林 李 丹 賀穎芳

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院神經(jīng)外科 廣州 510095

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異氟醚對(duì)膠質(zhì)瘤C57BL/6小鼠的抑瘤作用研究

胡 骕 彭 彪 羅冬冬 趙海林 李 丹 賀穎芳

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院神經(jīng)外科 廣州 510095

目的 探討吸入性麻醉藥物異氟醚對(duì)膠質(zhì)瘤C57BL/6小鼠的抑瘤作用和機(jī)制。方法 將36只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為空白組、模型對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組12只。采用腦膠質(zhì)瘤立體定向技術(shù)進(jìn)行U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞植入造模；采用核磁共振成像檢查(MRI)與蘇木精-伊紅(HE)染色評(píng)價(jià)造模成瘤與異氟醚干預(yù)后作用；采用熒光定量法檢測腦組織勻漿中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6的表達(dá)水平；采用蛋白印跡法檢查核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 第20天實(shí)驗(yàn)組腫瘤直徑明顯小于對(duì)照組(1.2±0.5mm vs 1.7±0.3mm)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HE染色病理表現(xiàn)提示實(shí)驗(yàn)組稍好于對(duì)照組，可能有一定抑制作用。實(shí)驗(yàn)組TNF-α mRNA表達(dá)量顯著少于對(duì)照組(P<0.05)，而IL-1β與IL-6表達(dá)量亦相對(duì)少于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組NF-κB p65表達(dá)與模型組相比有明顯降低(0.323±0.011 vs 0.512±0.016)，但仍然高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 吸入性麻醉藥物異氟醚能夠抑制膠質(zhì)瘤的快速生長，其作用機(jī)制主要是通過抑制NF-κB p65的表達(dá)，從而減少腦組織T輔助細(xì)胞炎癥因子，起到負(fù)調(diào)控NF-κB的活化作用。

膠質(zhì)瘤；異氟醚；核轉(zhuǎn)錄因子-κB；C57BL/6小鼠

腦膠質(zhì)瘤是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤之一，成人發(fā)病率為3～5/10萬，具有高發(fā)病率、高度侵襲性與高病死率的特點(diǎn)。其發(fā)病機(jī)制尚未闡明，放化療雖然可以局部抑制膠質(zhì)瘤的生長，但耐藥性與輻射抵抗性嚴(yán)重制約臨床療效[1]。研究證明，術(shù)后腫瘤細(xì)胞對(duì)放、化療不敏感是與核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor，NF)-κB的活性增高有關(guān)[2]。再者，研究也表明麻醉藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移也有一定影響，可以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的發(fā)生，并且激活炎性因子水平變化，從而影響腫瘤的增殖[3]。為此，我們基于NF-κB信號(hào)通路研究異氟醚對(duì)C57 BL/6 膠質(zhì)瘤小鼠的作用，探討麻醉藥物異氟醚抑制膠質(zhì)瘤的具體途徑和機(jī)制，為特異而有效的個(gè)體化膠質(zhì)瘤治療方案提供一定的基礎(chǔ)研究依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料 U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生物學(xué)研究所。C57BL/6 小鼠，SPF級(jí)，雄性，平均體質(zhì)量20～25 g，空白組、實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組各12只，共36只；購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(生產(chǎn)許可證：SCXX粵2013-0002)。

1．2 器材與試劑 10%胎牛血清(Gibco)DMEM培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)用電鉆1臺(tái)，江灣II型立體定位儀，廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院影像學(xué)系場強(qiáng)飛利浦1.5T MR機(jī)，小鼠NF-κB p65抗體與抗兔二抗購自美國CST公司。

