張愛民++郝海燕++郝旺勝++馬振華

[摘要] 目的 探討斑貞1號、川芎嗪（TMP）和五氟尿嘧啶（5-FU）聯(lián)合逆轉人胃癌細胞系SGC-7901/ADR與ERCC1表達的影響。 方法 采用半定量逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR），監(jiān)測人胃癌細胞SGC-7901/ADR細胞在5-FU組、斑貞1號組、斑貞1號+5-FU組、斑貞1號+5-FU+TMP組切除修復交叉互補基因1（ERCC1）mRNA的表達情況。 結果 5-FU組與陰性對照組比較，ERCC1 mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），而5-FU聯(lián)合中藥斑貞1號及TMP處理組ERCC1mRNA表達量明顯升高（P<0.05）。 結論 斑貞1號、TMP和5-FU聯(lián)合逆轉SGC-7901/ADR細胞耐藥性可能與ERCC1基因相關，為當前胃癌的治療提供了新的理論依據(jù)。

[關鍵詞] 胃癌；斑貞1號；TMP；5-FU；多藥耐藥；ERCC1基因

[中圖分類號] R735.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）26-0034-03

胃癌是中國常見的惡性腫瘤之一，至今為止手術仍是胃癌的主要治療方法，因早癌診斷率低，70%患者失去手術機會，所以化療顯得非常重要，但目前最大的問題是胃癌多藥耐藥性（MDR），近幾年發(fā)現(xiàn)[1，2]ERCC1參與胃癌的多藥耐藥，并起重要作用，本課題組侯培珍等[3]研究結果示斑貞1號、5-FU和TMP聯(lián)合對人胃癌有逆轉作用。本課題采用RT-PCR方法比較人胃癌細胞（SGC-7901/ADR）經過不同藥物組治療后的ERCC1 mRNA的表達量，進一步探討各藥物組對人胃癌SGC-7901/ADR細胞的作用機制?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞系

胃癌SGC-7901/ADR細胞，第四軍醫(yī)大贈。

1.2 藥物、試劑及主要儀器

自擬“斑貞1號”每毫升含露蜂房、山茱萸、斑蝥、女貞子各0.2 g。5-FU（規(guī)格：10 mL：0.25 g，國藥準字H31020593，上海旭東海普藥業(yè)有限公司）、TMP（規(guī)格40 mg，國藥準字H20031302，安徽制藥），RPMI1640培養(yǎng)基（RPMI為Roswell Park Memorial Institute縮寫，1640是培養(yǎng)基代號，其中含有10%胎牛血清，美國GIBCO北京有限公司），二甲基亞砜、胰蛋白酶（美國Sigma公司產品），新生小牛血清（杭州四季青公司），兩步法RT-PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司產品），引物片段（上海生物工程公司），PCR擴增儀（Ambion 公司）、電泳儀及紫外分光度計（北京六一公司），Trizol（TakaRa公司），紫外透視成像系統(tǒng)（上海精科實業(yè)有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1細胞處理 取對數(shù)生長期的細胞，以5×104/mL濃度接種于6孔板上，每孔用吸管加入2 mL，然后培養(yǎng)24 h，然后分為五組；對照組、5-FU組、斑貞1號組、斑貞1號+5-FU、斑貞1號+ 5-FU+TMP，分別加入等量的新的培養(yǎng)液，5-FU稀釋液、斑貞1號稀釋液、斑貞1號+5-FU稀釋液、斑貞1號+5-FU+TMP稀釋液。培養(yǎng)48 h后，經過PBS緩沖液沖洗，提取總mRNA。

1.3.2 RT-PCR 提取細胞中的總RNA：以mRNA為模板，采用Oligo隨機引物，利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。然后再以cDNA作為模板PCR擴增，瓊脂糖電泳并拍照，分析電泳條帶灰度值，檢查基因mRNA轉錄相對量的變化。具體步驟如下：以mRNA為模板經逆轉錄合成cDNA， 每個反應體系25 μL，目的基因引物各0.5 μL，Takara Taq 1 μL，10×PCR Buffer（Mg2+Plus）2.5 μL，dNTP Mixture 2 μL，ddH2O 13.5 μL；各樣品cDNA 5 μL，滅菌蒸餾水13.5 μL。經過預變性→變性→退火→延伸，（PCR擴增條件分別為94℃ 1 min，58℃ 30 s，72℃ 45 s，72℃ 10 min），共30個循環(huán)，最后延伸72℃ 10 min，擴增結束，取10 μL樣品，跑電泳60 min，（經100 V恒壓，2%瓊脂糖）然后采集電泳圖像，得出各電泳帶光密度值，β -action引物正義列為5-GTGGG GCGCAGGCACCA-3，反義列為5-CTCCTTAATACGCACGATTTC-3ERCC1基因引物序列的正義列引5-TCAGACCTTCGCCGTATATGC-3，反義列引物為5-ACATCCACATGGACCAG-CAGG-3。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，進行方差分析及LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 胃癌SGC-7901/ADR細胞ERCC1 mRNA的表達情況