1．3 方法

1．3．1 膠質(zhì)瘤小鼠模型的建立：采用立體定向技術(shù)，取對(duì)數(shù)生長期U251細(xì)胞，經(jīng)0.25 %胰蛋白酶消化，離心去上清，而后用去血清維持DMEM離心洗滌2次，計(jì)細(xì)胞數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度，重懸于PBS中，置于37 ℃水浴備用。小鼠以1%戊巴比妥鈉按40 mg/kg 腹腔注射，麻醉生效后將小鼠固定于立體定向儀上，剪去頭頂部眼裂至外耳道之間的毛發(fā)，常規(guī)消毒鋪單后于中線處眼裂后作一長約1.0 cm垂直切口，暴露前囟，取其前方1.0 mm ，右側(cè)距中線1.0 mm處鉆孔，其直徑約為1.0 mm；接種U251細(xì)胞，從恒溫水浴中取出配好的細(xì)胞懸液，以10 μL微量注射器吸取4 μL(含G L261 細(xì)胞約1×105個(gè))，調(diào)整移動(dòng)架位置，使針尖位于骨孔處，緩慢垂直進(jìn)針2 mm，抽吸略后退后注入細(xì)胞懸液，注射時(shí)間持續(xù)10 min，緩慢拔針，約3 min。以骨蠟封閉骨窗，逐層縫合關(guān)顱，固定于電極移動(dòng)架上。觀察各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生活狀態(tài)及生存周期；MRI 檢查實(shí)驗(yàn)10 d、20 d腫瘤的生長情況；MRI成像予釓噴替酸葡甲胺0.2 mmol/kg注射后，T1加權(quán)掃描。

1．3．2 小鼠模型吸入性麻醉藥物的處理：建模后10 d與20 d，實(shí)驗(yàn)組予1.4%異氟醚吸入，同時(shí)在100%氧氣的環(huán)境下作用2 h；模型對(duì)照組只接受2 h100%氧氣的作用；2組氣體通過小鼠麻醉室的流速相同。小鼠麻醉室的溫度控制在(37±0.5)℃；2 h后，將小鼠轉(zhuǎn)移到通有100%氧氣的飼養(yǎng)室中，直到小鼠恢復(fù)翻正反射。

1．3．3 細(xì)胞和組織的準(zhǔn)備：第20天頸椎脫臼法處死，常規(guī)方法取小鼠腦組織。將細(xì)胞或組織在細(xì)胞或組織裂解液中進(jìn)行勻漿和裂解。將得到的裂解液或勻漿液收集入EP管中，13 000 r/min離心15 min備用。常規(guī)HE染色，以10 %甲醛固定24 h ，石蠟包埋；組織切片機(jī)切成5 μm切片，HE染色，光鏡下檢查。

1．3．4實(shí)驗(yàn)室檢查：熒光定量PCR法檢測三組腦組織勻漿中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平。其中，TNF-α引物序列：上游5’-TACTGAACTTCGGGGTGA-’3，下游5’-ACTTGGTGGTTTGCTACG-’3；IL-1β引物序列：上游5’-GGCAGTATCACTCATTGTG-’3，下游5’-CTCCACTTTGCTCTTGAC-’3；IL-6引物序列：上游5’-GCCTTCTTGGGACTGATC-’3，下游5’-AGGTCTGTTGGGAGTGGTA-’3；內(nèi)參β-actin引物序列：上游5’-CTACAATGAGCTGCGTGTG-’3，下游5’-GCGTGAGGGAGAGCATAG-’3)。PCR反應(yīng)產(chǎn)物的相對(duì)定量分析，測得的目的基因的表達(dá)水平，均有該樣本內(nèi)參β-actin基因校正，以2-△△Ct方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。

Western blot蛋白印跡法定量檢測NF-κB p65蛋白水平，掃描儀掃描膠片，采用Quantity One 4.61軟件進(jìn)行條帶的灰度分析，計(jì)算p65/β-actin比值，表示p65蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2．1 小鼠生存基本情況 C57BL/6小鼠接種后第5～7天自行覓食、飲水較常減少，體質(zhì)量及警覺性均明顯下降；第15～20天出現(xiàn)行動(dòng)遲緩、運(yùn)動(dòng)時(shí)身體向一側(cè)偏斜，雙眼稍見突起，注射側(cè)頭頂部隆起等表現(xiàn)。第20天吸入麻醉藥物后，未見死亡，但行動(dòng)、警覺性較前明顯減弱，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均能恢復(fù)翻正反射。

2．2 MRI影像學(xué)表現(xiàn) 2組C57BL/6 小鼠接種后10 d MRI 檢查顯示腫瘤均已形成，實(shí)驗(yàn)組主要表觀為腫瘤直徑(0.5±0.3)mm，長T1長T2信號(hào)，不均勻強(qiáng)化，邊不清；對(duì)照組腫瘤直徑(0.6±0.2)mm，長T1長T2信號(hào)，不均勻強(qiáng)化，邊不清。20 d MRI 檢查顯示實(shí)驗(yàn)組腫瘤直徑(1.2±0.5)mm，長T1長T2信號(hào)，不均勻強(qiáng)化，邊不清；對(duì)照組(1.7±0.3)mm，且長T1長T2信號(hào)，不均勻強(qiáng)化，中線結(jié)構(gòu)移位。20 d實(shí)驗(yàn)組腫瘤直徑明顯小于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2．3 病理表現(xiàn) HE染色光鏡下觀察實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞呈圓形或梭形，腫瘤細(xì)胞排列紊亂，可見生長活躍的膠質(zhì)瘤細(xì)胞密集成群，并趨向正常腦組織浸潤生長。對(duì)照組腫瘤細(xì)胞細(xì)胞核呈多角或條形，核分裂相多見，細(xì)胞質(zhì)較少，中心部位由于腫瘤生長過快可見壞死表現(xiàn)；腦組織與腫瘤交界處可見到腫瘤細(xì)胞侵入腦實(shí)質(zhì)，邊界不清。HE染色病理表現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組稍好于對(duì)照組，可能有一定抑制作用(見圖1)。

對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)組圖1 C57BL/6小鼠膠質(zhì)瘤組織HE染色(400×)

2．4 腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表達(dá)量 經(jīng)熒光定量PCR檢測，實(shí)驗(yàn)組TNF-α mRNA表達(dá)量顯著少于對(duì)照組(t=11.90，P=0.00)；而IL-1β與IL-6表達(dá)量亦相對(duì)少于對(duì)照組，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1 。

表1 腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表達(dá)量

2．5 腦組織NF-κB p65的表達(dá)水平 實(shí)驗(yàn)組NF-κB p65表達(dá)與模型組相比有明顯降低，但仍然高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 腦組織 NF-κB p65的表達(dá)水平

3 討論

惡性腫瘤的主要特征為細(xì)胞的無限增殖，而且具有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)移性，侵襲到其他組織，治療不利使生存時(shí)間顯著縮短[4]。麻醉藥物在腫瘤的放化療及外科手術(shù)中均有應(yīng)用，特別是在惡性腫瘤的切除手術(shù)中應(yīng)用更為廣泛[5]，但是麻醉藥物對(duì)腫瘤的作用及其機(jī)制尚未闡明，因此麻醉藥物與腫瘤發(fā)展關(guān)系的研究將成為未來腫瘤研究的一個(gè)熱點(diǎn)領(lǐng)域[6]。

現(xiàn)代研究表明，NF-κB信號(hào)通路具有雙向效應(yīng)，需要精確調(diào)控；過度激活的NF-κB會(huì)導(dǎo)致大量炎性因子表達(dá)，對(duì)機(jī)體帶來免疫損傷，減低機(jī)體對(duì)放化療的耐受性[7]。再者，研究表明膠質(zhì)瘤的發(fā)展與局部免疫抑制機(jī)制有重要的聯(lián)系[8]。上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組經(jīng)吸入性麻醉藥物異氟醚干預(yù)后能夠抑制NF-κB p65的表達(dá)，而且能夠減少腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6從而達(dá)到負(fù)調(diào)控NF-κB信號(hào)的作用。

綜上，吸入性麻醉藥物異氟醚雖然不能中斷C57BL/6小鼠膠質(zhì)瘤的發(fā)展，但卻能夠一定程度上抑制膠質(zhì)瘤的快速生長，其作用機(jī)制主要是通過抑制NF-κB p65的表達(dá)，從而減少腦組織T輔助細(xì)胞炎癥因子起到負(fù)調(diào)控NF-κB的活化作用。然而，NF--κB還參與了細(xì)胞凋亡、增殖等其他細(xì)胞生物過程，為此我們尚需繼續(xù)深入探討吸入性麻醉藥的其他作用機(jī)制，為提高放化療療效與腫瘤個(gè)體化治療提供基礎(chǔ)研究依據(jù)。

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(收稿2015-12-20)

廣州醫(yī)科大學(xué)青年項(xiàng)目：2013A38 ；廣州市屬高校科研項(xiàng)目：1201430219

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1673-5110(2016)21-0057-03