5-FU組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。其他藥物組與對照組相比及組間比較均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

2.2 ERCC1和對照基因β-action的RT-PCR產物經瓊脂糖分離后電泳圖

切除修復交叉互補基因1（ERCC1）和對照基因（β-action）的RT-PCR產物經瓊脂糖分離后分別位于354bp和548bp，見圖1。

A、B、C、D、E 分別代表的是陰性對照組（5-FU組、斑貞1號組、斑貞1號+5-FU組、斑貞1號+5-FU+TMP組）ERCC1的表達，A1、B1、C1、D1、E1分別代表的是陰性對照組（5-FU組、斑貞1號組、斑貞1號+5-FU組、斑貞1號+5-FU+TMP組）β-action的表達

圖1 ERCC1和對照基因β-action的RT-PCR產物經瓊脂糖分離后電泳圖

3 討論

目前我國胃癌發(fā)病率及死亡率位居惡性腫瘤第三位[4]，化療是胃癌治療中其重要作用，但大部分藥物因多藥耐藥（MDR）使化療失敗[5]。

近年研究發(fā)現(xiàn)ERCC1基因與惡性腫瘤的多藥耐藥及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、療效預測及預后相關。此基因在許多腫瘤組織中表達低下，對頭頸部鱗癌的研究發(fā)現(xiàn)，ERCC1水平低表達可能是發(fā)生頭頸部癌的危險因素，在對食管癌和胃食管結合部癌的研究中，發(fā)現(xiàn)ERCC1的表達降低與惡性腫瘤的發(fā)病率增加有關，在胃癌的研究中也得到了相似的結果。在胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)[6]ERCC1的表達水平與化療敏感性密切相關，認為其表達水平對進展期胃癌患者的臨床療效進行有效預測。馬冬等[7]回顧性分析發(fā)現(xiàn)ERCC1 表達與淋巴結轉移相關而與腫瘤大小、浸潤深度無關。而胡鏘、于東風等[8]研究卻發(fā)現(xiàn)此基因表達水平與患者性別、年齡、組織學類型、淋巴結轉移均無相關性。而李紫燕等[9]研究發(fā)現(xiàn)此基因在胃癌組織中表達水平與患者年齡、腫瘤部位、組織學類型、分期及淋巴結轉均無關，而與性別有相關，趙國華、吳杰等[10]發(fā)現(xiàn)ERCC1陰性的胃癌患者采用5-Fu 和奧沙利鉑化療的療效更好。李紅等[11]研究發(fā)現(xiàn)ERCC1 在胃癌組織中的表達與組織學分級及研究中，有無淋巴結轉移無明顯差異，本課題組先前已證實胃癌細胞對5-FU耐藥性，ERCC1（切除修復交叉互補基因）是Westerveld等在1984年發(fā)現(xiàn)的，此基因定位于人類第19號染色體短臂13.2～13.3位點上，大小為15 kb，ERCC1基因擁有四種分子量的mRNA，但只有1.1kb mRNA具有核苷酸切除修復作用。關于腫瘤發(fā)生和發(fā)展的學說認為腫瘤是致癌相關的危險因素暴露造成DNA損傷，再加上DNA修復基因表達低下造成基因損傷不斷地在上皮細胞內累積導致癌基因和抑癌基因突變等一系列連續(xù)事件作用的結果。ERCC1基因表達低下影響細胞對DNA加合物及核苷酸損傷的修復，可導致p53、K-RAS基因突變增加，從而增加惡性腫瘤的發(fā)生率[12]。ERCC1修復了損傷的基因，使基因組保持完好，減少了癌變相關基因的出現(xiàn)，使細胞能保持正常的生物學活性，從而減少癌變的幾率，降低了腫瘤的發(fā)病率[13，14]。

斑貞1號合劑（斑蝥、露蜂房、女貞子、山茱萸），斑蝥能抑制腫瘤細胞DNA和RNA合成，殺傷腫瘤。它對HeLa細胞及人食管、胃、肝、乳腺癌細胞均有抑制作用，能促進造血干細胞分化，加速粒細胞的釋放，很好地對抗了放化療中血細胞下降，減少了不良反應。TMP通過多種途徑對腫瘤起到治療和逆轉多藥耐藥的作用。楊葉等[15]已證實TMP能增加5-FU對胃癌化療的敏感性。本實驗研究發(fā)現(xiàn)斑貞1號、5-FU和TMP三聯(lián)藥物處理組胃癌細胞ERCC1 mRNA 表達量高于其他用藥組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），說明三種藥聯(lián)合可顯著提高ERCC1 mRNA的高表達，增強了治療效果。

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（收稿日期：2016-06-04）